趙小迎++金緯緯

[摘要] 目的 檢測組織纖溶酶原激活物（t-PA）、纖溶酶原激活劑抑制物（PAI-1）和轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）在術(shù)后腹腔粘連中的表達(dá)，分析其在子宮全切除術(shù)后腹腔粘連發(fā)生發(fā)展過程中的作用，探討腹腔粘連發(fā)生機(jī)制。 方法 選擇本院子宮肌瘤患者60例，均行子宮全切除術(shù)，開腹手術(shù)30例（開腹組），腹腔鏡手術(shù)30例（腹腔鏡A組），收集同期行腹腔鏡下卵巢囊腫剝除術(shù)病例30例（腹腔鏡B組）。開腹組腹膜打開后、術(shù)中間隔30 min、關(guān)腹前，腹腔鏡組在氣腹形成后、術(shù)中間隔30 min、結(jié)束氣腹前分別取外周血5 mL和腹膜；并于術(shù)后1 d、2 d、3 d 抽取外周靜脈血5 mL，檢測血液 t-PA、PAI-1濃度，組織 TGF-β 蛋白和 TGF-β基因表達(dá)。 結(jié)果 開腹組術(shù)中、關(guān)腹前血清 t-PA 為（27.79±1.76）ng/L和（24.68±1.73）ng/L，低于腹腔鏡A組和B組患者，開腹組術(shù)中、關(guān)腹前血清 PAI-1為（22.46±1.22）μg/L和（24.31±1.80）μg/L，高于腹腔鏡A組和B組患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。開腹組關(guān)腹前組織 TGF-β 蛋白、TGF-β 基因分別為（2.59±0.63）和（34.74±1.92），均高于腹腔鏡A組和B組患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；開腹組術(shù)后1 d、2 d、3 d 血清 t-PA 低于腹腔鏡A組和B組患者，PAI-1 高于腹腔鏡A組和B組患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論 開腹組患者 PAI-1、TGF-β 蛋白和基因表達(dá)呈現(xiàn)較強(qiáng)表達(dá)，PAI-1 隨著手術(shù)時間的延長而增加，t-PA 濃度顯著降低，隨著手術(shù)時間的延長而下降。

[關(guān)鍵詞] 腹腔粘連；腹腔鏡術(shù)；組織纖溶酶原激活物；纖溶酶原激活劑抑制物等；轉(zhuǎn)化生長因子-β

[中圖分類號] R713.4+2 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）09-0001-04

The role of fibrinolytic system and transforming growth factor-1 in the pathogenesis of peritoneal adhesions after total hysterectomy

ZHAO Xiaoying JIN Weiwei

Department of Obstetrics and Gynecology，Wenzhou Traditional Chinese and Western Medicine Hospital in Zhejiang Province，Wenzhou 325000，China

[Abstract] Objective To investigate the expression of tissue plasminogen activator（t-PA）， plasminogen activator inhibitor（PAI-1）and transforming growth factor-β（TGF-β） in postoperative peritoneal adhesions， and to analyze their role in the development of abdominal adhesions after total hysterectomy，and to explore mechanism of abdominal adhesions. Methods 60 patients with uterine leiomyoma were enrolled in this study. All patients underwent total hysterectomy. There were 30 patients undergoing laparotomy（laparotomy group） and 30 patients undergoing laparoscopic surgery （laparoscopic group A）.30 cases of laparoscopic ovarian cystectomy in the same period were collected （laparoscopic group B）. 5 mL peripheral blood and peritoneum were taken after the opening of peritoneum，intraoperative interval of 30 minutes and before the closing of abdomen in the laparotomy group and after the formation of pneumo-peritoneum， intraoperative interval of 30 minutes and before the end of pneumoperitoneum in the laparoscopic group. The expression levels of blood t-PA， PAI-1 concentration， and TGF-β protein and TGF-β gene in tissue were detected by immunohistochemistry at first day， second day and third day after operation. Results The levels of serum t-PA during surgery and before the closing of abdomen were（27.79±1.76）ng/L and（24.68±1.73）ng/L in laparotomy group， which were lower than those of laparoscopic group A and group B. And the levels of serum PAI-1 during surgery and before the closing of abdomen were（22.46±1.22）μg/L and（24.31±1.80）μg/L ，which were higher than those of laparoscopic group A and group B. And the differences were significant（P<0.05）. The levels of tissue TGF-β protein and TGF-β gene were （2.59±0.63） and （34.74±1.92） in the laparotomy group， which were significantly higher than those in the laparoscopic group A and group B， and the differences were significant（P<0.05）. The serum t-PA level in laparotomy group was lower than that in the laparoscopic group A and group B at first day， second day and third day after operation. And the level of PAI-1 in laparotomy group was higher than that in laparoscopic group A and group B， and the differences were statistically significant（P<0.05）. Conclusion PAI-1， TGF-β protein and gene in the laparotomy group were strongly expressed in the laparotomy group. t-PA concentration decreased significantly， and decreased with the operation time.

