惡性卵巢上皮性腫瘤組織中miR-181a、TGF-β1、TGF-βR1的表達(dá)變化及意義

李紅雨，韓會(huì)會(huì)，朱海,郭歡歡，曹蒙，劉星爍，張敏

(鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院，鄭州450052)

摘要：目的觀察惡性卵巢上皮性腫瘤組織中miR-181a、TGF-β1、TGF-βR1的表達(dá)變化，并探討其意義。方法良性卵巢上皮性腫瘤26例(良性組)、惡性卵巢上皮性腫瘤59例(惡性組)及子宮良性腫瘤28例(對(duì)照組)。用qRT-PCR 法檢測各組卵巢組織中的miR-181a、TGF-β1 mRNA、TGF-βR1 mRNA；用免疫組化SP法檢測各組卵巢組織中的TGF-β1蛋白和TGF-βR1蛋白。結(jié)果惡性組的miR-181a、TGF-β1 mRNA、TGF-βR1 mRNA相對(duì)表達(dá)量與良性組、對(duì)照組相比，P均<0.05。惡性組TGF-β1蛋白、TGF-βR1蛋白的陽性表達(dá)率與良性組及對(duì)照組相比，P均<0.05。miR-181a、TGF-β1 mRNA、TGF-βR1 mRNA相對(duì)表達(dá)量及TGF-β1蛋白、TGF-βR1蛋白表達(dá)與惡性卵巢上皮性腫瘤的臨床分期、組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.05)。惡性組miR-181a與TGF-β1 mRNA的表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.810,P<0.05)、與TGF-βR1 mRNA的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.769,P<0.05)，TGF-β1 mRNA與TGF-βR1 mRNA的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.837,P<0.05)。結(jié)論 惡性卵巢上皮性腫瘤組織中miR-181a、TGF-β1高表達(dá)，而TGF-βR1低表達(dá)，三者的表達(dá)有相關(guān)關(guān)系，可能共同參與了惡性卵巢上皮性腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移過程。

關(guān)鍵詞：卵巢腫瘤；惡性卵巢上皮性腫瘤；小分子單鏈RNA；轉(zhuǎn)化生長因子；轉(zhuǎn)化生長因子受體

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.43.022

中圖分類號(hào)：R737.31文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

基金項(xiàng)目：2013年度河南省鄭州市工程技術(shù)研究中心(重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)科研課題。

收稿日期：(2015-06-22)

通信作者：李紅雨

miRNA是一類全長約22 nt的非編碼小分子單鏈RNA，在卵巢癌的侵襲、轉(zhuǎn)移中可能發(fā)揮著重要作用[1]。研究[2]證實(shí)，miR-181a在一些惡性腫瘤中表達(dá)升高，而在一些惡性腫瘤中表達(dá)下調(diào)，這種改變與TGF-β家族的功能密切相關(guān)[3]，該家族的分泌紊亂及其傳導(dǎo)通路的中斷與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[4]。TGF-β1、TGFβR1是TGF-β家族的重要成員，同時(shí)是miR-181a的靶基因[5]。本研究對(duì)惡性卵巢上皮性腫瘤組織中miR-181a、TGF-β1、TGF-βR1的表達(dá)及三者間的表達(dá)關(guān)系進(jìn)行了觀察，探討其在惡性卵巢上皮性腫瘤發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移過程中可能發(fā)揮的作用。

1資料與方法

1.1臨床資料2010年3月～2014年9月于鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院和鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院接受手術(shù)治療的原發(fā)性卵巢上皮性腫瘤患者85例(年齡17～76歲)。術(shù)前未接受化療、放療等治療，術(shù)后病理檢查證實(shí)為良性卵巢上皮性腫瘤26例(良性組)、惡性卵巢上皮性腫瘤59例(惡性組)。惡性組按FIGO(2000年)分期標(biāo)準(zhǔn)分為Ⅰ、Ⅱ期14例，Ⅲ、Ⅳ期45例;低分化29例，高、中分化30例;漿液性囊腺癌37例，黏液性囊腺癌12例，子宮內(nèi)膜樣癌10例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移35例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移24例。接受手術(shù)治療的子宮良性腫瘤患者28例(對(duì)照組)三組術(shù)中均留取適量卵巢組織并分為兩份，一份立即置液氮中速凍后-80 ℃冰箱保存，用于qRT-PCR檢測;一份用10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，4 μm厚切片，用于免疫組化檢測。

