孫賀偉，　劉海明，　李水軍，　余　琛，　朱建民

[1. 上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200444；

2. 上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院(中國(guó)科學(xué)院上海臨床研究中心)中心實(shí)驗(yàn)室，上海 200031]

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定地高辛及其室間質(zhì)量評(píng)價(jià)

孫賀偉1，劉海明2，李水軍2，余琛2，朱建民2

[1. 上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200444；

2. 上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院(中國(guó)科學(xué)院上海臨床研究中心)中心實(shí)驗(yàn)室，上海 200031]

摘要：目的建立液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)檢測(cè)血清地高辛的方法，用于臨床開(kāi)展地高辛治療藥物監(jiān)測(cè)(TDM)。方法采用同位素稀釋LC-MS/MS測(cè)定血清地高辛濃度并進(jìn)行方法學(xué)評(píng)價(jià)。樣品采用特丁基甲醚提取，反相色譜分離，正離子電噴霧質(zhì)譜儀檢測(cè)。分析參加衛(wèi)生部臨檢中心地高辛TDM室間質(zhì)量評(píng)價(jià)(EQA)的結(jié)果，并與電化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行初步比較。結(jié)果LC-MS/MS的線性范圍為0.05～5.00 ng/mL，精密度為1.0%～4.3%，準(zhǔn)確度為101.3%～108.9%，回收率為95.8%～97.5%，基質(zhì)效應(yīng)為95.7%～97.6%。單份樣品的分析檢測(cè)時(shí)間為 3 min。血清樣品反復(fù)凍融3次、放置室溫24 h、處理后放置自動(dòng)進(jìn)樣器36 h的穩(wěn)定性良好。EQA樣品的LC-MS/MS測(cè)定結(jié)果與靶值的偏差為-4.09%，線性方程為YLC-MS/MS=1.01XEQA靶值-0.09，r=0.99。電化學(xué)發(fā)光法測(cè)定結(jié)果比LC-MS/MS平均高36.9%。結(jié)論LC-MS/MS測(cè)定血清地高辛簡(jiǎn)便、特異。測(cè)定結(jié)果符合全國(guó)室間質(zhì)量評(píng)價(jià)要求，但與電化學(xué)發(fā)光法存在較大的差異。

關(guān)鍵詞：地高辛；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；室間質(zhì)量評(píng)價(jià)；電化學(xué)發(fā)光法

Liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the determination of serum digoxin and its external quality assessmentSUNHewei1，LIUHaiming2，LIShuijun2，YUChen2，ZHUJianmin2

.[1.BiologicalCollege，ShanghaiUniversity，Shanghai200444，China; 2.CentralLaboratory，ShanghaiXuhuiCentralHospital(ShanghaiClinicalResearchCenter，ChineseAcademyofSciences)，Shanghai200031，China]

Abstract：ObjectiveTo establish a liquid chromatography-tandem mass spectrometry(LC-MS/MS)for therapeutic drug monitoring(TDM)of serum digoxin. MethodsAn isotope dilution LC-MS/MS was realized by tert-butyl methyl ether extraction， reversed-phase separation and positive electrospray ionization mass spectrometry detection. The results of external quality assessment(EQA)of digoxin TDM program of the National Center for Clinical Laboratory by LC-MS/MS were analyzed and compared with those of electrochemiluminescence immunoassay. ResultsThe linear range was 0.05-5.00 ng/mL. The precision was 1.0%-4.3%, and the accuracy was 101.3%-108.9%. The recovery rate was 95.8%-97.5%, and the matrix effect was 95.7%-97.6%. The total run time was 3 min per injection. Good stability was observed on serum undergoing 3 cycles of frozen-thaw， at room temperature for 24 h and pretreating serum placed in autosampler for 36 h. The average bias was -4.09% between LC-MS/MS and the target value of EQA with a correlation formula of YLC-MS/MS=1.01Xtarget value-0.09， r=0.99. Electrochemiluminescence immunoassay results were 36.9% higher on average than those of LC-MS/MS. ConclusionsLC-MS/MS is simple and specific for the determination of serum digoxin. The results reported by LC-MS/MS are comparable with the national external quality assessment proficiency test. There is significant difference in digoxin results between LC-MS/MS and electrochemiluminescence immunoassay.

