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        轉(zhuǎn)化生長因子β對體外成熟豬卵子成熟率的影響

        2018-01-06 08:00:53陳靜波張響英金彩蓮李騰騰沈鳴揚楊二軍尹最難
        江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2017年22期
        關(guān)鍵詞:轉(zhuǎn)化生長因子體外受精

        陳靜波+張響英+金彩蓮+李騰騰+沈鳴揚+楊二軍+尹最難

        摘要: 在豬卵子的體外生產(chǎn)方面,關(guān)于卵子的體外成熟和體外受精技術(shù)目前還存在著不足,特別是豬的受精卵體外生產(chǎn)方面存在復(fù)雜的細胞質(zhì)成熟、多精子侵入率較高以及前核形成受到抑制等問題。為改善豬卵子體外成熟體系,將轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β,簡稱TGFβ)添加到體外成熟的培養(yǎng)液中,研究TGFβ對裸卵和卵丘卵母細胞復(fù)合體成熟率的影響。在沒有添加TGFβ的體外成熟培養(yǎng)液中,裸卵和卵丘卵母細胞復(fù)合體被成熟培養(yǎng)24 h,結(jié)果沒有卵子達到M-Ⅱ時期,但是在添加TGFβ的體外成熟培養(yǎng)液中,觀察到有卵子達到M-Ⅱ時期。另一方面,當卵丘卵母細胞復(fù)合體在體外成熟培養(yǎng)時,將TGFβ添加到不同培養(yǎng)階段(0~24 h或24~48 h)的培養(yǎng)液時,卵子的成熟率沒有差別。對裸卵在體外成熟培養(yǎng) 24 h 時,當在前半期添加TGFβ時(0~24 h),卵子的成熟率為59%;當在后半期添加TGFβ時(24~48 h),卵子的成熟率為57%。同樣在裸卵組中,當在全期添加TGFβ時(0~48 h),卵子的成熟率為27%;當無添加TGFβ時,卵子的成熟率為38%。前2組與后2組相比,卵子成熟率有顯著差異。

        關(guān)鍵詞: 轉(zhuǎn)化生長因子β;體外成熟;體外受精;豬卵子;卵丘卵母細胞

        中圖分類號: S828.3 文獻標志碼: A

        文章編號:1002-1302(2017)22-0176-03

        哺乳動物卵子的成熟發(fā)生在胎兒時期并且停止于前I期的雙線期,這個時期將一直持續(xù)到排卵前期[1]。在這段休止期卵子是無法完成受精的。卵子具有受精能力是在完成減數(shù)分裂到達M-Ⅱ時期,釋放第一極體的時候。哺乳動物卵子的生長必須要有外圍包裹著的卵丘細胞才能成熟。卵子在排卵之前都會保持GV期(germinal vesicle)卵母細胞狀態(tài),在促性腺激素的作用下引起生理上的反應(yīng)完成排卵。卵子開始恢復(fù)細胞核的成熟,主要表現(xiàn)在卵母細胞發(fā)生生發(fā)泡破裂(germinal vesicle breakdown,簡稱GVBD)、同源染色體的分離、第一極體的排出。在細胞質(zhì)成熟過程中,胞漿內(nèi)積累多種蛋白質(zhì)和穩(wěn)定的mRNA,線粒體會發(fā)生有效重排[2]。到排卵時,包裹著卵子的卵丘細胞已經(jīng)完全膨脹,卵子已經(jīng)達到了 M-Ⅱ 時期。這是因為在促黃體生成素(luteinizing hormone,簡稱LH)的作用下,使卵子恢復(fù)了減數(shù)分裂以及卵丘細胞的膨脹[3]。然而發(fā)生這些變化的原因也可能是在排卵之前,其他分子參與控制這些機制作用而導(dǎo)致卵子發(fā)生變化。

