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        膠原三股螺旋重復(fù)蛋白1在HBV肝病中的臨床意義研究

        2016-01-25 08:02:12宋惠,劉興暉,沈振華
        檢驗醫(yī)學(xué) 2015年11期
        關(guān)鍵詞:乙型肝炎病毒肝細胞癌肝纖維化

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        膠原三股螺旋重復(fù)蛋白1在HBV肝病中的臨床意義研究

        原發(fā)性肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是一種高度惡性的腫瘤,全世界每年有25萬人死于此病。流行病學(xué)資料顯示,乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)是導(dǎo)致HCC形成的最主要因素[1],但HBV的致癌機制目前還不清楚。膠原三股螺旋重復(fù)蛋白1(collagen triple helix repeat containing 1, CTHRC1)是2005年發(fā)現(xiàn)的一個新基因,參與血管的形成和腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移,在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中起重要作用[2-5]。我們主要探討了HBV感染對CTHRC1表達的影響,并分析其血清學(xué)水平與疾病進程的關(guān)系,為揭示HBV的致癌機制和疾病的診斷奠定一定的基礎(chǔ)。

        材料和方法

        一、研究對象

        收集臨床確診HBV感染患者369例,其中無癥狀HBV攜帶者92例,男52例,女40例,年齡(45±14)歲;慢性乙型肝炎患者106例,男58例,女48例,年齡(47±15)歲;HBV感染致肝纖維化患者94例,男55例,女39例,年齡(51±14)歲; HBV相關(guān)HCC患者77例,男48例,女29例,年齡(59±18)歲。所有患者均排除心、腦、腎等重要器官疾病及其他嗜肝病毒的感染。正常對照組為126名無HBV感染的健康人,男69名,女57名,年齡(46±20)歲。

        二、材料

        人肝癌細胞系HepG2和HepG2.2.15由武漢大學(xué)典型培養(yǎng)物保藏中心提供;RNA提取試劑TRIzolR購自Invitrogen公司;M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶購自美國Promega公司;熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)引物由上海英俊生物技術(shù)公司合成;熒光定量PCR 試劑盒購自Roche 公司,CTHRC1抗體及其標準品購自美國Santa Cruz公司。

        三、方法

        1. 人肝癌細胞系HepG2和HepG2.2.15的培養(yǎng)HepG2 和HepG2.2.15細胞用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的1640培養(yǎng)基,在37 ℃恒溫箱維持體積分數(shù)為5%的CO2的條件下培養(yǎng)。

        2. 熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測CTHRC1 mRNA采用TRIzolR試劑提取HepG2和HepG2.2.15細胞的總RNA,逆轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)的cDNA后采用LightCycler 480 熒光定量PCR 儀進行擴增,按照Roche 熒光定量試劑盒說明進行操作,所有反應(yīng)均設(shè)3個復(fù)孔。CTHRC1基因的檢測引物為5′-TTCAGTGGCTCACTTCGG-3′(上游引物)和5′-TTCAGGGCTTCCTTGGTC-3′(下游引物);設(shè)β-actin作為內(nèi)參,引物序列為5′-ATCCACGAAACTACATTCAA-3′(上游引物)和5′-TCTTCATGGTGCTGGGAG-3′(下游引物)。

        3. Western blot檢測CHTRC1蛋白收集HepG2和HepG2.2.15細胞,加入細胞裂解液,超聲破碎后離心取上清蛋白。分別取樣本和標準品30 μg加入等體積的上樣緩沖液后進行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecylsulphate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分離,電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)到硝酸纖維素(nitrocellulose,NC)膜上,加入抗CHTRC1蛋白抗體,溫育洗滌后加入二抗,采用電化學(xué)發(fā)光(electrochemiluminescence,ECL) 顯色系統(tǒng)(君意東方JY-Clear ECL)進行顯色。

        4. 血清CTHRC1的檢測血清CTHRC1檢測采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA),其水平采用定量方法進行計算。

        四、統(tǒng)計學(xué)方法

        結(jié)果

        一、HBV上調(diào)CTHRC1 mRNA和蛋白的表達

        HepG2.2.15和HepG2細胞中CTHRC1 mRNA的相對定量分別為0.583±0.082和0.321±0.058,二者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖1。HepG2.2.15細胞CTHRC1蛋白的表達量明顯高于HepG2細胞,見圖2。