Key words：Digoxin; Liquid chromatography-tandem mass spectrometry; External quality assessment; Electrochemiluminescence immunoassay

地高辛是臨床抗心力衰竭的常用藥物，但其毒副作用大，安全范圍窄，藥物代謝動(dòng)力學(xué)、藥物效應(yīng)動(dòng)力學(xué)個(gè)體差異大，且治療劑量與中毒劑量相互重疊，易發(fā)生中毒反應(yīng)[1-2]。因此地高辛的血藥濃度監(jiān)測(cè)對(duì)臨床具有重要意義[3]。目前臨床上地高辛血藥濃度檢測(cè)多采用基于抗體抗原相結(jié)合的免疫學(xué)方法，包括化學(xué)發(fā)光免疫法[4]、放射免疫法[5]、均相免疫法[6]、干化學(xué)法[7]等。有研究顯示內(nèi)源性地高辛免疫活性類(lèi)物質(zhì)可與免疫試劑盒中的地高辛抗體結(jié)合，從而干擾地高辛血藥濃度測(cè)定[8]。一些外源性物質(zhì)如螺內(nèi)酯、卡馬西平代謝物、三環(huán)類(lèi)抗抑郁藥代謝物以及一些中藥如蟾酥、人參、丹參等也能干擾免疫測(cè)定法，影響其結(jié)果的準(zhǔn)確性[8-9]。因此，建立一個(gè)特異性高、抗干擾能力強(qiáng)的地高辛檢測(cè)方法用于臨床常規(guī)治療藥物監(jiān)測(cè)(therapeutic drug monitoring，TDM)十分有必要。

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)將液相色譜的高效分離能力和質(zhì)譜的高特異性檢測(cè)能力進(jìn)行了有機(jī)結(jié)合，在特異性、靈敏度和抗干擾能力方面較其他方法具有明顯優(yōu)勢(shì)，因此在臨床診斷中發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用[10]。在已有研究[11]的基礎(chǔ)上，我們對(duì)LC-MS/MS測(cè)定血清地高辛濃度進(jìn)行了全面的方法學(xué)驗(yàn)證，并分析了連續(xù)多年參加衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心TDM室間質(zhì)量評(píng)價(jià)(externalqualityassessment,EQA)的結(jié)果。

材料和方法

一、儀器與試劑

1. 儀器5500 QTRP串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)Applied Biosystems公司)，液相色譜系統(tǒng)(日本Shimadzu公司)由LC-20AD輸液泵、DGU-20A3在線脫氣儀、SIL-HTc自動(dòng)進(jìn)樣器組成。Vortex-2型渦旋混合器(美國(guó)Scientific Industries公司)，Mikro 22R冷凍高速離心機(jī)(德國(guó)Hettich公司)，GR-150型氮吹儀(Techne公司)。 Centaur電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(Siemens Healthcare Diagnostics公司，用于臨床常規(guī)測(cè)定地高辛)。

2. 試劑地高辛標(biāo)準(zhǔn)品(純度98%)購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；地高辛-d3(同位素豐度98%)購(gòu)自加拿大Toronto Research Chemicals公司；甲酸(液相色譜純)購(gòu)自美國(guó)Tedia公司；乙酸銨(ACS純)、乙腈(液相色譜純)、甲醇(液相色譜純)購(gòu)自德國(guó)Merck KGaA公司。實(shí)驗(yàn)用水為本實(shí)驗(yàn)室采用Millipore純水系統(tǒng)自制。