        最近研究表明,在某些動物的卵丘卵母細胞復(fù)合體和由卵泡包裹的卵子中,減數(shù)分裂的恢復(fù)是由表皮生長因子(epidermal growth factor,簡稱EGF)、轉(zhuǎn)化生長因子α(transforming growth factor-α,簡稱TGFα)、轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β,簡稱TGFβ)所引起的[4-6]。TGFβ是一種多功能的細胞活化素并且具有多種形式。它們屬于一個大的基因家族,在細胞生長方面扮演著許多角色,比如分化、遷移以及細胞外基質(zhì)的形成、細胞表面分子表達的調(diào)節(jié)。對不同的基因,TGFβ也有許多種類。據(jù)報道,1985年已經(jīng)克隆出來人類的TGFβ的cDNA序列,現(xiàn)在稱之為TGFβ-1[7]。 1987年從牛骨頭里分離出1種多肽物質(zhì),能合成膠原蛋白,與TGFβ-1表現(xiàn)出71%的同源性,后來被命名為 TGFβ-2。第3種TGFβ被命名為TGFβ3,與TGFβ-1和TGFβ-2 相比,分別表現(xiàn)出76%和80%的同源性。在哺乳動物的細胞里3種TGFβ都能得以表達。TGFβ-1是由390個氨基酸組成的。實際上所有的細胞都具有TGFβ-1接受體,它們能控制細胞的許多功能。據(jù)報道有9個膜蛋白和TGFβ相結(jié)合。

        調(diào)解卵子成熟的主要是卵丘細胞。據(jù)報道,卵丘細胞提供給卵子營養(yǎng)和其他物質(zhì),以及完成相互通信是通過縫隙連接完成的。卵丘細胞和卵子之間縫隙連接對于細胞間的相互作用,特別是對旁分泌和內(nèi)分泌的調(diào)節(jié)是非常重要的。因此,本研究主要探討TGFβ對與體外成熟培養(yǎng)的卵子以及卵丘卵母細胞復(fù)合體成熟率的影響。

        1 材料與方法

        1.1 卵子的準備

        豬的卵巢取自江蘇省泰州市城郊屠宰場,放入35~37 ℃的085%生理鹽水中帶回實驗室。試驗人員在顯微鏡下用嘴吸住特制吸管,將存在于TALP緩沖液(Tyrodes Albumin Lactate Pyruvate:紅細胞裂解液,含0.1%的聚乙烯醇)的卵丘卵母細胞吸出。每15個卵子放進100 μL不含牛血清的NCSU23培養(yǎng)液中。此培養(yǎng)液中含有10%的豬卵泡液、0.6 mmol/L 半胱氨酸、10 IU/mL人體絨毛促性腺激素、10 IU/mL 孕馬血清促性腺激素,培養(yǎng)液小滴被礦物油所覆蓋,在 38.5 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24~48 h。

        1.2 試驗設(shè)計

        在第1個試驗中,將不同濃度的TGFβ-1(0、1、5、 10 ng/mL)添加到成熟培養(yǎng)液中,評定卵丘卵母細胞的成熟率。

        在第2個試驗中,將裸卵和卵丘卵母細胞保存在含有和不含有TGFβ-1(1 ng/mL)的培養(yǎng)液中24、48 h后,評定裸卵和卵丘卵母細胞的成熟率。

        在第3個試驗中,將裸卵或卵丘卵母細胞復(fù)合體培養(yǎng)在含有或者不含有TGFβ-1(1 ng/mL)的培養(yǎng)液中。將 TGFβ-1添加到培養(yǎng)液中的時間段分別是體外培養(yǎng)0~24 h、24~48 h、0~48 h。

        1.3 卵子成熟的評估

        試驗最后,用吸管反復(fù)去除卵丘細胞,把裸卵放在載玻片的中心,蓋上蓋玻片。將載玻片放入25%的醋酸中浸泡2~3 d,加1%的苔紅素染色,浸泡在45%的醋酸中。用?;视统ザ嘤嗟娜玖?,并放在倒位相位差顯微鏡下,放大200~400倍觀察。endprint

        卵子被分為GV期(germinal vesicle)、P-Ⅰ期(prophase- Ⅰ)、M-Ⅰ期(metaphase-Ⅰ)、T-Ⅰ期(telophase-Ⅰ)和M-Ⅱ期(metaphase-Ⅱ)。

        1.4 統(tǒng)計分析

        采用SAS軟件對數(shù)據(jù)進行整理與分析,應(yīng)用ANOVA作方差分析(α=0.05)。

        2 結(jié)果與分析

        在第1個試驗中,當將卵丘卵母細胞復(fù)合體培養(yǎng)在添加不同濃度的TGFβ-1培養(yǎng)液時,卵丘卵母細胞復(fù)合體到達 M-Ⅱ時期的比例分別是53%(42/79)、69%(61/88)、64%(57/89)、52%(31/60)(表1)。

