李　卿，　劉文彬，　金中淦，　唐麗萍，　王美娟，　歐元祝，　虞嘯炫，　居　漪

(上海市臨床檢驗中心生化室，上海 200126)

毛細(xì)管電泳法檢測糖化血紅蛋白的分析性能評估

李卿，劉文彬，金中淦，唐麗萍，王美娟，歐元祝，虞嘯炫，居漪

(上海市臨床檢驗中心生化室，上海 200126)

摘要：目的評估毛細(xì)管電泳(CE)法檢測糖化血紅蛋白(HbA1c)的精密度、正確度、線性和抗干擾性，并與高效液相色譜法(HPLC)進行比對。方法根據(jù)不同的評估內(nèi)容，收集相應(yīng)樣本，分別使用SEBIA CAPILLARYSTM2 Flex Piercing毛細(xì)管電泳儀(毛細(xì)管電泳法)、ARKRAY HA-8160全自動HbA1c分析儀(HPLC)和IFCC參考方法檢測HbA1c。采用SPSS 19.0 軟件進行統(tǒng)計描述及線性回歸模型分析。結(jié)果毛細(xì)管電泳法檢測HbA1c在常見濃度(4.91%～9.67%)下的不精密度均<2%；與IFCC參考方法，相關(guān)程度較好(R2=0.993)；當(dāng)HbA1c濃度為5.0%～17.6%時，毛細(xì)管電泳法具有良好的線性(R2= 0.995)，對氨甲?；t蛋白、不穩(wěn)定HbA1c、膽紅素、乳糜微粒等具有較好的抗干擾能力(絕對偏倚≤0.5%)。毛細(xì)管電泳法HbA1c的測定值與HPLC具有較好的相關(guān)性(R2=0.993)。 結(jié)論毛細(xì)管電泳法的精密度、正確度、線性和抗干擾性等分析性能均符合臨床實驗室常規(guī)檢測HbA1c的要求。

關(guān)鍵詞：糖化血紅蛋白；毛細(xì)管電泳法；高效液相色譜

中圖分類號：

文章編號：1673-8640(2015)02-0181-04R446.1

文獻標(biāo)志碼：碼：A

DOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.02.019

Abstract:ObjectiveTo evaluate the precision， accuracy， linearity and anti-interference ability of capillary electrophoresis (CE) for the determination of hemoglobin A1c(HbA1c)，and compare it with high performance liquid chromatography (HPLC). MethodsSamples were collected according to each evaluation protocol. Samples were determined by SEBIA CAPILLARYSTM2 Flex Piercing HbA1canalyzer (CE method)， ARKRAY HA-8160 automatic HbA1canalyzer (HPLC) and IFCC reference method. Statistical analysis and linear regression analysis were performed by SPSS 19.0. ResultsThe impression at common HbA1clevels (4.91%-9.67%) was <2%. The CE method and IFCC reference method showed good correlation (R2=0.993). The linearity was good (R2= 0.995) from HbA1c5.0% to 17.6%. The results were not significantly influenced by carbamylated hemoglobin， labile HbA1c， bilirubin， chylomicron and so on (absolute bias ≤0.5%). SEBIA and HA-8160 showed good correlation (R2=0.993). ConclusionsThe precision， accuracy， linearity and anti-interference ability of SEBIA can meet the requirement of routine HbA1cdetermination in clinical laboratories.

作者簡介：李卿，男，1981年生，碩士，主管技師，主要從事臨床生化檢驗標(biāo)準(zhǔn)化工作。

通訊作者：居漪，聯(lián)系電話：021-68316300-1204。

收稿日期：(2014-05-29)

Evaluation on the analytical performance of capillary electrophoresis for the determination of HbA1cLIQing，LIUWenbin，JINZhonggan，TANGLiping,WANGMeijuan,OUYuanzhu,YUXiaoxuan,JUYi.(DepartmentofClinicalChemistry，ShanghaiCenterforClinicalLaboratory，Shanghai200126，China)

Key words: Hemoglobin A1c; Capillary electrophoresis; High performance liquid chromatography

糖化血紅蛋白(hemoglobin A1c, HbA1c)可以反映血糖的長期控制情況，與1型和2型糖尿病并發(fā)癥風(fēng)險高度相關(guān)。因此，多個國家和國際組織建議用于糖尿病的診斷和監(jiān)測[1-3]。HbA1c的臨床價值依賴于其檢測結(jié)果的可靠性，其中常規(guī)檢測方法的分析性能是臨床實驗室需要重點關(guān)注的。近期，一種新型的、面向常規(guī)檢測的毛細(xì)管電泳(capillary electrophoresis, CE)法問世，其檢測原理是利用不同血紅蛋白組分在堿性緩沖液及高電壓環(huán)境中，在電滲流和電場力的作用下的泳動速率不同而完成分離，其分辨率高于傳統(tǒng)的離子交換色譜法和瓊脂糖電泳。國內(nèi)的臨床實驗室已開始應(yīng)用，但缺少對其分析性能的評估。為此，我們對CE法的分析性能進行了評估。