二、LC-MS/MS分析條件

1. 色譜分析條件分析柱為Capcell C18 MG Ⅲ(5 μm，2.1 mm×100 mm，日本資生堂精細(xì)化學(xué)公司)；流動(dòng)相為10 mmol/L乙酸銨+0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸乙腈溶液(60∶40，v/v)，等度洗脫，流速為0.3 mL/min，進(jìn)樣體積20 μL。

2. 質(zhì)譜分析條件電噴霧(electrospray ionization，ESI)離子源，正離子模式。噴霧氣：50，輔助加熱氣：50，氣簾氣：20，碰撞氣：中等。離子源電壓：5 500 V，離子源溫度：400℃；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描分析，地高辛離子通道分別選擇為798.6/651.5 amu(定量)和798.6/233.2 amu(定性)；內(nèi)標(biāo)地高辛-d3選擇801.6/654.5 amu。

3. 樣品處理方法200 μL血清加20 μL內(nèi)標(biāo)工作液(10 ng/mL地高辛-d3)，再加1 mL特丁基甲醚渦旋振蕩5 min，然后14 000×g離心5 min，取上清液，45℃吹干，加100 μL 40%甲醇重組，渦旋5 min，取80 μL轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶供進(jìn)樣分析。

4. 貯備液及工作液配制方法地高辛和同位素內(nèi)標(biāo)地高辛-d3均用甲醇配成100 μg/mL，地高辛-d3用40%甲醇稀釋至10 ng/mL作為內(nèi)標(biāo)工作液，貯備液及工作液4℃保存。在空白小牛血清中加入地高辛貯備液，配制成濃度分別為0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 ng/mL的溶液(用于標(biāo)準(zhǔn)曲線制作)和0.15、4.00 ng/mL的溶液(質(zhì)控品)，按樣品處理方法處理后進(jìn)樣。

三、方法學(xué)評(píng)價(jià)

LC-MS/MS的性能評(píng)價(jià)指標(biāo)包括方法特異性、線性范圍和檢測(cè)靈敏度、精密度、準(zhǔn)確度、回收率、基質(zhì)效應(yīng)和穩(wěn)定性。

1. 特異性觀察不同來(lái)源的血清對(duì)地高辛的干擾情況。取6份不同個(gè)體的空白血清，分別配制成濃度為0.15和4.00 ng/mL的地高辛質(zhì)控品，按樣品處理步驟操作并進(jìn)樣分析。

2. 定量限對(duì)定量下限(lower limit of quantitation，LLOQ)的要求是準(zhǔn)確度為80%～120%、精密度[變異系數(shù)(CV)]≤20%、信噪比(signal-noiseratio,S/N)≥10[12]。

3. 精密度和準(zhǔn)確度在空白血清中分別配制濃度為0.15和4.00 ng/mL的地高辛質(zhì)控品，重復(fù)測(cè)定20次；再測(cè)定6批，每批重復(fù)測(cè)定3次，計(jì)算批內(nèi)、批間精密度與準(zhǔn)確度；同時(shí)觀察地高辛在最低定量限(0.05 ng/mL)處的批內(nèi)精密度和準(zhǔn)確度。

4. 回收率和基質(zhì)效應(yīng)取濃度為0.15和4.00 ng/mL的質(zhì)控品和空白血清各6份，按樣品處理方法進(jìn)行處理，在處理后的空白血清上清液中加入相應(yīng)濃度的地高辛和地高辛-d3，進(jìn)樣分析，計(jì)算質(zhì)控品與空白添加相應(yīng)濃度樣品的峰面積百分比，即為樣品處理過(guò)程的回收率。另將空白樣品提取后添加相應(yīng)濃度樣品，進(jìn)樣檢測(cè)，并與空白溶劑添加相應(yīng)濃度樣品的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，計(jì)算相應(yīng)濃度的峰面積百分比，即為基質(zhì)效應(yīng)。