        二、HBV患者血清CTHRC1水平

        無癥狀HBV攜帶者CTHRC1水平為(39.7±10.3)ng/mL,HBV感染相關(guān)疾病(慢性乙型肝炎、HBV感染致肝纖維化、HBV相關(guān)HCC)患者為(44.8±13.2)ng/mL,正常對照組為(32.6±8.5)ng/mL,三者之間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖3。

        三、CTHRC1血清水平與疾病進程的關(guān)系

        慢性乙型肝炎患者血清CTHRC1水平為(37.5±9. 3)ng/mL,HBV感染致肝纖維化患者為(43.3±14.2)ng/mL,HBV相關(guān)HCC患者為(51.2±15.8)ng/mL,三者之間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖4。

        注:與HepG2細胞比較,*P<0.05

        圖1熒光定量PCR檢測CTHRC1 mRNA在HepG2.2.15

        及HepG2細胞中的表達

        圖2 Western blot檢測CTHRC1 蛋白在HepG2.2.15

        注:與無癥狀HBV攜帶者比較,*P<0.05

        圖3正常對照組、無癥狀HBV攜帶者及

        HBV感染相關(guān)疾病患者血清CTHRC1水平的比較

        注:與HBV感染致肝纖維化患者比較,*P<0.05

        圖4慢性乙型肝炎患者、HBV感染致肝纖維化患者及

        HBV相關(guān)HCC患者CTHRC1血清水平比較

        討論

        研究表明,全世界累計有3.5億人感染了慢性乙型肝炎,其中近25%最后發(fā)展成為HCC,慢性乙型肝炎患者HCC發(fā)病的危險性要比普通人群高出200倍[1],我國肝癌患者80%以上有HBV感染史。

        CTHRC1是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新型分泌型糖蛋白,含有4個外顯子和4個內(nèi)含子,編碼243個氨基酸,相對分子質(zhì)量為15 000~30 000。研究表明,CTHRC1參與機體骨的生長修復(fù)及血管內(nèi)膜的損傷修復(fù),調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor beta,TGF-β)的信號發(fā)生[6]。CTHRC1在很多實體腫瘤中異常高表達,如胃腸癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、甲狀腺癌、卵巢癌和胰腺癌等,并且與肝癌的預(yù)后相關(guān)[3,7-9]。本研究分別在mRNA水平和蛋白水平探討了HBV感染對CTHRC1表達的影響。

        HepG2.2.15細胞整合了HBV全基因組,是HBV慢性感染重要的細胞模型。本研究檢測了HepG2.2.15和HepG2細胞中CTHRC1的表達情況,結(jié)果顯示HBV能夠在HepG2細胞上調(diào)CTHRC1 mRNA和蛋白水平表達;無癥狀HBV攜帶者血清CTHRC1水平明顯高于正常對照組,表明HBV感染能夠上調(diào)CTHRC1的表達。

        HBV感染表現(xiàn)形式多樣,包括無癥狀攜帶、急性肝炎、慢性肝炎、肝纖維化和肝癌。本研究分析了慢性乙型肝炎患者、HBV感染致肝纖維化患者和HBV相關(guān)HCC患者的血清CHTRC1水平。結(jié)果顯示HBV相關(guān)HCC患者血清CHTRC1水平最高,其次為HBV感染致肝纖維化患者,慢性乙型肝炎患者最低。由此可見,隨著乙型肝炎疾病進程的發(fā)展,血清CHTRC1水平不斷升高。因此,可以考慮將CHTRC1作為HBV相關(guān)疾病診斷的輔助指標之一。

        研究表明,CTHRC1能夠提高癌細胞的增殖和遷移能力,抑制Ⅰ型膠原的合成,并通過限制膠原基質(zhì)沉積和促進細胞遷移參與血管的損傷修復(fù)和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程[5,10]。本研究發(fā)現(xiàn)HBV能夠在細胞水平上調(diào)CTHRC1的表達,并且與疾病進程相關(guān)。因此HBV可能通過上調(diào)CTHRC1的表達來促進HCC的發(fā)生。但HBV調(diào)節(jié)CHTRC1表達的具體機制尚待進一步探討。

        參考文獻

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        [5]PARK EH, KIM S, JO JY, et al. Collagen triple helix repeat containing-1 promotes pancreatic cancer progression by regulating migration and adhesion of tumor cells [J]. Carcinogenesis, 2013, 34(3): 694-702.