材料和方法

一、材料

1.對象樣本為用EDTA真空管采集的全血。采樣后4 ℃保存(≤5 d)。如果需要保存更久，則將樣本分裝保存于-80 ℃，可在4 ℃條件下凍融，24 h內(nèi)完成檢測。

2.儀器和試劑AEBIA CAPILLARYSTM2 Flex Piercing毛細(xì)管電泳儀(CE法)及配套試劑[溶血清(批號28083/01)、緩沖液(批號21112/01)]、CAPILLARYS HbA1c標(biāo)準(zhǔn)品、CAPILLARYS HbA1c質(zhì)控品均由法國賽比亞公司提供。ARKRAY HA-8160全自動HbA1c分析儀[高效液相色譜法(high performance liquid chromatography, HPLC)；日本愛科來株式會社]。安捷倫1200型HPLC儀(美國安捷倫公司)。P/ACE MDQ毛細(xì)管電泳儀(美國貝克曼庫爾特公司)。

二、性能分析

2.比對試驗隨機收集208份全血樣本，分別使用評價方法(CE)和對照方法(HPLC)檢測HbA1c。共檢測13批，每批檢測2次，每次檢測16個樣本。計算相關(guān)系數(shù)(r)、斜率(b)、截距。評價標(biāo)準(zhǔn)：決定系數(shù)(R2)≥0.95，b為0.95～1.05。

3.線性范圍收集高(H)、低(L)濃度HbA1c全血樣本，按一定比例進行混合。將檢測結(jié)果與理論值進行比較，計算各稀釋度的相對偏倚和相關(guān)性。評價標(biāo)準(zhǔn)：相對偏倚≤8%，R2≥0.95。

4.干擾試驗收集高、中、低3個HbA1c濃度(L1~L3)的全血樣本，進行如下預(yù)處理。(1)氨甲?；t蛋白干擾：配置氰酸鉀溶液濃度為0、0.15、0.5和1.0 mmol/L，將樣本與氰酸鉀溶液混合后37 ℃孵育3 h；(2)不穩(wěn)定HbA1c干擾：配置濃度為 0、1、5、10和50 g/L的葡萄糖溶液，將樣本與不同濃度葡萄糖溶液混合后37 ℃孵育1 h；(3)膽紅素干擾：將不同濃度(0.0、32.8、65.6、98.4、131.2、164.0、196.8、229.6、262.4、295.2、328.0 μmol/L)膽紅素干擾物質(zhì)按一定比例與樣本混合；(4)乳糜微粒干擾：將不同濃度(0、150、300、450、600、750、900、1 050、1 200、1 350 、1 500 FTU)乳糜微粒按一定比例與樣本混合；(5)總血紅蛋白干擾：收集高、中、低3個HbA1c濃度(L1~L3)且血紅蛋白濃度為120 g/L的全血樣本，將樣本血紅蛋白濃度分別稀釋/濃縮為40、80、120和180 g/L；(6)血紅蛋白F(HbF)干擾：使用新鮮臍帶血與樣本按一定比例混合，配制成HbF濃度大約為5%、10%、15%的樣本。預(yù)處理完成后，分別采用CE法檢測，每個處理組檢測2次。統(tǒng)計處理前樣本的檢測結(jié)果均值與處理后樣本的檢測結(jié)果均值，計算兩者之間的絕對偏倚(絕對偏倚=處理后結(jié)果均值-處理前結(jié)果均值)。評價標(biāo)準(zhǔn)：|絕對偏倚|≤0.5%。

5.與國際臨床化學(xué)與檢驗醫(yī)學(xué)聯(lián)合會(Internation Federation of Clinical Chemistry and Laboratong medicine, IFCC)參考方法[4]的相關(guān)性分析收集15個臨床樣本，濃度范圍為5.2%～11.3%。使用生理鹽水洗滌紅細(xì)胞3次，向紅細(xì)胞濃縮液中加入蛋白內(nèi)切酶酶解，酶解產(chǎn)物經(jīng)HPLC收集HbA1c和HbA0的混合物。使用P/ACE MDQ毛細(xì)管電泳儀對HbA1c/HbA0進行分離并積分定量計算。取重復(fù)測定結(jié)果的平均值。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。采用Pearson法分析兩種方法的相關(guān)性，以Bland-Altman評價兩種方法的一致性。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

一、總精密度

4個樣本的HbA1c濃度范圍為4.91%～9.67%，CV均<2%。見表1。

表1　總精密度　(%)

二、比對試驗

CE法與HPLC具有較好的相關(guān)性(R2=0.993)，見圖1(a)。以兩種方法的差值為縱坐標(biāo)、均值為橫坐標(biāo)繪制Bland-Altman圖，差值的95%可信區(qū)間為(-0.38%，0.27%)。CE法檢測值與HPLC檢測值的差值表現(xiàn)出一定程度的濃度依賴現(xiàn)象，即隨著HbA1c濃度的升高，CE法檢測值逐漸低于HPLC，見圖1(b)。

