左柯+胡建平+杜文義+梁立+劉嵬+茍小軍

摘要： HIV-1整合酶（HIV-1 IN）是目前開發(fā)抗艾滋病藥中最具潛力的藥物靶點(diǎn)之一，四聚體是該蛋白發(fā)揮生物學(xué)功能的主要聚集體形式。為了得到IN四聚體與病毒DNA的復(fù)合物，并研究其運(yùn)動(dòng)性與生物學(xué)功能的關(guān)系，采用同源模建、結(jié)構(gòu)優(yōu)化及疊落等方法，在Tn5轉(zhuǎn)座酶的基礎(chǔ)上建立了IN-DNA的復(fù)合物模型，并采用高斯網(wǎng)絡(luò)模型和各向異性網(wǎng)絡(luò)模型研究四聚體的運(yùn)動(dòng)模式。Ramachandran Plot分布和Profile-3D結(jié)果驗(yàn)證了復(fù)合物模型的合理性。運(yùn)動(dòng)模式結(jié)果表明，四聚體的N-端、C-端的運(yùn)動(dòng)有利于螯合DNA，而核心區(qū)的穩(wěn)定狀態(tài)是IN發(fā)揮整合作用的前提。分子對接結(jié)果表明，IN抑制劑更偏向于結(jié)合在四聚體中間CCD與病毒DNA結(jié)合的區(qū)域。

關(guān)鍵詞： HIV-1整合酶四聚體；病毒DNA；高斯網(wǎng)絡(luò)模型；各向異性網(wǎng)絡(luò)模型；分子對接

中圖分類號(hào)： R918-39 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）22-0032-06

艾滋?。╝cquired immune deficiency syndrome，簡稱AIDS）是由人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，簡稱HIV）[1]感染引起的具有較強(qiáng)傳染性的一種疾病，據(jù)世界衛(wèi)生組織（world health organization，簡稱WHO）統(tǒng)計(jì)[2]，截至2014年，全球有超過3 800萬人感染了艾滋病，其中受災(zāi)最嚴(yán)重的是非洲，平均1 000個(gè)5歲以下的兒童中有95個(gè)患有艾滋病。近年來，在亞洲，尤其是中國的艾滋病患者也越來越多了，因此研究抗艾滋病藥物刻不容緩。

HIV-1整合酶（integrase，簡稱IN）是HIV病毒生命周期中不可缺少的酶之一，能夠通過3′-端加工（3′-processing，簡稱3′-P）和鏈轉(zhuǎn)移（strand transfer，簡稱ST）2步反應(yīng)，將病毒DNA整合到宿主DNA上，形成新的DNA，并隨著宿主DNA的復(fù)制而復(fù)制[3-5]。因此，HIV-1整合酶是開發(fā)抗艾滋病藥物的重要靶點(diǎn)。HIV-1 IN是由288個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，折疊成3個(gè)結(jié)構(gòu)域，分別是C-端結(jié)構(gòu)域（C-terminal domain，簡稱CTD）、催化核心結(jié)構(gòu)域（catalytic core domain，簡稱CCD）和N-端結(jié)構(gòu)域（N-terminal domain，簡稱NTD）。其中NTD由1～45個(gè)氨基酸組成，含有1個(gè)保守的HHCC基序，該基序可以結(jié)合Zn2+離子，文獻(xiàn)[6]顯示，NTD可以與病毒DNA相互作用，但在體外分離后不能與DNA特異性結(jié)合[7]；另外，相關(guān)研究顯示，NTD還具有促進(jìn)IN多聚化的重要功能[8]。CCD由50～212個(gè)氨基酸組成，是IN參與催化反應(yīng)的核心結(jié)構(gòu)，含有聚核苷酸轉(zhuǎn)移酶、核酸內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，以及3個(gè)保守的氨基酸（D64、D116和E152）組成的DDE基序[9]，高度保守的DDE基序與二價(jià)金屬離子結(jié)合，共同構(gòu)成了CCD的活性中心。CTD由220～270個(gè)氨基酸組成，是3個(gè)結(jié)構(gòu)域中最不具有保守性的[10-11]。Vink等發(fā)現(xiàn)，CTD可以與病毒DNA以非特異性的方式結(jié)合[12]，另外，CTD在IN與其他蛋白的相互作用中，尤其是與逆轉(zhuǎn)錄酶的相互作用密切相關(guān)[13-14]。