[Key words] Peritoneal adhesions；Laparoscopy；Tissue plasminogen activator；Plasminogen activator inhibitors；Transforming growth factor-β

腹腔術(shù)后出現(xiàn)腹腔粘連是長期困繞外科手術(shù)的一個難題，腹膜對手術(shù)的反應(yīng)取決于手術(shù)創(chuàng)傷的程度，形成機(jī)制復(fù)雜[1]。有研究[2-3]認(rèn)為血漿纖維蛋白溶解系統(tǒng)的活性對于腹腔粘連的溶解具有重要作用，多種細(xì)胞的遷移和增生及各種生長因子和細(xì)胞因子的了腹腔粘連過程，如組織纖溶酶原激活物（tissue plasminogen activator，t-PA）、纖溶酶原激活劑抑制物（plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1）等。組織中轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）是啟動和終止組織修復(fù)的一種肽類生長因子[4-5]。本研究旨在檢測t-PA、PAI-1和 TGF-β 在術(shù)后腹腔粘連中的表達(dá)水平，分析其在腹腔粘連發(fā)生發(fā)展過程中的作用，探討腹腔粘連發(fā)生機(jī)制?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇本院2014年1月～2015年12月子宮肌瘤患者60例，均行子宮全切除術(shù)，開腹手術(shù)30例（開腹組），腹腔鏡手術(shù)30例（腹腔鏡A組）收集在本院因“良性卵巢囊腫”行腹腔鏡下卵巢囊腫剝除術(shù)的病例30例（腹腔鏡B組）。開腹組患者年齡36～62歲，平均（44.19±8.24）歲，腹腔鏡A組患者年齡35～61歲，平均（44.08±8.31）歲；腹腔鏡B組患者年齡37～62歲，平均（44.29±8.54）歲，各組入選研究對象年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法

開腹組腹膜打開后、術(shù)中間隔30 min、關(guān)腹前分別取腹膜約 0.5 cm×0.5 cm，并抽取外周靜脈血 5 mL，腹腔鏡A組和B組在氣腹形成后、術(shù)中間隔30 min、結(jié)束氣腹前取空腹外周靜脈血 5 mL 和腹膜約 0.5 cm×0.5 cm；手術(shù)結(jié)束后1 d、2 d、3 d 抽取清晨空腹外周血 5 mL。血液樣本-20℃保存?zhèn)溆?，組織樣本-80℃保存?zhèn)溆?。ELISA法測定血液標(biāo)本 t-PA、PAI-1 濃度。免疫組化法和 real-time PCR 檢測組織標(biāo)本中 TGF-β 蛋白和 TGF-β 基因表達(dá)。

免疫組化法主要步驟：10% 福爾馬林組織固定、石蠟包埋、切片，脫蠟、梯度酒精水化；抗原修復(fù)，滴加 3% H2O2。滴加非免疫血清阻斷非特異反應(yīng)；滴加 TGF-β 一抗（工作濃度1∶50）；滴加二抗和底物顯色液，蘇木素復(fù)染；二甲苯、封片。兔抗人 TGF-β 多克隆抗體免疫組化試劑盒（購自武漢博士德生物工程有限公司）。光鏡下觀察，每張片子取 5個高倍視野，每個視野下計數(shù) 100 個瘤細(xì)胞，半定量積分法對每張切片細(xì)胞進(jìn)行染色強(qiáng)度分級記分，無著色（0分）、淡黃色（1分）和棕褐色（2分），按陽性細(xì)胞面積計0（0分）、1%～25%（1分），26%～50%（2分）、51%～75%（3分）、76%～100%（4分），將兩項乘積進(jìn)行評估其陽性表達(dá)強(qiáng)度評估。

