陳靜波+張響英+金彩蓮+李騰騰+沈鳴揚+楊二軍+尹最難

摘要： 在豬卵子的體外生產(chǎn)方面，關(guān)于卵子的體外成熟和體外受精技術(shù)目前還存在著不足，特別是豬的受精卵體外生產(chǎn)方面存在復(fù)雜的細胞質(zhì)成熟、多精子侵入率較高以及前核形成受到抑制等問題。為改善豬卵子體外成熟體系，將轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，簡稱TGFβ）添加到體外成熟的培養(yǎng)液中，研究TGFβ對裸卵和卵丘卵母細胞復(fù)合體成熟率的影響。在沒有添加TGFβ的體外成熟培養(yǎng)液中，裸卵和卵丘卵母細胞復(fù)合體被成熟培養(yǎng)24 h，結(jié)果沒有卵子達到M-Ⅱ時期，但是在添加TGFβ的體外成熟培養(yǎng)液中，觀察到有卵子達到M-Ⅱ時期。另一方面，當卵丘卵母細胞復(fù)合體在體外成熟培養(yǎng)時，將TGFβ添加到不同培養(yǎng)階段（0～24 h或24～48 h）的培養(yǎng)液時，卵子的成熟率沒有差別。對裸卵在體外成熟培養(yǎng) 24 h 時，當在前半期添加TGFβ時（0～24 h），卵子的成熟率為59%；當在后半期添加TGFβ時（24～48 h），卵子的成熟率為57%。同樣在裸卵組中，當在全期添加TGFβ時（0～48 h），卵子的成熟率為27%；當無添加TGFβ時，卵子的成熟率為38%。前2組與后2組相比，卵子成熟率有顯著差異。

關(guān)鍵詞： 轉(zhuǎn)化生長因子β；體外成熟；體外受精；豬卵子；卵丘卵母細胞

中圖分類號： S828.3 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）22-0176-03

哺乳動物卵子的成熟發(fā)生在胎兒時期并且停止于前I期的雙線期，這個時期將一直持續(xù)到排卵前期[1]。在這段休止期卵子是無法完成受精的。卵子具有受精能力是在完成減數(shù)分裂到達M-Ⅱ時期，釋放第一極體的時候。哺乳動物卵子的生長必須要有外圍包裹著的卵丘細胞才能成熟。卵子在排卵之前都會保持GV期（germinal vesicle）卵母細胞狀態(tài)，在促性腺激素的作用下引起生理上的反應(yīng)完成排卵。卵子開始恢復(fù)細胞核的成熟，主要表現(xiàn)在卵母細胞發(fā)生生發(fā)泡破裂（germinal vesicle breakdown，簡稱GVBD）、同源染色體的分離、第一極體的排出。在細胞質(zhì)成熟過程中，胞漿內(nèi)積累多種蛋白質(zhì)和穩(wěn)定的mRNA，線粒體會發(fā)生有效重排[2]。到排卵時，包裹著卵子的卵丘細胞已經(jīng)完全膨脹，卵子已經(jīng)達到了 M-Ⅱ 時期。這是因為在促黃體生成素（luteinizing hormone，簡稱LH）的作用下，使卵子恢復(fù)了減數(shù)分裂以及卵丘細胞的膨脹[3]。然而發(fā)生這些變化的原因也可能是在排卵之前，其他分子參與控制這些機制作用而導(dǎo)致卵子發(fā)生變化。

最近研究表明，在某些動物的卵丘卵母細胞復(fù)合體和由卵泡包裹的卵子中，減數(shù)分裂的恢復(fù)是由表皮生長因子（epidermal growth factor，簡稱EGF）、轉(zhuǎn)化生長因子α（transforming growth factor-α，簡稱TGFα）、轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，簡稱TGFβ）所引起的[4-6]。TGFβ是一種多功能的細胞活化素并且具有多種形式。它們屬于一個大的基因家族，在細胞生長方面扮演著許多角色，比如分化、遷移以及細胞外基質(zhì)的形成、細胞表面分子表達的調(diào)節(jié)。對不同的基因，TGFβ也有許多種類。據(jù)報道，1985年已經(jīng)克隆出來人類的TGFβ的cDNA序列，現(xiàn)在稱之為TGFβ-1[7]。 1987年從牛骨頭里分離出1種多肽物質(zhì)，能合成膠原蛋白，與TGFβ-1表現(xiàn)出71%的同源性，后來被命名為 TGFβ-2。第3種TGFβ被命名為TGFβ3，與TGFβ-1和TGFβ-2 相比，分別表現(xiàn)出76%和80%的同源性。在哺乳動物的細胞里3種TGFβ都能得以表達。TGFβ-1是由390個氨基酸組成的。實際上所有的細胞都具有TGFβ-1接受體，它們能控制細胞的許多功能。據(jù)報道有9個膜蛋白和TGFβ相結(jié)合。