5. 穩(wěn)定性穩(wěn)定性可能對(duì)檢測(cè)結(jié)果的可靠性、可重復(fù)性產(chǎn)生影響，因此有必要對(duì)影響穩(wěn)定性的各種因素(如樣品采集、處理、保存等)進(jìn)行觀察，確保在不影響地高辛穩(wěn)定性的條件下進(jìn)行操作[13]。將血清樣品反復(fù)凍融[從-20℃到室溫(23℃)解凍3次]、在室溫放置24 h以及樣品處理后在自動(dòng)進(jìn)樣器放置36 h后采用LC-MS/MS測(cè)定地高辛濃度，并與初始值比較，觀察其穩(wěn)性性。

四、方法比較及室間質(zhì)量評(píng)價(jià)

本實(shí)驗(yàn)室從2009年下半年開(kāi)始連續(xù)參加衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心全國(guó)TDMEQA計(jì)劃。該計(jì)劃1年2次，每次提供5個(gè)血清樣品。在規(guī)定時(shí)間內(nèi)將測(cè)定結(jié)果上報(bào)，衛(wèi)生部臨檢中心反饋每次檢測(cè)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。由參與TDM EQA計(jì)劃的臨床實(shí)驗(yàn)室(2014年為127個(gè)實(shí)驗(yàn)室)按方法學(xué)分組的檢測(cè)均值確定EQA樣品的靶值。測(cè)定結(jié)果在靶值的20%內(nèi)視為可接受。

將臨床收集的60例血清樣品同時(shí)采用LC-MS/MS和電化學(xué)發(fā)光法測(cè)定，比較兩種方法間的差異。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。兩種方法之間的差異采用配對(duì)t檢驗(yàn)，方法相關(guān)性采用線性回歸分析，正態(tài)分布檢驗(yàn)采用單樣本K-S分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、LC-MS/MS測(cè)定地高辛方法的建立

以乙酸銨溶液為流動(dòng)相，地高辛的相對(duì)分子質(zhì)量為780.95 g/mol。在正離子ESI離子化模式下，m/z 798.6 的[M+NH4]+離子信號(hào)在乙酸銨溶液體系更加容易形成信號(hào)更強(qiáng)的分子離子峰，而過(guò)高濃度(>20 mmol/L)乙酸銨則容易抑制離子信號(hào)。對(duì)分子離子峰碎裂進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，主要形成m/z 651.5、m/z 233.2和m/z 175.4等碎片離子峰。選擇Q1/Q3離子通道798.6/651.5 amu作為定量離子通道，同時(shí)選擇Q1/Q3離子通道798.6/233.2 amu作為定性離子通道。內(nèi)標(biāo)地高辛-d3的質(zhì)譜特征與地高辛相似，形成m/z 801.5的分子離子峰，碎裂后的二級(jí)質(zhì)譜主要形成m/z 654.5的碎片離子。

采用10 mmol/L乙酸銨+0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸乙腈溶液為流動(dòng)相，地高辛的典型保留時(shí)間為1.3 min，總的色譜分析時(shí)間為3 min，在空白血清樣品中未見(jiàn)對(duì)地高辛和內(nèi)標(biāo)有干擾的色譜峰，其色譜圖見(jiàn)圖1。

二、方法學(xué)評(píng)價(jià)

收集臨床未服用地高辛的患者血清樣品，按照樣品處理方法處理后進(jìn)樣分析。在地高辛及內(nèi)標(biāo)通道均未發(fā)現(xiàn)干擾峰存在，見(jiàn)圖1。

取小牛血清配制1 ng/mL地高辛濃度，分別與6個(gè)臨床血清樣品(服用地高辛患者血清，男女各半)等體積混合，重復(fù)6次，同時(shí)測(cè)定臨床血清樣品、小牛血清、混合樣品的地高辛及內(nèi)標(biāo)響應(yīng)?；旌蠘悠返馗咝?內(nèi)標(biāo)比值與理論值(臨床血清樣品與小牛血清響應(yīng)均值)的百分比為96.4%±5.1%，說(shuō)明小牛血清作為空白基質(zhì)與人血清有良好的互換性。