        為檢測TGFβ和卵丘細胞對卵子體外成熟率的影響,將裸卵和卵丘卵母細胞復(fù)合體體外成熟培養(yǎng)24 h,在裸卵和卵丘卵母細胞復(fù)合體中,一組在培養(yǎng)液中添加TGFβ,而另一組不在培養(yǎng)液中添加TGFβ。結(jié)果表明,無論是裸卵還是卵丘卵母細胞復(fù)合體,在培養(yǎng)液中添加TGFβ的組中,卵丘卵母細胞復(fù)合體和裸卵的成熟率分別是5%、4%,而沒有添加TGFβ的培養(yǎng)液中,卵丘卵母細胞復(fù)合體和裸卵的成熟率均是0(表2)。

        然而在體外成熟培養(yǎng)48 h后,在添加TGFβ、未添加TGFβ組中卵丘卵母細胞復(fù)合體達到M-Ⅱ成熟階段的比例分別是70%、52%;裸卵組中的成熟率分別是35%、26%,卵丘卵母細胞組的成熟率比裸卵組的成熟率有所提高(表3)。

        在第3個試驗中,將卵子培養(yǎng)在含有或不含有TGFβ(1 ng/mL)的各個時間段培養(yǎng)液中。在卵丘卵母細胞組中,卵子的成熟率無顯著差異。然而,當卵子處于裸卵狀態(tài)時,與TGFβ暴露在培養(yǎng)液的時間是0~24 h、24~48 h時(卵子成熟率為27%),以及在這2個時間段中均無添加TGFβ的培養(yǎng)液(卵子的成熟率38%)相比,當TGFβ暴露在培養(yǎng)液的時間分別是0~24 h(卵子成熟率為59%)、24~48 h(卵子成熟率為57%)時,后2組卵子成熟率有顯著提高(表4)。

        3 結(jié)論與討論

        卵子為受精做準備,不僅要發(fā)生減數(shù)分裂而且細胞質(zhì)也要經(jīng)歷極重要的變化,包括卵子將獲得支持精子染色質(zhì)的去凝縮作用和隨后的雄性前核形成的能力。盡管在體外卵子核的成熟能夠自發(fā)地完成,但是體外成熟的卵子可能缺少使精子去凝縮和雄性前核形成的能力。Yoshida等認為卵丘細胞在細胞質(zhì)成熟方面扮演了一個重要的角色[4]。Zheng等認為,當被卵丘細胞包裹的卵子在含有卵泡液和卵泡膜細胞的培養(yǎng)液中培養(yǎng)時,會加強細胞質(zhì)的成熟[5]。這些結(jié)果表明,卵泡細胞能通過旁分泌和自分泌來分泌一些能夠調(diào)節(jié)細胞質(zhì)成熟的因子。生長因子類似轉(zhuǎn)化生長因子(TGFβ),已經(jīng)被證實能夠刺激或加強卵子細胞核的成熟。最近的研究主要集中在解釋TGFβ-1的信號傳播途徑方面。據(jù)證明,Type-Ⅰ和Type-Ⅱ受體依靠TGFβ-1形成了1個異側(cè)的復(fù)合體。TGFβ-1連接Type-I和Type-Ⅱ受體的復(fù)合體觸發(fā)了 Type-Ⅱ組的絲氨酸和蘇氨酸蛋白激酶區(qū)域。這些蛋白激酶的活性是刺激磷脂酸C(phospholipase C,簡稱PLC)來打斷細胞膜的纖維醇磷脂從而形成纖維醇三磷酸鹽(inositol phosphate three,簡稱IP3)[6]。鈣的濃度對維持抑制哺乳動物的卵子減數(shù)分裂具有重要的作用。在小鼠的裸卵及倉鼠的裸卵和卵丘卵母細胞中,細胞外高濃度的鈣會使抑制卵子減數(shù)分裂的作用消失。然而卵子減數(shù)分裂的發(fā)展進程依靠于細胞外部鈣的濃度,最近研究表明主要集中在細胞內(nèi)部鈣的運用和減數(shù)分裂的恢復(fù)。表明這種關(guān)系非直接的證據(jù)是運用新霉素,一種假定的磷酸肌醇逆轉(zhuǎn)率抑制劑,在豬和牛的卵子中它能阻止卵母細胞發(fā)生生發(fā)泡破裂。這就意味著纖維醇三磷酸鹽(IP3)可能與引發(fā)減數(shù)分裂恢復(fù)有關(guān)。

        本研究探討TGFβ對卵子和卵丘細胞成熟的作用效果。然而,將卵丘卵母細胞復(fù)合體添加到不同濃度的TGFβ-1的培養(yǎng)液時,卵子的成熟率沒有差別(表1)。在其他研究中表明,TGFβ能刺激大鼠和小鼠的成熟。TGFβ能在結(jié)構(gòu)和功能上調(diào)節(jié)EGF,一種能在體外刺激豬卵母細胞成熟的激素。