RT-qPCR步驟：反轉(zhuǎn)錄（依賴反轉(zhuǎn)錄酶將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNDA）、擴(kuò)增（用PCR的方法擴(kuò)增cDNA）、檢測（檢測和定量擴(kuò)增的產(chǎn)物）。對硝酸纖維素膜進(jìn)行掃描并進(jìn)行灰度分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用 SPSS 19.0 對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料以（x±s）表示，采用t檢驗，多組間計量資料采用F檢驗，計數(shù)資料比較用χ2檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組開腹前血清t-PA、PAI-1和組織 TGF-β蛋白、TGF-β基因結(jié)果比較

三組術(shù)前各項結(jié)果比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

2.2 三組術(shù)中血清 t-PA、PAI-1和組織 TGF-β 蛋白、TGF-β 基因結(jié)果比較

開腹組術(shù)中血清 t-PA 為低于腹腔鏡A組和B組患者，開腹組術(shù)中血清 PAI-1 高于腹腔鏡A組和B組患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

2.3 三組關(guān)腹前血清t-PA、PAI-1和組織TGF-β蛋白、TGF-β基因結(jié)果比較

開腹組關(guān)腹前血清t-PA低于腹腔鏡A組和B組患者，開腹組關(guān)腹前血清PAI-1和組織TGF-β蛋白、TGF-β基因均高于腹腔鏡A組和B組患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

2.4三組術(shù)后不同時間血清t-PA和PAI-1結(jié)果比較

開腹組術(shù)后1 d、2 d、3 d血清t-PA低于腹腔鏡A組和B組患者，PAI-1高于腹腔鏡A組和B組患者，且隨著術(shù)后時間的延長，血清t-PA和PAI-1水平呈現(xiàn)下降和上升趨勢，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表4。

3 討論

腹腔疾病術(shù)后粘連發(fā)生率達(dá) 90% 以上，是剖腹術(shù)后一個重大難題。腹膜受到損傷時，大量吞噬細(xì)胞遷移并誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞至創(chuàng)面，激活成纖維細(xì)胞產(chǎn)生膠原，并釋放多種生長因子與蛋白酶，破壞纖維蛋白溶解與合成平衡，使過度生成的膠原纖維無法被正常溶解與代謝，細(xì)胞外基質(zhì)沉積而導(dǎo)致粘連的形成[6-8]。腹膜對手術(shù)的反應(yīng)取決于手術(shù)創(chuàng)傷的程度，最小程度的侵入手術(shù)方式可減少術(shù)后腹腔粘連的嚴(yán)重程度。腹腔鏡手術(shù)具有腹膜損傷小，術(shù)后粘連發(fā)生率低等優(yōu)點[9-10]。

多種細(xì)胞的遷移、增生及細(xì)胞因子參與了粘連過程，其中纖維蛋白原的釋放與溶解的失衡具有關(guān)鍵作用[11]。t-PA 是一種含527個氨基酸的單鏈糖蛋白，分子量6.8萬～7.2萬，為絲氨酸蛋白酶，通過裂解纖溶酶原肽鍵而發(fā)揮纖溶作用。PAI 是t-PA的拮抗劑，t-PA和PAI 可反映纖維蛋白沉積和降解之間的平衡，其相互作用決定了腹膜腔纖溶系統(tǒng)的活性。TGF-β 是多肽鏈組成的二聚體，TGF-β1是TGF-β家族中重要的促纖維化因子，是目前已知對纖維化形成和發(fā)展等關(guān)鍵細(xì)胞因子，可刺激間質(zhì)細(xì)胞增殖產(chǎn)生 ECM，誘導(dǎo)體內(nèi)各種組織纖維化反應(yīng)[12-14]。