注：(a)空白樣品；(b)LLOQ，地高辛濃度為0.05 ng/mL，S/N=39.5；(c)患者血清樣品，地高辛濃度為0.425 ng/mL；地高辛(左圖)和內(nèi)標(biāo)(右圖)的色譜保留時(shí)間為1.3 min

圖1地高辛典型色譜圖

以地高辛添加濃度為X軸，地高辛與內(nèi)標(biāo)的峰面積比為Y軸，進(jìn)行線性回歸，經(jīng)“1/X”權(quán)重得回歸方程為Y=0.075 5X+0.013 1，r=0.999 7。表明地高辛在0.05～5 ng/mL血清濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。本方法的LLOQ為0.05 ng/mL，S/N為39.5，見(jiàn)圖1。檢測(cè)限可達(dá)0.005 ng/mL。

本方法的精密度≤4.3%，準(zhǔn)確度為101.3%～108.9%,回收率為95.8%～97.5%，基質(zhì)效應(yīng)為95.7%～97.6%。見(jiàn)表1。

表1　地高辛準(zhǔn)確度和精密度

血清樣品經(jīng)反復(fù)凍融(從-20℃到室溫反復(fù)解凍3次)、室溫放置24 h、樣品處理后在自動(dòng)進(jìn)樣器(室溫)放置36 h后的地高辛測(cè)定結(jié)果與初始測(cè)定值比較，偏差均在允許范圍內(nèi)，見(jiàn)表2。

表2　穩(wěn)定性結(jié)果

三、EQA及方法比較

采用本實(shí)驗(yàn)室自建的LC-MS/MS測(cè)定EQA樣品中的地高辛濃度，將測(cè)定結(jié)果與靶值進(jìn)行線性回歸分析，見(jiàn)圖2?；貧w方程為YLC-MS/MS=1.01XEQA靶值-0.09，r=0.99，與靶值的平均偏差為-4.09%(n=55)，偏差(均值±2s)為-20.7%～12.5%。LC-MS/MS結(jié)果和EQA靶值在低濃度時(shí)存在負(fù)偏差。

采用LC-MS/MS和電化學(xué)發(fā)光法測(cè)定60例臨床血清樣品中的地高辛濃度，結(jié)果見(jiàn)圖3。

注：(a)線性回歸圖，YLC-MS/MS=1.01X靶值-0.09，r=0.99；(b)Bland-Altman圖，LC-MS/MS測(cè)定結(jié)果與靶值的平均偏差為-4.09%，偏差(均值±2s)為-20.7%～12.5%

圖2LC-MS/MS測(cè)定結(jié)果與靶值之間的線性回歸圖和Bland-Altman圖

圖3　LC-MS/MS和電化學(xué)發(fā)光法測(cè)定血清地高辛的比較

單樣本K-S分析顯示2組數(shù)據(jù)均呈正態(tài)分布，因此采用配對(duì)t檢驗(yàn)分析兩組均值的差異。LC-MS/MS測(cè)定結(jié)果為(0.78±0.45)ng/mL，電化學(xué)發(fā)光法結(jié)果為(1.03±0.55)ng/mL，兩種方法之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。電化學(xué)發(fā)光法測(cè)定結(jié)果比LC-MS/MS平均高36.9%。

討論

地高辛治療指數(shù)低，安全范圍窄，藥動(dòng)學(xué)、藥效學(xué)個(gè)體差異大，肝腎功能不全等可引起中毒反應(yīng)。因此臨床上需進(jìn)行TDM，分析血藥濃度與臨床治療效果及中毒反應(yīng)的關(guān)聯(lián)性[3]。傳統(tǒng)的地高辛治療范圍(血清濃度)為0.8～2.0 ng/mL，這個(gè)濃度范圍主要是用于判別地高辛中毒，其有效性范圍一致存在爭(zhēng)議[14]。