研究結(jié)果表明，HIV-1 IN在人體細(xì)胞中表現(xiàn)為穩(wěn)定的四聚體，因此HIV-1 IN的四聚體結(jié)構(gòu)是HIV-1 IN能完整發(fā)揮其生物學(xué)催化功能的結(jié)構(gòu)單元[15]。但截至目前，全長的IN四聚體尚未被解析出來，這也極大地限制了基于IN結(jié)構(gòu)的藥物分子設(shè)計(jì)研究。鑒于蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（protein data bank，簡稱PDB）已經(jīng)含有IN的3個(gè)區(qū)域的片段結(jié)構(gòu)，可以通過多模板同源模建以及結(jié)構(gòu)組裝的方法獲得完整的IN四聚體模型。另外，由于IN的生命周期中是與病毒DNA的結(jié)合密切相關(guān)的，但PDB庫中沒有IN-DNA復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，因此為了更深入地研究IN的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，得到IN-DNA的復(fù)合物是十分重要的。

在所有與IN功能相似的蛋白質(zhì)中，Tn5轉(zhuǎn)座酶是相似度最好的，它與IN一樣，在核心區(qū)均存在1個(gè)類似RNaseH狀的折疊區(qū)域，并且同屬于聚核苷酸轉(zhuǎn)移酶超家族[16]。Rice等發(fā)現(xiàn)，Tn5轉(zhuǎn)座酶與IN一樣，可以通過3′-P、ST 2步反應(yīng)重排轉(zhuǎn)座子[9]。此外，Tn5轉(zhuǎn)座酶的結(jié)構(gòu)中同樣含有1個(gè)保守的DDE基序，并且可以結(jié)合二價(jià)金屬離子，Davies等人已用X-ray晶體衍射法解析出了Tn5轉(zhuǎn)座酶與病毒DNA的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)。因此，本研究使用Tn5轉(zhuǎn)座酶晶體結(jié)構(gòu)中的病毒DNA作為模板來模建完整HIV-1 IN-病毒DNA復(fù)合物結(jié)構(gòu)是合理可行的。在得到完整的IN四聚體與DNA復(fù)合物結(jié)構(gòu)后，模建結(jié)果的合理性、四聚體各個(gè)區(qū)域的運(yùn)動(dòng)情況以及與其生物學(xué)功能的關(guān)系尚需要進(jìn)一步研究。本研究將分別采用多模板同源模建、結(jié)構(gòu)疊落（structure superposition）、高斯網(wǎng)絡(luò)模型（Gaussian network model，簡稱GNM）和各向異性網(wǎng)絡(luò)模型（anisotropic network model，簡稱ANM）方法對上述重要科學(xué)問題進(jìn)行闡述。

1 體系與方法

1.1 完整HIV-1 IN四聚體結(jié)構(gòu)的模建

IN四聚體總的模建策略是先通過組裝PDB數(shù)據(jù)庫中的不同片段的晶體結(jié)構(gòu)來獲得全長二聚體結(jié)構(gòu)，再通過結(jié)構(gòu)組裝成完整四聚體。具體模建過程如下：CCD的結(jié)構(gòu)從1BL3[17]的A、C鏈得到，Mg2+的位置與1BL3中的一致；通過疊落1WJA[18]和上一步得到的CCD，得到二聚體NTD；最后，采用包含CCD、CTD的1EX4[19]搭建得到二聚體的CTD。結(jié)構(gòu)中缺失的殘基使用Discovery Studio 2.5程序補(bǔ)全，最后得到完整的IN二聚體模型。通過與1K6Y[20]進(jìn)行結(jié)構(gòu)疊落，最終得到完整的四聚體模型。采用分子優(yōu)化方法將四聚體模型進(jìn)行長時(shí)間的結(jié)構(gòu)優(yōu)化，修復(fù)一些不合理的結(jié)構(gòu)。endprint