        TGFβ能因物種、培養(yǎng)條件以及被評估的類固醇不同而刺激或者抑制細胞的生長或者分化。TGFβ抑制細胞生長的能力應(yīng)該與細胞的分化狀態(tài)有關(guān)。體外培養(yǎng)4 d后,牛卵丘細胞在細胞周期功能上的分化、形態(tài)上的改變以及生成類固醇應(yīng)答等方面的弱化,可能反映出牛卵丘細胞上TGFβ受體缺乏或者其對TGFβ敏感性的減弱。

        結(jié)果表明,TGFβ不會影響體外成熟培養(yǎng)24 h的裸卵和卵丘卵母細胞復(fù)合體的成熟率(表2)。然而,當體外培養(yǎng) 24 h 后,TGFβ對裸卵和卵丘卵母細胞復(fù)合體恢復(fù)減數(shù)分裂具有一種有效的刺激作用。相反,繆勒管抑制物質(zhì)能關(guān)閉對于TGFβ的同源性,抑制大鼠卵子的自然成熟。盡管TGFβ單獨對于大鼠的自發(fā)卵子成熟沒有作用,但是它能在體外抑制LH引導(dǎo)的卵子成熟。

        卵丘卵母細胞復(fù)合體是由卵丘細胞和卵子構(gòu)成的,二者之間在形態(tài)和功能上的連接是通過異種間的縫隙連接完成的。據(jù)報道,卵丘細胞和卵子之間通過縫隙連接進行雙向的信息交換。對于縫隙連接關(guān)于減數(shù)分裂成熟的關(guān)系有2種解釋。第1種理論認為,縫隙連接作為一種媒介可以從卵丘細胞傳送抑制物質(zhì)給卵子。第2種理論認為,由于激素的作用會對卵丘細胞產(chǎn)生刺激,這種刺激又是通過縫隙連接傳給卵子而刺激其成熟。由于TGFβ不能直接支持裸卵或者卵丘卵母細胞復(fù)合體的自發(fā)成熟,這一結(jié)果似乎更接近于第2種理論假設(shè)。

        本研究結(jié)果表明,當將TGFβ添加到培養(yǎng)液的不同階段時,TGFβ能促進體外成熟培養(yǎng)時豬裸卵的成熟(表4)。由于TGFβ和卵丘細胞間的相互作用,TGFβ在豬卵子體外成熟培養(yǎng)時需要24 h,免疫組織化學(xué)的研究表明,TGFβ存在于大鼠和牛的莢膜細胞、細胞間質(zhì)細胞中以及大鼠排卵之前的卵泡中。

        綜上所述,TGFβ能刺激豬卵子細胞核的成熟。這些結(jié)果意味著對體外成熟的豬卵子,卵丘細胞是關(guān)鍵的,但是TGFβ能促進裸卵的成熟。endprint

        本研究主要探討TGFβ和卵丘細胞對豬卵子體外成熟的影響。將卵母細胞放在不同濃度的TGFβ培養(yǎng)液中體外成熟培養(yǎng)時,不同濃度的TGFβ對卵子的成熟率沒有差異。當體外成熟培養(yǎng)24 h后,在添加TGFβ的培養(yǎng)液中,裸卵發(fā)展到 M-Ⅱ階段。在添加TGFβ組中,裸卵和卵丘卵母復(fù)合體中,體外成熟培養(yǎng)48 h后,卵子的成熟率分別為35%、70%;在不添加TGFβ組中,裸卵和卵丘卵母細胞復(fù)合體的成熟率分別是26%、52%。當將TGFβ添加到不同培養(yǎng)階段的培養(yǎng)液中體外成熟培養(yǎng)時,卵丘卵母細胞復(fù)合體的成熟率在添加TGFβ不同階段時,成熟率達到了54%~71%。在裸卵組中,當添加TGFβ在0~24 h時,卵子的成熟率為59%,當添加TGFβ在24~48 h時,卵子的成熟率是57%。在裸卵中,0~48 h階段均未添加TGFβ,裸卵的成熟率為38%,可見,添加TGFβ組的裸卵的成熟率(57%和59%)與0~48 h階段均未添加TGFβ的組(38%)相比,差異顯著。總之,TGFβ能促進豬卵子細胞核的成熟,卵丘細胞對卵子成熟起到關(guān)鍵作用,同時TGFβ能促進裸卵的成熟。

        參考文獻:

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