調(diào)解卵子成熟的主要是卵丘細胞。據(jù)報道，卵丘細胞提供給卵子營養(yǎng)和其他物質(zhì)，以及完成相互通信是通過縫隙連接完成的。卵丘細胞和卵子之間縫隙連接對于細胞間的相互作用，特別是對旁分泌和內(nèi)分泌的調(diào)節(jié)是非常重要的。因此，本研究主要探討TGFβ對與體外成熟培養(yǎng)的卵子以及卵丘卵母細胞復(fù)合體成熟率的影響。

1 材料與方法

1.1 卵子的準備

豬的卵巢取自江蘇省泰州市城郊屠宰場，放入35～37 ℃的085%生理鹽水中帶回實驗室。試驗人員在顯微鏡下用嘴吸住特制吸管，將存在于TALP緩沖液（Tyrodes Albumin Lactate Pyruvate：紅細胞裂解液，含0.1%的聚乙烯醇）的卵丘卵母細胞吸出。每15個卵子放進100 μL不含牛血清的NCSU23培養(yǎng)液中。此培養(yǎng)液中含有10%的豬卵泡液、0.6 mmol/L 半胱氨酸、10 IU/mL人體絨毛促性腺激素、10 IU/mL 孕馬血清促性腺激素，培養(yǎng)液小滴被礦物油所覆蓋，在 38.5 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h。

1.2 試驗設(shè)計

在第1個試驗中，將不同濃度的TGFβ-1（0、1、5、 10 ng/mL）添加到成熟培養(yǎng)液中，評定卵丘卵母細胞的成熟率。

在第2個試驗中，將裸卵和卵丘卵母細胞保存在含有和不含有TGFβ-1（1 ng/mL）的培養(yǎng)液中24、48 h后，評定裸卵和卵丘卵母細胞的成熟率。

在第3個試驗中，將裸卵或卵丘卵母細胞復(fù)合體培養(yǎng)在含有或者不含有TGFβ-1（1 ng/mL）的培養(yǎng)液中。將 TGFβ-1添加到培養(yǎng)液中的時間段分別是體外培養(yǎng)0～24 h、24～48 h、0～48 h。

1.3 卵子成熟的評估

試驗最后，用吸管反復(fù)去除卵丘細胞，把裸卵放在載玻片的中心，蓋上蓋玻片。將載玻片放入25%的醋酸中浸泡2～3 d，加1%的苔紅素染色，浸泡在45%的醋酸中。用?；视统ザ嘤嗟娜玖?，并放在倒位相位差顯微鏡下，放大200～400倍觀察。endprint

卵子被分為GV期（germinal vesicle）、P-Ⅰ期（prophase- Ⅰ）、M-Ⅰ期（metaphase-Ⅰ）、T-Ⅰ期（telophase-Ⅰ）和M-Ⅱ期（metaphase-Ⅱ）。

1.4 統(tǒng)計分析

采用SAS軟件對數(shù)據(jù)進行整理與分析，應(yīng)用ANOVA作方差分析（α=0.05）。

2 結(jié)果與分析

在第1個試驗中，當將卵丘卵母細胞復(fù)合體培養(yǎng)在添加不同濃度的TGFβ-1培養(yǎng)液時，卵丘卵母細胞復(fù)合體到達 M-Ⅱ時期的比例分別是53%（42/79）、69%（61/88）、64%（57/89）、52%（31/60）（表1）。

為檢測TGFβ和卵丘細胞對卵子體外成熟率的影響，將裸卵和卵丘卵母細胞復(fù)合體體外成熟培養(yǎng)24 h，在裸卵和卵丘卵母細胞復(fù)合體中，一組在培養(yǎng)液中添加TGFβ，而另一組不在培養(yǎng)液中添加TGFβ。結(jié)果表明，無論是裸卵還是卵丘卵母細胞復(fù)合體，在培養(yǎng)液中添加TGFβ的組中，卵丘卵母細胞復(fù)合體和裸卵的成熟率分別是5%、4%，而沒有添加TGFβ的培養(yǎng)液中，卵丘卵母細胞復(fù)合體和裸卵的成熟率均是0（表2）。

