方　毅，　趙付菊，　趙　虎

華東醫(yī)院感染老年患者多重耐藥和廣泛耐藥革蘭陰性桿菌的耐藥性分析

方毅，趙付菊，趙虎

(復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200040)

摘要：目的了解華東醫(yī)院感染老年患者多重耐藥和廣泛耐藥革蘭陰性桿菌耐藥性及其分布，為指導(dǎo)臨床合理使用抗菌藥物和有效預(yù)防、控制醫(yī)院感染提供依據(jù)。方法收集華東醫(yī)院60歲以上老年患者臨床標(biāo)本(痰液、血液、尿液、膽汁及傷口分泌物等)進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)、鑒定和體外藥物敏感性試驗(yàn)；對(duì)228例多重耐藥和42例廣泛耐藥革蘭陰性桿菌感染的患者資料進(jìn)行回顧性研究，并用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè)8株廣泛耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌的相關(guān)耐藥基因。結(jié)果多重耐藥菌排名前3位的是鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌和大腸埃希菌；廣泛耐藥菌排名前3位的是鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌和洋蔥伯克霍德菌。廣泛耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌檢測(cè)到了TEM、SHV、PER、ant(2″)-Ⅰ、ant(3″)-Ⅰ、ant(6′)-Ⅰb、OXA-23、gyrA和qacEΔ1基因，IMP、VIM和OXA-24基因檢測(cè)為陰性。結(jié)論華東醫(yī)院老年患者醫(yī)院感染的鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌耐藥情況較為嚴(yán)重，呼吸科和重癥監(jiān)護(hù)病房尤其要加強(qiáng)抗菌藥物的合理使用并進(jìn)行細(xì)菌耐藥性的監(jiān)測(cè)等措施，有效預(yù)防、延緩和控制耐藥菌株的產(chǎn)生和播散。

關(guān)鍵詞：耐藥基因；多重耐藥菌；廣泛耐藥菌；革蘭陰性桿菌；醫(yī)院感染；老年

Analysis of drug resistance of multi-drug resistant and extensively-drug resistant Gram negative bacillus from the elder patients with nosocomial infection in Huadong HospitalFANGYi，ZHAOFuju，ZHAOHu

.(DepartmentofClinicalLaboratory，HuadongHospital，F(xiàn)udanUniversity，Shanghai200040，China)

Abstract:Objective To guide the reasonable antibiotic clinical use and provide the reference for effective prevention and nosocomial infection control by understanding the drug resistance and distribution in elder patients infected with multi-drug resistant and extensively-drug resistant Gram negative bacillus in Huadong Hospital. MethodsThe data of 228 elder patients infected with multi-drug resistant bacillus and 42 patients infected with extensively-drug resistant bacillus were studied retrospectively(all the elder patients were over 60 years old). Bacterial culture， identification and drug susceptibility were performed for the specimens from patients(sputum， blood， urine， bile， wounds secretion and so on). The resistant genes of 8 extensively-drug resistant Acinetobacter baumannii were determined by polymerase chain reaction(PCR). ResultsThe rank of the multi-drug resistant bacillus was Acinetobacter baumannii， Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli， as well as the rank of the extensively-drug resistant bacillus was Acinetobacter baumannii， Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia. The TEM， SHV， PER， ant(2″)-Ⅰ， ant(3″)-Ⅰ， ant(6′)-Ⅰb， OXA-23， gyrA and qacEΔ1 genes were detected in the extensively-drug resistant Acinetobacter baumannii. The results of IMP, VIM and OXA-24 genes were negative. ConclusionsSince the severe drug resistance of Acinetobacter baumannii and Pseudomonas aeruginosa from elder patients in Huadong Hospital， especially in the department of respiration and intensive care unit， we should effectively prevent， delay and control the generation and spreading of resistant isolates by strengthening the reasonable antibiotic use as well as monitoring the resistant isolates.

Key words:Drug resistant gene; Multi-drug resistant bacterium； Extensively-drug resistant bacterium； Gram negative bacillus； Nosocomial infection； Elder

近年來(lái)，隨著抗菌藥物的廣泛使用，多重耐藥菌感染率呈全球性上升趨勢(shì)，尤其是廣泛耐藥菌株的出現(xiàn)使抗感染治療面臨無(wú)藥可用的境地，感染性疾病的預(yù)防和控制愈加困難[1]。不同時(shí)期、不同地區(qū)及不同醫(yī)院間細(xì)菌耐藥性存在明顯差異[2]，因此細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)對(duì)抗菌藥物的合理使用及有效感染控制措施的實(shí)施尤為重要。為了解華東醫(yī)院老年患者醫(yī)院感染的多重耐藥和廣泛耐藥菌株的分布及耐藥特點(diǎn)，我們檢測(cè)并分析了華東醫(yī)院2010年9月至2012年9月228株多重耐藥菌和42株廣泛耐藥菌株。