1.2 模建結(jié)構(gòu)優(yōu)化

采用Amber程序包和Amber力場對復(fù)合物模型進(jìn)行能量優(yōu)化，溶劑采用TIP3P水模型[21]，在溶質(zhì)外圍加上1.2 nm去頭八面體水盒子，總共加入110 459個(gè)水分子，此時(shí)含水體系的總原子數(shù)為349 411個(gè)。能量優(yōu)化分為2步：首先為約束溶質(zhì)優(yōu)化[約束力常數(shù)為2.09×105 kJ/（mol·nm2）]，用最陡下降法優(yōu)化10 000步，再用共軛梯度法優(yōu)化10 000步，去約束后再分別進(jìn)行10 000步的最陡下降法和共軛梯度法優(yōu)化，收斂條件為能量梯度小于4.18×10-4 kJ/（mol·nm）。

1.3 模型的評(píng)價(jià)

對同源模建并優(yōu)化后的復(fù)合物用2種不同的方法進(jìn)行評(píng)價(jià)，分別是Ramachandran Plot、Profile-3D，具體來說Ramachandran圖中二面角適合區(qū)域的氨基酸越多，則模建結(jié)構(gòu)越可信；Profile-3D評(píng)估得到的結(jié)構(gòu)兼容性得分（verify score）越接近期望值（verify expected high score），則模建結(jié)構(gòu)質(zhì)量越好[22]。計(jì)算中各參數(shù)均設(shè)為缺省值。

1.4 高斯網(wǎng)絡(luò)模型

在GNM中，生物大分子的三維結(jié)構(gòu)被簡化為1個(gè)彈性網(wǎng)絡(luò)。在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中，Cα原子作為節(jié)點(diǎn)，在DNA/RNA結(jié)構(gòu)中，則采用三節(jié)點(diǎn)模型，節(jié)點(diǎn)之間用彈性系數(shù)固定的彈簧連接[23]。每個(gè)殘基的均方漲落（mean-square fluctuation）以及不同殘基的漲落的交叉相關(guān)性分別與Kirchhoff矩陣的逆矩陣的對角元素和非對角元素成正比， 因此，網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)可以寫成1個(gè)N×N的Kirchhoff矩陣（Γ），矩陣中的元素則可表示為[24]

式中：Rij為第i與第j個(gè)Cα原子間的距離；rc為截?cái)喟霃?。?jié)點(diǎn)i、j的均方漲落的交叉相關(guān)性可以依據(jù)式（2）求出[25]：

式中：kB為Boltzmann常數(shù)；T為絕對溫度；γ為彈性系數(shù)；Г為N×N的對稱矩陣，稱為Kirchhoff矩陣，當(dāng)節(jié)點(diǎn)在截距范圍rcGNM（本研究取7.3）內(nèi)時(shí)，非對角元素取-1，否則取0，對角元素表示每個(gè)節(jié)點(diǎn)的配位數(shù)。

根據(jù)Debye-Waller理論，描述蛋白質(zhì)內(nèi)每個(gè)原子漲落的溫度因子可寫成下式：

1.5 各向異性網(wǎng)絡(luò)模型

GNM只能提供每個(gè)節(jié)點(diǎn)的運(yùn)動(dòng)幅度，而不能得到節(jié)點(diǎn)的絕對運(yùn)動(dòng)方向信息。在ANM中，則可以提供節(jié)點(diǎn)運(yùn)動(dòng)的方向信息[26]，蛋白質(zhì)的運(yùn)動(dòng)模式由3N×3N的Hessian矩陣H 所決定：

2 結(jié)果與分析

2.1 四聚體模型的建立驗(yàn)證

IN四聚體模建的初始模板是Tn5轉(zhuǎn)座酶1BL3的核心區(qū)結(jié)構(gòu)，模建流程：將1BL3與1WJA進(jìn)行結(jié)構(gòu)疊落，得到核心區(qū)、N端區(qū)的結(jié)構(gòu)，再將該結(jié)構(gòu)與1EX4進(jìn)行疊落，得到完整的IN二聚體結(jié)構(gòu)，最后通過與1K6Y疊落，可以得到IN四聚體的結(jié)構(gòu)。1K6Y是目前為止解析出來的唯一的IN四聚體結(jié)構(gòu)，因此采用它來進(jìn)行模建的結(jié)果是合理的。