然而在體外成熟培養(yǎng)48 h后，在添加TGFβ、未添加TGFβ組中卵丘卵母細胞復(fù)合體達到M-Ⅱ成熟階段的比例分別是70%、52%；裸卵組中的成熟率分別是35%、26%，卵丘卵母細胞組的成熟率比裸卵組的成熟率有所提高（表3）。

在第3個試驗中，將卵子培養(yǎng)在含有或不含有TGFβ（1 ng/mL）的各個時間段培養(yǎng)液中。在卵丘卵母細胞組中，卵子的成熟率無顯著差異。然而，當卵子處于裸卵狀態(tài)時，與TGFβ暴露在培養(yǎng)液的時間是0～24 h、24～48 h時（卵子成熟率為27%），以及在這2個時間段中均無添加TGFβ的培養(yǎng)液（卵子的成熟率38%）相比，當TGFβ暴露在培養(yǎng)液的時間分別是0～24 h（卵子成熟率為59%）、24～48 h（卵子成熟率為57%）時，后2組卵子成熟率有顯著提高（表4）。

3 結(jié)論與討論

卵子為受精做準備，不僅要發(fā)生減數(shù)分裂而且細胞質(zhì)也要經(jīng)歷極重要的變化，包括卵子將獲得支持精子染色質(zhì)的去凝縮作用和隨后的雄性前核形成的能力。盡管在體外卵子核的成熟能夠自發(fā)地完成，但是體外成熟的卵子可能缺少使精子去凝縮和雄性前核形成的能力。Yoshida等認為卵丘細胞在細胞質(zhì)成熟方面扮演了一個重要的角色[4]。Zheng等認為，當被卵丘細胞包裹的卵子在含有卵泡液和卵泡膜細胞的培養(yǎng)液中培養(yǎng)時，會加強細胞質(zhì)的成熟[5]。這些結(jié)果表明，卵泡細胞能通過旁分泌和自分泌來分泌一些能夠調(diào)節(jié)細胞質(zhì)成熟的因子。生長因子類似轉(zhuǎn)化生長因子（TGFβ），已經(jīng)被證實能夠刺激或加強卵子細胞核的成熟。最近的研究主要集中在解釋TGFβ-1的信號傳播途徑方面。據(jù)證明，Type-Ⅰ和Type-Ⅱ受體依靠TGFβ-1形成了1個異側(cè)的復(fù)合體。TGFβ-1連接Type-I和Type-Ⅱ受體的復(fù)合體觸發(fā)了 Type-Ⅱ組的絲氨酸和蘇氨酸蛋白激酶區(qū)域。這些蛋白激酶的活性是刺激磷脂酸C（phospholipase C，簡稱PLC）來打斷細胞膜的纖維醇磷脂從而形成纖維醇三磷酸鹽（inositol phosphate three，簡稱IP3）[6]。鈣的濃度對維持抑制哺乳動物的卵子減數(shù)分裂具有重要的作用。在小鼠的裸卵及倉鼠的裸卵和卵丘卵母細胞中，細胞外高濃度的鈣會使抑制卵子減數(shù)分裂的作用消失。然而卵子減數(shù)分裂的發(fā)展進程依靠于細胞外部鈣的濃度，最近研究表明主要集中在細胞內(nèi)部鈣的運用和減數(shù)分裂的恢復(fù)。表明這種關(guān)系非直接的證據(jù)是運用新霉素，一種假定的磷酸肌醇逆轉(zhuǎn)率抑制劑，在豬和牛的卵子中它能阻止卵母細胞發(fā)生生發(fā)泡破裂。這就意味著纖維醇三磷酸鹽（IP3）可能與引發(fā)減數(shù)分裂恢復(fù)有關(guān)。

本研究探討TGFβ對卵子和卵丘細胞成熟的作用效果。然而，將卵丘卵母細胞復(fù)合體添加到不同濃度的TGFβ-1的培養(yǎng)液時，卵子的成熟率沒有差別（表1）。在其他研究中表明，TGFβ能刺激大鼠和小鼠的成熟。TGFβ能在結(jié)構(gòu)和功能上調(diào)節(jié)EGF，一種能在體外刺激豬卵母細胞成熟的激素。