本次研究結(jié)果顯示，開腹組術(shù)中關(guān)腹前血清 t-PA和組織 TGF-β 蛋白、TGF-β 基因表達(dá)均高于腹腔鏡A組和B組患者，開腹組術(shù)中血清 PAI-1 低于腹腔鏡A組和B組患者。提示傳統(tǒng)開腹手術(shù)引起術(shù)后腹腔粘連形成的可能性大，過表達(dá)的 TGF-β1 誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞過度增殖與膠原合成。手術(shù)損傷腹腔，TGF-β1被激活并過量表達(dá)，激活 TGF-β1/Smad 信號通路，上調(diào)下游 PAI-1 的表達(dá)，下調(diào)腹膜內(nèi) t-PA 表達(dá)，增強(qiáng)成纖維細(xì)胞活性，抑制腹膜纖溶活性，促進(jìn)成纖維細(xì)胞的過量增殖及毛細(xì)血管長入，促進(jìn)多種膠原蛋白合成并在受損部位沉積，誘發(fā)粘連帶的形成[15-17]。纖維溶解酶作為體內(nèi)纖維蛋白降解的重要參與者，其活化主要依靠 t-PA，t-PA 能激活纖溶酶原為纖溶酶，將纖維蛋白原和纖維蛋白降解，降低纖維的合成。t-PA 可被體內(nèi)的 PAI-1所拮抗，受其調(diào)節(jié)[18-19]。本次研究結(jié)果顯示，術(shù)后1 d、2 d、3 d，腹膜 t-PA明顯下降、PAI-1明顯增加，引起術(shù)后粘連的可能性也增加。隨著手術(shù)時間延長，纖維蛋白原的釋放和纖維蛋白原的溶解之間的失衡加劇，增加術(shù)后粘連的可能性。腹腔鏡手術(shù)對腹膜的損傷小，術(shù)中氣腹使組織創(chuàng)面相互分離，降低接觸機(jī)會，術(shù)后腹膜縫線反應(yīng)輕，均有效降低了腹膜粘連程度[20]。腹腔鏡中，氣腹的特定情況可能激活了形成粘連的各種機(jī)制，氣體的選擇、濕度、溫度和腹內(nèi)壓可能決定了粘連的形成和血漿纖維蛋白溶解系統(tǒng)的活性，需要進(jìn)一步進(jìn)行研究。

綜上所述，開腹組患者PAI-1、TGF-β蛋白和基因表達(dá)呈現(xiàn)較強(qiáng)表達(dá)，PAI-1隨著手術(shù)時間的延長而增加，濃度顯著降低，隨著手術(shù)時間的延長而下降。腹腔鏡術(shù)通過降低腹膜在受到損傷TGF-β1和PAI-1的過表達(dá)，上調(diào)t-PA，實現(xiàn)防治術(shù)后腹膜粘連發(fā)生和發(fā)展。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 曾薇薇，姚吉龍，史文娟，等.氧化再生纖維素防粘連膜在重度宮腔粘連治療中的作用及其對轉(zhuǎn)化生長因子 β1表達(dá)的影響[J].現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn)展，2016，25（1）：22-25.

[2] Tuncal SD，Kismet K，Kilicoglu B，et al. Evaluation of intraabdominaladhesion generating potentials of ankaferd and calcium alginate used as hemostatic agents[J].Bratislavske lekarske listy，2014，115（9）：544-549.

[3] 付娟，楊欣，羅愛華，等.轉(zhuǎn)化生長因子 β1 基因多態(tài)性與結(jié)直腸癌的相關(guān)性分析[J]. 中國腫瘤臨床與康復(fù)，2016，23（1）：33-35.

[4] 劉國濤，陳巧，金麗明.丹參多酚酸鹽聯(lián)合聚維酮碘預(yù)防大鼠術(shù)后腸粘連[J].浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志，2015，25（6）：538-541.

[5] 何笑云，于萍，歐春麟，等.高糖高溶血磷脂膽堿對系膜細(xì)胞產(chǎn)生纖維連接蛋白、Ⅳ 型膠原及轉(zhuǎn)化生長因子-β1的影響[J].中國糖尿病雜志，2016，24（2）：156-158.