Ramachandran Plot可以用于描述蛋白質(zhì)或肽的立體結(jié)構(gòu)中肽鍵內(nèi)α-碳和羰基碳原子間鍵的旋轉(zhuǎn)度（Psi）對α-碳和氮原子間鍵的旋轉(zhuǎn)度（Phi），Psi、Phi主要用來說明蛋白質(zhì)、肽類中氨基酸的允許、不允許的構(gòu)象。從圖1可以看出，絕大部分的氨基酸均落在允許區(qū)。具體來說，有83.6%的氨基酸在最適區(qū)，97.5%的氨基酸在允許區(qū)，另外還有2.5%的氨基酸在模建不合理區(qū)?？紤]到整個(gè)模型比較大（有1 152個(gè)氨基酸），因此，2.5%的不合理氨基酸在可以接受的范圍內(nèi)。另外，通過查看這些不合理的氨基酸，發(fā)現(xiàn)它們主要分布在 P58～K71、G190～T210、R269～A282這3個(gè)區(qū)域內(nèi)，這些區(qū)域均處于IN的3個(gè)結(jié)構(gòu)域的連接區(qū)，因此對整個(gè)IN四聚體的生物學(xué)功能影響不大。

Profile-3D是一種用打分函數(shù)來檢測模型與自身氨基酸序列匹配程度的評(píng)估程序，分?jǐn)?shù)越高說明匹配度越好，模型可信度越高。用Discovery Studio 2.5中的Profile-3D程序來分析模建的IN四聚體，其中verify score、verify expected high score和verify expected low score分別為450.481、529.879和238446。由于模型的verify score大于verify expected low score，同時(shí)非常接近verify expected high score，說明模建的模型很好。從圖2-A可以看出，除了虛線以下的4個(gè)區(qū)域以外，其余氨基酸的得分均為正值，這4個(gè)區(qū)域均為IN單體的Q214～N222段α螺旋，該區(qū)域處于CCD與CTD的連接處，對IN的催化作用以及病毒DNA的結(jié)合無影響，因此模建結(jié)果比較合理。由于IN四聚體是由二聚體完全對稱得到的，所

以圖2-B給出了四聚體中二聚體（A、A′）的結(jié)構(gòu)，其中黑色部分表示圖2-A中verify score<0的區(qū)域，可以看出該區(qū)域距離IN的CCD較遠(yuǎn)，因此這些verify score為負(fù)值的氨基酸對模型的質(zhì)量以及后續(xù)的結(jié)構(gòu)研究不會(huì)產(chǎn)生很大的影響。

2.2 含病毒DNA的Tn5轉(zhuǎn)座酶結(jié)構(gòu)生物學(xué)信息分析

通過分析PDB庫中所有Tn5 轉(zhuǎn)座酶（transposase）的晶體結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，到目前為止，用X-ray解析出來的Tn5轉(zhuǎn)座酶僅有5個(gè)，如表1所示，分別為1MM8、1MUH、1MUS、3ECP和4DM0，均為大小約450個(gè)殘基的單鏈結(jié)構(gòu)，除3ECP外，結(jié)構(gòu)中均含有Mg2+或Mn2+，并且與D97或E326形成了金屬螯合，表明結(jié)構(gòu)中的金屬離子是維持Tn5轉(zhuǎn)座酶活性所必需的，這一點(diǎn)與HIV-1整合酶相同。由于1MUH中的金屬離子數(shù)與[CM（25]IN中一樣，并且具有較高的分辨率，因此本試驗(yàn)中選擇endprint

1MUH中的DNA作為模板，將1MUH與IN疊落得到IN-DNA的復(fù)合物。

2.3 HIV-1整合酶與病毒DNA復(fù)合物的獲得

由于PDB數(shù)據(jù)庫中沒有IN與病毒DNA結(jié)合的晶體結(jié)構(gòu)，因此本研究采用與IN在功能上具有高度同源性的Tn5轉(zhuǎn)座酶中的病毒DNA的晶體結(jié)構(gòu)，通過疊落的方法將其疊加到IN二聚體上。