TGFβ能因物種、培養(yǎng)條件以及被評估的類固醇不同而刺激或者抑制細胞的生長或者分化。TGFβ抑制細胞生長的能力應(yīng)該與細胞的分化狀態(tài)有關(guān)。體外培養(yǎng)4 d后，牛卵丘細胞在細胞周期功能上的分化、形態(tài)上的改變以及生成類固醇應(yīng)答等方面的弱化，可能反映出牛卵丘細胞上TGFβ受體缺乏或者其對TGFβ敏感性的減弱。

結(jié)果表明，TGFβ不會影響體外成熟培養(yǎng)24 h的裸卵和卵丘卵母細胞復(fù)合體的成熟率（表2）。然而，當體外培養(yǎng) 24 h 后，TGFβ對裸卵和卵丘卵母細胞復(fù)合體恢復(fù)減數(shù)分裂具有一種有效的刺激作用。相反，繆勒管抑制物質(zhì)能關(guān)閉對于TGFβ的同源性，抑制大鼠卵子的自然成熟。盡管TGFβ單獨對于大鼠的自發(fā)卵子成熟沒有作用，但是它能在體外抑制LH引導(dǎo)的卵子成熟。

卵丘卵母細胞復(fù)合體是由卵丘細胞和卵子構(gòu)成的，二者之間在形態(tài)和功能上的連接是通過異種間的縫隙連接完成的。據(jù)報道，卵丘細胞和卵子之間通過縫隙連接進行雙向的信息交換。對于縫隙連接關(guān)于減數(shù)分裂成熟的關(guān)系有2種解釋。第1種理論認為，縫隙連接作為一種媒介可以從卵丘細胞傳送抑制物質(zhì)給卵子。第2種理論認為，由于激素的作用會對卵丘細胞產(chǎn)生刺激，這種刺激又是通過縫隙連接傳給卵子而刺激其成熟。由于TGFβ不能直接支持裸卵或者卵丘卵母細胞復(fù)合體的自發(fā)成熟，這一結(jié)果似乎更接近于第2種理論假設(shè)。

本研究結(jié)果表明，當將TGFβ添加到培養(yǎng)液的不同階段時，TGFβ能促進體外成熟培養(yǎng)時豬裸卵的成熟（表4）。由于TGFβ和卵丘細胞間的相互作用，TGFβ在豬卵子體外成熟培養(yǎng)時需要24 h，免疫組織化學(xué)的研究表明，TGFβ存在于大鼠和牛的莢膜細胞、細胞間質(zhì)細胞中以及大鼠排卵之前的卵泡中。

綜上所述，TGFβ能刺激豬卵子細胞核的成熟。這些結(jié)果意味著對體外成熟的豬卵子，卵丘細胞是關(guān)鍵的，但是TGFβ能促進裸卵的成熟。endprint

本研究主要探討TGFβ和卵丘細胞對豬卵子體外成熟的影響。將卵母細胞放在不同濃度的TGFβ培養(yǎng)液中體外成熟培養(yǎng)時，不同濃度的TGFβ對卵子的成熟率沒有差異。當體外成熟培養(yǎng)24 h后，在添加TGFβ的培養(yǎng)液中，裸卵發(fā)展到 M-Ⅱ階段。在添加TGFβ組中，裸卵和卵丘卵母復(fù)合體中，體外成熟培養(yǎng)48 h后，卵子的成熟率分別為35%、70%；在不添加TGFβ組中，裸卵和卵丘卵母細胞復(fù)合體的成熟率分別是26%、52%。當將TGFβ添加到不同培養(yǎng)階段的培養(yǎng)液中體外成熟培養(yǎng)時，卵丘卵母細胞復(fù)合體的成熟率在添加TGFβ不同階段時，成熟率達到了54%～71%。在裸卵組中，當添加TGFβ在0～24 h時，卵子的成熟率為59%，當添加TGFβ在24～48 h時，卵子的成熟率是57%。在裸卵中，0～48 h階段均未添加TGFβ，裸卵的成熟率為38%，可見，添加TGFβ組的裸卵的成熟率（57%和59%）與0～48 h階段均未添加TGFβ的組（38%）相比，差異顯著。總之，TGFβ能促進豬卵子細胞核的成熟，卵丘細胞對卵子成熟起到關(guān)鍵作用，同時TGFβ能促進裸卵的成熟。

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