材料和方法

一、 菌株來(lái)源

收集華東醫(yī)院2010年9月至2012年9月檢驗(yàn)科細(xì)菌室從各病區(qū)醫(yī)院感染[3]的老年患者(年齡>60歲)痰液、血液、尿液、膽汁及傷口分泌物等標(biāo)本中分離的多重耐藥菌株228例和廣泛耐藥菌株42例，剔除同一患者同一部位重復(fù)分離的菌株。質(zhì)控菌株：銅綠假單胞菌(ATCC 27853)、大腸埃希菌(ATCC 25922)、大腸埃希菌(ATCC 35218)，由上海市臨床檢驗(yàn)中心提供。

二、 主要儀器和試劑

VITEK(JR型)全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)及其配套的鑒定卡和藥物敏感性分析卡(法國(guó)生物梅里埃公司)。中國(guó)蘭瓊脂平板、血瓊脂平板、巧克力瓊脂平板、雙糖鐵瓊脂(科瑪嘉公司)，含樹(shù)脂需氧血培養(yǎng)瓶(BD公司)，中和抗菌藥物需氧血培養(yǎng)瓶(法國(guó)生物梅里埃公司)。實(shí)驗(yàn)用的板條包括陰性桿菌鑒定卡(GNI+)和陰性桿菌藥物敏感性卡(GNS-448)。GNS-448包括阿米卡星、氨芐西林、頭孢唑啉、頭孢肶肟、頭孢哌酮-舒巴坦、頭孢噻肟、頭孢西丁、頭孢他啶、頭孢呋辛、慶大霉素、亞胺培南、左氧氟沙星、美羅培南和哌拉西林-他唑巴坦。

三、菌株的鑒定與藥物敏感性分析

用VITEK全自動(dòng)細(xì)菌分析儀進(jìn)行細(xì)菌的鑒定和體外藥物敏感性試驗(yàn)，按操作指南進(jìn)行。根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute， CLSI)的抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)操作方法和判斷標(biāo)準(zhǔn)對(duì)藥物敏感性試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)[4]。

四、廣泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥基因檢測(cè)

1.細(xì)菌DNA提取按照北京天根生化科技有限公司的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行細(xì)菌DNA提取。

2.引物設(shè)計(jì)參考有關(guān)文獻(xiàn)[5]，基因?qū)?yīng)的引物序列見(jiàn)表1，引物合成由上海桑尼生物科技有限公司完成。

表1　各基因?qū)?yīng)的引物序列

3. 基因檢測(cè)按照試劑盒操作進(jìn)行擴(kuò)增，不同引物設(shè)立不同的聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)條件，用1%的瓊脂糖凝膠100 V電泳50 min，經(jīng)凝膠成像儀觀察結(jié)果。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用WHONET 5.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

結(jié)果

一、 耐藥菌株的細(xì)菌構(gòu)成比

228株多重耐藥的革蘭陰性桿菌中，鮑曼不動(dòng)桿菌占34.2%(78/228)、銅綠假單胞菌占31.6%(72/228)、大腸埃希菌占14.0%(32/228)、嗜麥芽窄食單胞菌占7.0%(16/228)、肺炎克雷伯菌占3.1(7/228)、洋蔥伯克霍德菌占2.6%(6/228)、其他菌株占7.5%(17/228)。42株廣泛耐藥菌株中，鮑曼不動(dòng)桿菌占71.43%(30/42)、銅綠假單胞菌占23.81%(10/42)、洋蔥伯克霍德菌和嗜麥芽窄食單胞菌均占2.38%(1/42)。

二、菌株標(biāo)本來(lái)源及科室分布

多重耐藥菌株主要分離自痰液，占72.37%(165/228)；其次為尿液，占15.79%(36/228)；而后是血液，占3.07%(7/228)；主要分布在呼吸科病房[25.44%(58/228)]、綜合病房[27.20%(62/228)]及重癥監(jiān)護(hù)病房[17.11%(39/228)]。廣泛耐藥菌株主要分離自痰液，占90.48%(38/42)；其次為尿液，占4.76%(2/42)，血液和引流液均占2.38%(1/42)；主要分布在呼吸科病房[50.00%(21/42)]、重癥監(jiān)護(hù)病房[19.05%(8/42)]及綜合病房[16.67%(7/42)]。

三、 8株廣泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥基因檢測(cè)

β-內(nèi)酰胺酶基因中，8株廣泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌有5株TEM基因和SHV基因檢測(cè)陽(yáng)性，有6株攜帶OXA-23基因，還有3株攜帶PER基因，均未發(fā)現(xiàn)IMP、VIM和OXA-24基因。氨基糖苷類修飾酶基因中，8株ant(6′)-Ⅰb基因均陽(yáng)性，6株ant(3″)-Ⅰ基因陽(yáng)性，4株攜帶ant(2″)-Ⅰ基因。喹諾酮類基因中，8株gyrA基因均陽(yáng)性。外排泵基因中，8株qacEΔ1基因均陽(yáng)性。見(jiàn)表2。