目前臨床上應(yīng)用于地高辛血藥濃度監(jiān)測(cè)的方法主要是基于免疫學(xué)原理，采用抗原與抗體特異性反應(yīng)形成抗原-抗體免疫復(fù)合物。免疫法無(wú)法直接檢測(cè)地高辛本身，其底物檢測(cè)必須依賴一系列的免疫反應(yīng)，經(jīng)常容易受到內(nèi)外源性地高辛免疫活性物質(zhì)的干擾[15]，這些檢測(cè)結(jié)果可能會(huì)帶給臨床錯(cuò)誤甚至危險(xiǎn)的診斷。

在原有的工作[11]基礎(chǔ)上，本研究采用LC-MS/MS檢測(cè)血清地高辛濃度，調(diào)整了線性濃度范圍，同時(shí)開(kāi)展了EQA的持續(xù)評(píng)價(jià)，并與電化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行了初步比對(duì)。結(jié)果表明，不同來(lái)源的血清對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響基本一致，LC-MS/MS具有較好的特異性；LLOQ為0.05 ng/mL，具有非常高的靈敏度；線性范圍為0.05～5.0 ng/mL，足以覆蓋地高辛在臨床上可能出現(xiàn)的各種濃度范圍。

LC-MS/MS與EQA靶值的比對(duì)結(jié)果顯示兩者的相關(guān)性良好，平均偏差為-4.09%，具有較好的可比性。由此可見(jiàn)，LC-MS/MS不但可為地高辛的臨床TDM提供服務(wù)，同時(shí)亦可為臨床TDM建立質(zhì)控方法。LC-MS/MS與電化學(xué)發(fā)光法的比對(duì)結(jié)果顯示二者之間結(jié)果差異很大，電化學(xué)發(fā)光法結(jié)果明顯高于LC-MS/MS，特別是在低濃度時(shí)差異尤為明顯，具體原因需要今后與參考方法比較及進(jìn)行相關(guān)干擾研究得到確切結(jié)論。如因檢測(cè)方法的原因?qū)е碌馗咝翙z測(cè)結(jié)果偏高，那么在臨床上可能會(huì)造成部分接受地高辛治療的患者血清濃度尚未到達(dá)合適的治療范圍，而檢測(cè)結(jié)果則指示臨床無(wú)需調(diào)整治療劑量的錯(cuò)誤后果。由此可見(jiàn)，需要進(jìn)一步開(kāi)展有關(guān)地高辛檢測(cè)方法的干擾研究、參考方法建立、室間質(zhì)量控制甚至正確度驗(yàn)證等工作，切實(shí)提高地高辛檢測(cè)的質(zhì)量，促進(jìn)地高辛TDM的臨床效果。

綜上所述，今后可將LC-MS/MS作為臨床地高辛TDM的質(zhì)控方法。在相關(guān)部門(mén)的管理下，各個(gè)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室應(yīng)積極開(kāi)展地高辛TDM的EQA，采用統(tǒng)一的、標(biāo)準(zhǔn)的地高辛TDM質(zhì)控品來(lái)改善實(shí)驗(yàn)室之間、方法之間以及方法內(nèi)的偏差，以便為臨床診斷提供更好的服務(wù)。

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(本文編輯：龔曉霖)

注： 焦瑞寶與唐吉斌對(duì)本研究具有同等貢獻(xiàn)，并列為第一作者。

收稿日期：(2015-01-23)

中圖分類(lèi)號(hào)：

文章編號(hào)：1673-8640(2015)05-0437-05R446.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.05.007

通訊作者：李水軍，聯(lián)系電話：021-54031835。

作者簡(jiǎn)介：孫賀偉，男，1991年生，學(xué)士，主要從事質(zhì)譜技術(shù)生物分析工作。

基金項(xiàng)目：上海市藥學(xué)會(huì)科研基金資助項(xiàng)目(2014-YY-02-19)