1.2主要試劑及儀器TRIzol試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR Master Mix購自Tiangen公司;免疫組化SP試劑盒及DAB顯色試劑盒購自北京博奧森公司;兔抗人TGF-β1多克隆抗體和兔抗人TGF-βR1多克隆抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)公司。生物分光光度儀為德國Eppendorf公司產(chǎn)品，qRT-PCR儀為美國ABI公司產(chǎn)品。引物由南京金斯瑞生物有限公司合成。引物序列：miR-181a上游引物為5′-CT-CAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGA-CTCAC-3′、下游引物為5′-ACACTCCAGCTGGGAAC-ATTCAACGCTGTCG-3′；U6上游引物為5′-CTCGCT-TCGGCAGCACA-3′、下游引物為5′-AACGCTTCACG-AATTTGCGT-3′；TGF-β1上游引物為5′-CTAGTCTA-GAATGCCGCCCTCCGGGC-3′、下游引物為5′-AAGG-AAAAAAGCGGCCGCTCAGCTGCACTTGCAGGAGC-G-3′；TGF-βR1上游引物為5′-ACCTTCTGATCCATCCGTT-3′、下游引物為5′-CGCAAAGCTGTCAGCCTAG-3′；GAPDH上游引物為5′-CGCTGAGTACGTCGTGGAGT-3′、下游引物為5′-GTCGCTGTTGAAGTCAGAGGAG-3′。

1.3miR-181a、TGF-β1mRNA、TGF-βR1 mRNA的檢測采用qRT-PCR法。①RNA提取、檢測：取適量卵巢組織，提取總RNA，紫外分光光度計(jì)測定總RNA純度及濃度。②逆轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增:逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為10 μL。取3 μL總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為37 ℃孵育60 min。PCR反應(yīng):取cDNA 1 μL，總反應(yīng)體系為20 μL；反應(yīng)條件為95 ℃ 15 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 60 s，共40個(gè)循環(huán)。用U6或GAPDH作內(nèi)參。所有標(biāo)本設(shè)立3個(gè)復(fù)孔，記錄每個(gè)PCR反應(yīng)管中標(biāo)本的Ct值，以2-ΔΔCT代表目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.4TGF-β1蛋白和TGFβR1蛋白的檢測采用免疫組化SP法。將石蠟包埋卵巢組織標(biāo)本的切片脫蠟水化，嚴(yán)格按SP免疫組化試劑盒說明書進(jìn)行操作。用PBS代替一抗作陰性對(duì)照，已知陽性組織切片作陽性對(duì)照。顯微鏡下觀察染色切片，細(xì)胞呈棕黃色顆粒狀或片狀者為陽性。在高倍鏡下(400×)隨機(jī)選取5個(gè)視野(每個(gè)視野觀察不少于100個(gè)細(xì)胞)，按細(xì)胞著色強(qiáng)度及陽性細(xì)胞所占百分比進(jìn)行結(jié)果判定[11]:細(xì)胞無著色為0分、淡黃色為1分、棕黃色為2分、棕褐色為3分；無陽性細(xì)胞為0分，陽性細(xì)胞百分比0～25%為1分、～50%為2分、～75%為3分、～100%為4分；上述兩項(xiàng)評(píng)分的乘積0～1為陰性(-)、2～4為弱陽性(+)、5～8為中度陽性(++)、9～12為強(qiáng)陽性(+++)，+、++、+++均為陽性。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料比較用單因素方差分析，計(jì)數(shù)資料比較用χ2檢驗(yàn)和Fisher精確概率法，相關(guān)性分析用Pearson相關(guān)分析法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組miR-181a、TGF-β1mRNA、TGF-βR1mRNA的表達(dá)比較各組miR-181a、TGF-β1mRNA、TGF-βR1 mRNA的檢測結(jié)果見表1。

2.2各組TGF-β1蛋白和TGF-βR1蛋白的表達(dá)比較惡性組TGF-β1蛋白、TGF-βR1蛋白的陽性表達(dá)率分別為69.5%(41/59)、23.7%(14/59)，良性組分別為15.4%(4/26)、73.1%(19/26)，對(duì)照組分別為35.7%(10/28)、57.1%(16/28)；惡性組與良性組及對(duì)照組相比，P均<0.05；良性組與對(duì)照組相比，P均>0.05。

表1　 各組miR-181a、TGF-β 1 mRNA、TGF-βR1 mRNA的

注：與良性組、對(duì)照組相比，*P<0.05。

2.3miR-181a、TGF-β1、TGF-βR1表達(dá)與惡性卵巢上皮性腫瘤臨床病理參數(shù)的關(guān)系miR-181a、TGF-β1 mRNA、TGF-βR1 mRNA相對(duì)表達(dá)量及TGF-β1蛋白、TGF-βR1蛋白表達(dá)與惡性卵巢上皮性腫瘤的臨床分期、組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.05)，而與組織類型、患者年齡無關(guān)(P均>0.05)，見表2、3。