表2　8株廣泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥基因檢測(cè)結(jié)果

討論

細(xì)菌耐藥已經(jīng)成為全球最嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題，多重耐藥甚至廣泛耐藥菌株的不斷出現(xiàn)不僅增加了臨床抗感染治療的難度，也增加了患者的醫(yī)療費(fèi)用，加重了社會(huì)和家庭的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[6-7]。多重耐藥菌是對(duì)3種或3種以上的抗菌藥物(如頭孢類、氨基糖苷類和碳青霉烯類等)耐藥的細(xì)菌[8]；泛耐藥菌是指對(duì)包括多黏菌素和替加環(huán)素在內(nèi)所有測(cè)試的抗菌藥物全部耐藥的細(xì)菌[9]；廣泛耐藥菌是對(duì)除多黏菌素和替加環(huán)素以外測(cè)試的抗菌藥物全部耐藥的細(xì)菌[10]。本研究主要是針對(duì)華東醫(yī)院廣泛耐藥菌感染患者進(jìn)行的耐藥性分析。

華東醫(yī)院為上海市老年醫(yī)學(xué)中心，以老年醫(yī)學(xué)為特色，老年患者居多。老年患者原發(fā)性疾病多，住院時(shí)間長(zhǎng)，機(jī)體抵抗力差，易患醫(yī)院感染，而且醫(yī)院感染的病原菌種類與普通綜合性醫(yī)院有所差異，如2012年上海地區(qū)的耐藥性監(jiān)測(cè)網(wǎng)顯示，由廣泛耐藥菌引起的醫(yī)院感染，綜合性三級(jí)甲等醫(yī)院的病原菌主要是鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌和肺炎克雷伯菌，而華東醫(yī)院主要是鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌，廣泛耐藥的肺炎克雷伯菌目前還不多見(jiàn)[11]。故本研究重點(diǎn)分析華東醫(yī)院老年患者醫(yī)院感染多重耐藥和廣泛耐藥菌的特征，為老年患者醫(yī)院感染的預(yù)防和治療提供參考依據(jù)。

華東醫(yī)院老年患者醫(yī)院感染位于前3位的多重耐藥菌是鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌和大腸埃希菌，與陳萍等[12]報(bào)道的住院患者感染多重耐藥菌依次為大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌和鮑曼不動(dòng)桿菌有所不同，其原因可能與華東醫(yī)院主要以老年人群為主有關(guān)，患者基礎(chǔ)疾病較多，免疫力低下，住院時(shí)間較長(zhǎng)，使用侵入性治療手段較多。排名前2位的廣泛耐藥菌是鮑曼不動(dòng)桿菌和銅綠假單胞菌，與上海地區(qū)及全國(guó)的耐藥監(jiān)測(cè)結(jié)果一致[13-14]。多重耐藥和廣泛耐藥的菌株主要來(lái)自痰液、尿液和血液，和文獻(xiàn)報(bào)道相仿[15]，提示耐藥菌株主要引起呼吸系統(tǒng)感染性疾病，結(jié)合菌株主要分布在呼吸科、重癥監(jiān)護(hù)病房及綜合病房，建議臨床治療這3個(gè)病區(qū)醫(yī)院感染患者應(yīng)慎重選擇抗菌藥物，相應(yīng)病區(qū)的醫(yī)護(hù)人員應(yīng)加強(qiáng)環(huán)境設(shè)備的清潔和消毒，適時(shí)采取隔離，尤其是廣泛耐藥菌株所在病區(qū)更應(yīng)引起高度重視，盡量專人護(hù)理，儀器專人專用，預(yù)防和控制耐藥菌株的傳播和流行。

鮑曼不動(dòng)桿菌是醫(yī)院感染中最常見(jiàn)的病原菌之一，獲得耐藥性和克隆傳播的能力強(qiáng)，被視為我國(guó)最重要的“超級(jí)細(xì)菌”[15]，它可引起多種醫(yī)院感染，包括呼吸道感染、敗血癥、腦膜炎、尿路感染和腹腔感染等。本研究對(duì)8株廣泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)這8株菌均攜帶了氨基糖苷類修飾酶基因ant(6′)-Ⅰb、喹諾酮類基因gyrA和外排泵基因qacEΔ1。β-內(nèi)酰胺酶基因中，分別檢測(cè)到了TEM、SHV、OXA-23和PER基因，未檢測(cè)到IMP、VIM和OXA-24基因，可能與被檢菌株較少有關(guān)。