由圖3可以看出，IN的催化核心區(qū)（1BL3的C鏈）與Tn5轉(zhuǎn)座酶（1MUH）核心區(qū)的90～360位氨基酸之間的RMSD值為2.4，具有較高的結(jié)構(gòu)同源性。圖3中藍(lán)色、青色的部分為二者結(jié)構(gòu)相同的部分，可以看出，Tn5轉(zhuǎn)座酶的核心部分與IN的CCD區(qū)具有較高的同源性，并且3個(gè)金屬M(fèi)n2+的空間位置也非常接近，都位于DNA末端與酶的催化核心區(qū)的結(jié)合部位。因此，用Tn5轉(zhuǎn)座酶與DNA結(jié)合的復(fù)合物結(jié)構(gòu)來得到IN-DNA，這個(gè)過程是合理的。

由圖4可知，從整體上看，2個(gè)二聚體通過A和B的NTD連接，并且病毒DNA的末端距離較近，而二者交匯的位置就是宿主DNA結(jié)合的部位，這樣更有利于IN將病毒DNA整合到宿主DNA上，同時(shí)也證明了模型的合理性。

2.4 復(fù)合物模型的運(yùn)動(dòng)性分析

2.4.1 柔性分布 生物大分子的運(yùn)動(dòng)可以分為快運(yùn)動(dòng)、慢運(yùn)動(dòng)2種模式。快運(yùn)動(dòng)模式具有局部諧波運(yùn)動(dòng)的特性，因此，快運(yùn)動(dòng)模式中的殘基可以看作動(dòng)力學(xué)熱點(diǎn)殘基， 對分子間的識(shí)

別具有重要作用[27-28]。而慢運(yùn)動(dòng)模式表示分子功能上的全局大幅度運(yùn)動(dòng)情況，其中第一慢運(yùn)動(dòng)模式對于生物大分子發(fā)揮其生物學(xué)功能具有重要的作用。圖5-A是快運(yùn)動(dòng)模式，其中A-K156、A-V225、A-I251、A′-I60、A′-Q62、A′-A248、A′-V260、B-K156、B-E157和B-K160處于峰值。通過觀察模型的三維結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，除了A′-I60、A′-Q62外，其余的氨基酸均位于病毒DNA結(jié)合的部位附近，并且A-K156、A′-A248、B-K156、B-E157和B-K160直接參與病毒DNA的結(jié)合，因此推測這些區(qū)域的較大運(yùn)動(dòng)幅度與DNA的運(yùn)動(dòng)有關(guān)，這將在后面繼續(xù)討論。圖5-B給出了四聚體模型的第一慢運(yùn)動(dòng)模式，縱坐標(biāo)表示節(jié)點(diǎn)均方漲落。從整體上來看，單體A和B，A′和B′的慢運(yùn)動(dòng)模式完全一樣，并且A′、B′的運(yùn)動(dòng)幅度較A、B大，這是由于A、B處于四聚體模型的內(nèi)側(cè)，與2個(gè)DNA直接結(jié)合，故它們的運(yùn)動(dòng)性較低。另外，從圖5-B中可以看出，運(yùn)動(dòng)幅度較大的分別是單體A′和B′的NTD區(qū)域，這是由于它們處于四聚體模型的最外側(cè)，因此運(yùn)動(dòng)幅度較大，這也證明了該分析的可靠性。四聚體的4個(gè)CCD區(qū)域的運(yùn)動(dòng)幅度均較小，由于DNA末端是結(jié)合在CCD區(qū)域的，因此推測其較穩(wěn)定的狀態(tài)與IN的整合作用有關(guān)。

2.4.2 運(yùn)動(dòng)相關(guān)性 運(yùn)動(dòng)相關(guān)性可以表示蛋白中每個(gè)氨基酸與其他所有殘基的運(yùn)動(dòng)方向的關(guān)系。圖6給出了模建的四聚體的運(yùn)動(dòng)相關(guān)性，并分別標(biāo)出了每個(gè)單體以及DNA的殘基范圍，可以看出，四聚體的4個(gè)單體以及病毒DNA都存在較好的內(nèi)運(yùn)動(dòng)正相關(guān)性，并且四聚體主要分為兩大運(yùn)動(dòng)區(qū)域，分別由AA′、BB′組成，說明2個(gè)二聚體都有各自相對獨(dú)立的運(yùn)動(dòng)方向，這是由于二者結(jié)合DNA的位置為相對位置的前和后，運(yùn)動(dòng)方向均朝向各自結(jié)合的DNA，所以這種運(yùn)動(dòng)模式可以使DNA的結(jié)合更加穩(wěn)定，有利于發(fā)揮IN的整合作用。另外還發(fā)現(xiàn)A、B的NTD與其他區(qū)域的運(yùn)動(dòng)方向的相關(guān)性較低，而A-NTD與B-NTD呈現(xiàn)明顯的正相關(guān)性，并且從圖5-B中看出，這2個(gè)區(qū)域的運(yùn)動(dòng)幅度較低，推測這可能與二聚體的聚合作用有關(guān)，這將在后面的運(yùn)動(dòng)方向中繼續(xù)討論。