[6] Hong GS，Schwandt T，Stein K，et al. Effects of macrophage-dependent peroxisome proliferator-activated receptor γ signalling on adhesion formation after abdominal surgery in an experimental model[J]. The British journal of surgery，2015，102（12）：1506-1516.

[7] 時文曉.應(yīng)用羧氨基葡聚多糖鈉生物膠保護(hù)組織 t-PA 活性對預(yù)防腸粘連的臨床觀察[J].中國實用醫(yī)藥，2013，8（35）：153-154.

[8] 林思，秦飛，宋路瑤.丹參酮 IIA 磺酸鈉通過增強(qiáng)腹膜纖溶系統(tǒng)活性降低大鼠術(shù)后腹膜粘連發(fā)生[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2016，36（2）：260-264.

[9] Inoue M，Shiraga F，Shirakata Y，et al.Subretinal injection of recombinant tissue plasminogenactivator for submacular hemorrhage associated with ruptured retinal arterial macroaneurysm[J].Graefe's archive for clinical and experimental ophthalmology，2015，253（10）：1663-1669.

[10] 蔣仕祥，杜小蓉.纖溶酶原激活物抑制劑-1、脂聯(lián)素、白介素-1與妊娠期糖尿病的關(guān)系[J].南昌大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2014，54（8）：70-72.

[11] Correa-Rovelo JM，Villanueva-López GC，Medina-Santillan R，et al.Intestinal obstruction secondary to postoperative adhesion formation in abdominal surgery. Review[J].Cirugia Y Cirujanos，2015，83（4）：345-351.

[12] Mitra A，Luna JI，Marusina AI，et al. Dual mTOR Inhibition Is Required to Prevent TGF-β-Mediated Fibrosis： Implications for Scleroderma[J].The Journal of investigative dermatology，2015，135（11）：2873-2876.

[13] 張亞丹，潘瑞艷，臧寶霞，等.羥基紅花黃色素 A 抑制轉(zhuǎn)化生長因子-β1誘導(dǎo)的與肺纖維化相關(guān)信號通路的機(jī)制研究[J].心肺血管病雜志，2016，35（2）：145-149.

[14] 師偉，徐麗，李自發(fā)，等.IUD 避孕大鼠模型無創(chuàng)法與開腹法建模宮腔沖洗液t-PA、AKP、CA 含量及造模效率的研究[J].中國婦幼保健，2014，29（18）：2964-2967.

[15] 王晚露，馬彩玲，吳強(qiáng)強(qiáng)，等.防粘連措施預(yù)防術(shù)后盆腹腔粘連有效性及安全性的meta 分析[J].現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn)展，2016，25（2）：106-111.

[16] Samarakoon R，Overstreet JM，Higgins SP，et al.TGF-β1 →SMAD/p53/USF2→PAI-1 transcriptional axis in ureteralobstruction-induced renal fibrosis[J]. Cell Tissue Res，2012，347（1）：117-128.

[17] Shimomura M，Hinoi T，Ikeda S，et al. Preservation of peritoneal fibrinolysis owing to decreased transcription of plasminogen activator inhibitor- 1 in peritoneal mesothelial cells suppresses postoperative adhesion formation in laparoscopic surgery[J].Surgery，2013，153（3）：344-356 .

[18] 張琦釩.TGF-β1/Smad 通路對機(jī)械力誘導(dǎo)的膠原代謝調(diào)控的研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述， 2016，22（2）：209-212.

[19] Piotrowski WJ，Kisza kiewicz J，Gorski P，et al. Immunoexpression of TGF-beta/Smad and VEGF-A proteins in serum and BAL fluid of sarcoidosis patients[J]. BMC Immunol，2015，16：58-60.

[20] 申寬宏，黃東，吳偉熾，等.機(jī)械壓應(yīng)力通過 TGF-β1通路治療增生性瘢痕的分子機(jī)制研究[J].中國臨床解剖學(xué)雜志，2013，31（3）：299-302 .

（收稿日期：2016-11-21）