本研究結(jié)果表明，華東醫(yī)院老年患者感染耐藥菌株的發(fā)生率高，且耐藥菌株可在患者體內(nèi)定植，更易引起耐藥菌株的傳播和流行，因此華東醫(yī)院的醫(yī)院感染控制科、細(xì)菌室及其相關(guān)臨床科室應(yīng)該互相配合，采取相應(yīng)的措施，包括對(duì)多重耐藥菌和廣泛耐藥菌的感染進(jìn)行監(jiān)測(cè)，對(duì)于已經(jīng)感染此兩類菌的患者進(jìn)行隔離并加強(qiáng)所在病區(qū)的環(huán)境清潔和消毒，防止感染范圍的擴(kuò)大；嚴(yán)格手衛(wèi)生，防止交叉感染；嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作和感染控制規(guī)范，合理使用抗菌藥物，最大程度地避免此兩類菌引起的醫(yī)院感染的暴發(fā)和流行，減少危重患者的死亡率，預(yù)防和控制嚴(yán)重感染和反復(fù)感染的發(fā)生。

參考文獻(xiàn)

[1]FALAGAS ME， RAFAILIDIS PI， MATTHAIOU DK， et al. Pandrug-resistantKlebsiellapneumoniae，PseudomonasaeruginosaandAcinetobacterbaumanniiinfections: characteristics and outcome in a series of 28 patients[J].Int J Antimicrob Agents，2008，32(5):450-454.

[2]晏群，李軍，李虹玲，等.2011年湘雅醫(yī)院臨床分離病原菌分布及耐藥性分析[J].中國(guó)病原生物學(xué)雜志，2012，25(7):539-543.

[3]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部. 醫(yī)院感染診斷標(biāo)準(zhǔn)(試行)[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2001，81(5):314-320.

[4]Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; twenty-second informational supplement[S]. M100-S22， CLSI， 2012.

[5]馬全玲，李婉琛，曹陽(yáng)，等.泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌相關(guān)耐藥基因檢測(cè)及親緣性分析[J].國(guó)際流行病學(xué)傳染病學(xué)雜志，2012，39(6):373-377.

[6]KANG CI， SONG JH. Antimicrobial resistance in Asia: current epidemiology and clinical implications[J]. Infect Chemother, 2013，45(1):22-31.

[7]張冀霞，王占偉，王啟，等.替加環(huán)素對(duì)臨床常見(jiàn)多重耐藥菌的體外抗菌活性研究[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2013，36(4):308-312.

[8]WATTAL C， GOEL N， OBEROI JK， et al. Surveillance of multidrug resistant organisms in tertiary care hospital in Delhi， India[J]. J Assoc Physicians India， 2010， 58(Suppl): 32-36.

[9]李春輝. MDR、XDR、PDR多重耐藥菌暫行標(biāo)準(zhǔn)定義——國(guó)際專家建議[J]. 中國(guó)感染控制雜志，2014，13(1):62-64..

[10]陳中舉，孫自鏞，胡志東，等.2012年中國(guó)CHINET腸桿菌屬細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)[J]. 中國(guó)感染與化療雜志，2014，14(5)：387-391.

[11]朱德妹，汪復(fù)，郭燕，等.2012年上海地區(qū)細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)[J]. 中國(guó)感染與化療雜志，2013，13(6)：409-419.

[12]陳萍，劉丁，方清永，等.住院患者多重耐藥菌感染臨床研究[J].中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志，2013，25(8):962-965.

[13]朱德妹，張嬰元，汪復(fù)，等.2010年上海地區(qū)細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)[J].中國(guó)感染與化療雜志2011，11(6):436-445.

[14]朱德妹，汪復(fù)，胡付品，等.2010年中國(guó)CHINET細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)[J].中國(guó)感染與化療雜志，2011，11(5):321-329.

[15]陶勇，徐俊煒，陸俊國(guó).2010～2011年度我院多重耐藥細(xì)菌的分布及耐藥性分析[J].齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，33(21):2956-2959.

[16]陳佰義，何禮賢，胡必杰，等.中國(guó)鮑曼不動(dòng)桿菌感染診治與防控專家共識(shí)[J].中國(guó)醫(yī)藥科學(xué)，2012，2(8):3-8.

(本文編輯：姜敏)

注： 周悅昌與任麗娜對(duì)本研究具有同等貢獻(xiàn)，并列為第一作者。

收稿日期：(2014-06-16)

中圖分類號(hào)：

文章編號(hào)：1673-8640(2015)05-0474-04R446.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.05.016

通訊作者：趙虎，聯(lián)系電話：021-62483180-20847。

作者簡(jiǎn)介：方毅，男，1973年生，學(xué)士，副主任技師，主要從事臨床微生物檢驗(yàn)工作。

基金項(xiàng)目：華東醫(yī)院院級(jí)課題資助項(xiàng)目(H-646)