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        (本文編輯:姜敏)

        宋惠, 劉興暉,沈振華,陳慶,徐鳳霞,徐莉敏

        (上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院檢驗科,上海200135)

        摘要:目的探討乙型肝炎病毒(HBV) 對膠原三股螺旋重復(fù)蛋白1(CTHRC1)表達的影響及其臨床意義。方法分別采用實時逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和Western blot 檢測人肝癌細胞系HepG2和HepG2.2.15中CTHRC1 mRNA和蛋白水平,采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測 CTHRC1血清學(xué)水平,分析非HBV感染的健康人(正常對照組)、無癥狀HBV攜帶者、慢性乙型肝炎患者、HBV感染致肝纖維化患者和HBV相關(guān)肝細胞癌(HCC)患者中CTHRC1血清學(xué)水平的差異。結(jié)果HepG2.2.15細胞中CTHRC1 mRNA的表達水平明顯高于HepG2細胞;無癥狀HBV攜帶者CTHRC1血清學(xué)水平明顯高于正常對照組(P < 0.05);HBV相關(guān)HCC患者CTHRC1血清學(xué)水平明顯高于HBV感染致肝纖維化患者和慢性乙型肝炎患者(P < 0.05)。結(jié)論HBV能夠上調(diào)CTHRC1的表達,其血清學(xué)水平與HBV疾病進程相關(guān)。

        關(guān)鍵詞:;膠原三股螺旋重復(fù)蛋白1;乙型肝炎病毒;肝纖維化;肝細胞癌

        Research on the clinical significance of CTHRC1 for HBVSONGHui,LIUXinghui,SHENZhenhua,CHENQing,XUFengxia,XULimin. (DepartmentofClinicalLaboratory,GongliHospital,Shanghai200135,China)

        Abstract:ObjectiveTo investigate the influence of hepatitis B virus(HBV) on the expression of collagen triple helix repeat containing 1(CTHRC1) and its clinical significance. MethodsThe mRNA and protein levels of CTHRC1 in HepG2 and HepG2.2.15 cells were determined by real-time reverse transcription polymerase chain reaction (PCR). Serum CTHRC1 levels were measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), and the differences of serum CTHRC1 levels among healthy subjects without HBV infection(control group), asymptomatic HBV carriers, patients with chronic hepatitis B, patients with hepatic fibrosis induced by HBV infection and patients with HBV-related hepatocellular carcinoma (HCC) were analyzed. ResultsThe expression of CTHRC1 mRNA was higher in HepG2.2.15 cells than in HepG2 cells, serum CTHRC1 levels were much higher in asymptomatic HBV carriers than in control group (P < 0.05), and CTHRC1 was detected at higher levels in patients with HBV-related group HCC than in those with hepatic fibrosis induced by HBV infection and chronic hepatitis B (P < 0.05). ConclusionsHBV can upregulate the expression of CTHRC1, which is associated with the progression of HBV infection.

        Key words:Collagen triple helix repeat containing 1; Hepatitis B virus; Hepatic fibrosis; Hepatocellular carcinoma

        收稿日期:(2015-01-05)

        通訊作者:劉興暉,聯(lián)系電話:021-58858730。

        作者簡介:宋惠,女1976年生,學(xué)士,主管技師,主要從事細胞病理學(xué)工作。

        基金項目:湖北省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項目(D20122404);上海市衛(wèi)生和計劃生育委員會科研課題項目(201440459);浦東新區(qū)衛(wèi)生系統(tǒng)重點學(xué)科建設(shè)資助項目(PWZx2014-03)

        中圖分類號:

        文章編號:1673-8640(2015)11-1104-03R446.62

        文獻標志碼:ADOI:10.3969/j.issn.1673-8640.2015.11.011

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