表2　 miR-181a、TGF-β 1 mRNA、TGF-βR1 mRNA表達(dá)與

表3　 TGF-β 1蛋白、TGF-βR1蛋白表達(dá)與惡性卵巢上皮性

2.4惡性卵巢上皮性腫瘤組織miR-181a、TGF-β1mRNA、TGF-βR1 mRNA表達(dá)的相關(guān)性miR-181a與TGF-β1mRNA的表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.810,P<0.05)、與TGF-βR1 mRNA的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.769,P<0.05)；TGF-β1mRNA與TGF-βR1 mRNA的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.837,P<0.05)。

3討論

miRNA是一類在動(dòng)植物中廣泛存在、不編碼蛋白質(zhì)的單鏈小RNA，長度一般為21～25 nt。腫瘤細(xì)胞與正常組織細(xì)胞的miRNA，表達(dá)譜存在明顯差異。有研究[4]發(fā)現(xiàn)，惡性卵巢上皮性腫瘤中miR-200a、miR-141高表達(dá)，而miR-199a、miR-140低表達(dá)。miR-181a長度為22 nt，定位于人9號(hào)染色體。研究[2]發(fā)現(xiàn)，miR-181a與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如胃癌、乳腺癌、宮頸癌等。本研究結(jié)果顯示，miR-181a在惡性卵巢上皮性腫瘤組織中的表達(dá)明顯高于正常卵巢上皮組織和良性卵巢上皮性腫瘤組織，提示miR-181a高表達(dá)可能參與了惡性卵巢上皮性腫瘤的發(fā)生。miR-181a的表達(dá)量與惡性卵巢上皮性腫瘤的臨床分期、組織學(xué)分級(jí)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)，提示miR-181a可能也參與了惡性卵巢上皮性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過程。

TGF-β是一類結(jié)構(gòu)和功能密切相關(guān)的活性多肽家族，TGF-β1是miR-181a的靶基因，廣泛參與細(xì)胞的分化、增殖、形態(tài)改變、黏附、轉(zhuǎn)移、細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生及凋亡等[5～8]。TGF-βR1是TGF-β家族的另一成員，是TGF-β1最重要的受體，其對(duì)TGF-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)極為重要，缺失TGF-βR1的突變細(xì)胞對(duì)TGF-β1無反應(yīng)[9]。在胰腺癌組織中TGF-β1表達(dá)上調(diào)，TGF-βR1表達(dá)降低，TGF-βR1表達(dá)降低是可能腫瘤細(xì)胞對(duì)TGF-β1反應(yīng)性減弱的原因之一[9]。Grau等[10]報(bào)道，胰腺癌細(xì)胞存在TGF-β受體表達(dá)異常，主要為TGF-βR1基因表達(dá)異常，TGF-βR1的低表達(dá)可能為胰腺癌逃脫TGF-β負(fù)性生長調(diào)控的機(jī)制之一。本研究結(jié)果顯示，TGF-β1在惡性卵巢上皮性腫瘤組織中的表達(dá)明顯高于正常卵巢上皮組織和良性惡性卵巢上皮性腫瘤組織，且TGF-β1的表達(dá)與惡性卵巢上皮性腫瘤臨床分期、組織學(xué)分級(jí)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)，提示TGF-β1高表達(dá)可能參與了惡性卵巢上皮性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。而TGF-βR1在惡性卵巢上皮性腫瘤組織中的表達(dá)明顯低于正常卵巢上皮組織和良性卵巢上皮性腫瘤腫瘤組織，提示TGF-βR1的低表達(dá)可能為惡性卵巢上皮性腫瘤逃脫TGF-β負(fù)性生長調(diào)控的機(jī)制之一。

本研究還發(fā)現(xiàn)，惡性卵巢上皮性腫瘤組織中miR-181a與TGF-β1mRNA的表達(dá)呈正相關(guān)、與TGF-βR1 mRNA的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，TGF-β1mRNA與TGF-βR1 mRNA的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。據(jù)此推測miR-181a和TGF-β1mRNA表達(dá)的上調(diào)以及TGF-βR1 mRNA表達(dá)的降低可能起協(xié)同作用，三者共同參與惡性卵巢上皮性腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移過程[11]。

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