三、線性范圍

在HbA1c為5.0%～17.6%的范圍內(nèi)，直線回歸分析的擬合度很好(R2=0.995，高于R2=0.95的判定限)。見圖2。直線回歸方程為Y=0.972X+0.167，其中Y是同一樣本多次檢測均值，X是預(yù)測值。實測值與理論值相對偏倚的范圍為0.16%～5.71%，低于預(yù)定值(8%)。

圖1CE法與HPLC的比對結(jié)果

圖2　HbA1c理論值和實測值的散點圖

四、干擾因素

在整個HbA1c濃度范圍(4.6%~8.7%)內(nèi)，氨甲?；t蛋白、不穩(wěn)定HbA1c、膽紅素、乳糜微粒、不同濃度的總血紅蛋白和HbF對CE法檢測HbA1c有一定影響，但未觀察到濃度依賴現(xiàn)象，見表2。所有干擾因素均造成檢測結(jié)果出現(xiàn)一定程度的升高(0.05%～0.32%)。干擾最強的是HbF (α2γ2)，最弱的是乳糜微粒。

五、CE法與IFCC參考方法的相關(guān)性分析

CE法與IFCC參考方法的相關(guān)性較好(R2=0.993)。

表2　不同干擾因素引起HbA1c檢測結(jié)果的絕對偏倚　(%)

注：括號內(nèi)數(shù)字為絕對偏倚的范圍

討論

HbA1c作為重要的糖尿病標(biāo)志物之一，已用于調(diào)整糖尿病治療方案及預(yù)測并發(fā)癥的情況。HbA1c的常規(guī)檢測方法有兩大類：一類是基于其結(jié)構(gòu)特點，如親和層析法、免疫法、酶法等等；另一類是基于其電荷特點，如離子交換法、電泳法。臨床實驗室中最常見的是HPLC(包括親和層析法和離子交換法)和免疫法。CE法根據(jù)糖化血紅蛋白與非糖化血紅蛋白所帶電荷的不同進行分離，一直作為IFCC發(fā)布的一級參考方法，從未在臨床實驗室中應(yīng)用。最近法國賽比亞公司研發(fā)了SEBIA CAPILLARYSTM2 Flex Piercing CE檢測儀，使常規(guī)實驗室能使用CE法檢測HbA1c。本研究結(jié)果顯示其總精密度較好，CV為0.77%～1.62%。

HPLC是目前臨床使用最廣泛的檢測HbA1c的方法，其測定結(jié)果直接用于臨床醫(yī)生評估患者血糖的長期控制情況。臨床研究如美國糖尿病控制與并發(fā)癥研究(Diabetes Control and Complications Trial, DCCT)和英國糖尿病前瞻性研究(The UK Prospective Diabetes Study, UKPDS)明確了HPLC法與糖尿病并發(fā)癥的關(guān)系。本研究結(jié)果顯示CE法與HPLC具有較好的相關(guān)性[R2=0.993，差值的95%可信區(qū)間為(-0.38%，0.27%)]，說明對其檢測結(jié)果的臨床判斷可以參照基于HPLC建立的臨床觀察結(jié)果。但是隨著HbA1c濃度的升高，CE法檢測值逐漸低于HPLC。在HbA1c濃度為4.6%~8.7%的范圍內(nèi)，被調(diào)查的干擾因素會造成檢測結(jié)果出現(xiàn)一定程度的升高，這與WEYKAMP等[5]的評估結(jié)果一致。其中干擾最為明顯的是HbF (α2γ2)，主要原因是其電荷及結(jié)構(gòu)類似于HbA1c；最弱的是乳糜微粒，主要原因是其不帶電。CE法與IFCC參考方法具有較好的相關(guān)性(R2=0.993)。

綜上所述，CE法顯示出了較好的精密度和抗干擾能力，與HPLC和IFCC參考方法的相關(guān)性和一致性較好，適合于臨床實驗室檢測HbA1c。

參考文獻

[1]SACKS DB， ARNOLD M， BAKRIS GL， et al. Guidelines and recommendations for laboratory analysis in the diagnosis and management of diabetes mellitus[J]. Diabetes Care，2011, 34 (6): e61-e99.

[2]JOHN WG, UK Department of Health Advisory Committee or Diabetes. Use of HbA1c in the diagnosis of diabetes mellitus in the UK. The implementation of World Health Organization guidance 2011[J]. Diabet Med，2012, 29 (11): 1350-1357.

[3]American Diabetes Association. Standards of medical care in diabetes--2014[J]. Diabetes Care，2014, 37 (Suppl 1): S14-S80.

[4]JEPPSSON JO， KOBOLD U， BARR J， et al. Approved IFCC reference method for the measurement of HbA1c in human blood[J]. Clin Chem Lab Med, 2002, 40 (1): 78-89.

[5]WEYKAMP C， WAENINK-WIEGGERS HW， KEMNA E， et al. HbA1c: performance of the Sebia Capillarys 2 Flex Piercing[J]. Clin Chem Lab Med，2013, 51 (6): e129-e131.

(本文編輯：龔曉霖)