2.4.3 慢運(yùn)動(dòng)方向分析 運(yùn)動(dòng)相關(guān)性能夠給出IN各個(gè)區(qū)域運(yùn)動(dòng)方向之間的關(guān)系，但是各個(gè)區(qū)域的絕對運(yùn)動(dòng)方向?qū)τ谘芯可锎蠓肿庸δ艿陌l(fā)揮具有更重要的作用。圖7給出了四聚體各區(qū)域的絕對運(yùn)動(dòng)方向，并畫出了運(yùn)動(dòng)示意，可以看出，運(yùn)動(dòng)最明顯的是A′、B′的NTD，方向均為朝四聚體的中心運(yùn)動(dòng)，這種運(yùn)動(dòng)模式可以減少四聚體與環(huán)境中水的接觸，增加其穩(wěn)定性；而A、B的NTD由于處于四聚體的中間，運(yùn)動(dòng)的阻力較大，因此運(yùn)動(dòng)性較弱。另外，4個(gè)單體的CTD區(qū)均向病毒DNA的結(jié)合位置運(yùn)動(dòng)，并且病毒DNA的運(yùn)動(dòng)方向也是朝向各自結(jié)合的二聚體，它們的這種運(yùn)動(dòng)模式有利于DNA的結(jié)合。而CCD區(qū)的運(yùn)動(dòng)性很弱，說明其比較穩(wěn)定，這是由于IN將病毒DNA整合到宿主DNA上主要依靠CCD來完成，因此其穩(wěn)定的狀態(tài)是IN發(fā)揮整合作用的前提，這也驗(yàn)證了圖5中的結(jié)果。從整體上來說，四聚體模型各個(gè)區(qū)域的運(yùn)動(dòng)均可以使整個(gè)體系更加穩(wěn)定，這也證明了該模型的可靠性。

2.5 分子對接

整合酶抑制劑是近年來才開發(fā)的一類抗艾滋病藥物，其中二酮酸類化合物（diketo acid，簡稱DKAs）及其衍生物最有希望成為高效低毒的整合酶抑制劑，目前上市的IN抑制劑有雷特格韋（Raltegravir，簡稱RAL）、埃替格韋（Elvitegravir，簡稱EVG）和度魯格韋（Dolutegravir，簡稱DTG），其中RAL、EVG均為DKAs衍生物。為了研究DKAs與IN四聚體的結(jié)合的偏好性，本研究將RAL與模建得到的四聚體模型進(jìn)行分子對接。

首先進(jìn)行全局搜索的分子對接，結(jié)果表明，四聚體模型主

要有6個(gè)小分子結(jié)合區(qū)域，分別是4個(gè)單體的CCD區(qū)，以及2個(gè)單體形成的二聚體中間的結(jié)合部位。圖8分別給出了RAL的結(jié)構(gòu)以及與各個(gè)結(jié)合區(qū)域的對接結(jié)果（由于RAL與單體A、B的CCD區(qū)的對接結(jié)果一樣，因此只給出了其中1個(gè)）。從打分結(jié)果上來看，圖8-B～圖8-F對應(yīng)的值分別為5235、5.026、5.098、6.279、5.964，僅從對接結(jié)果來看，圖8-E、圖8-F對應(yīng)的二聚體之間的空穴區(qū)域是小分子的最適結(jié)合區(qū)，小分子與周圍殘基形成了較多的作用。然而據(jù)文獻(xiàn)[32]報(bào)道，RAL的結(jié)合區(qū)域在IN的CCD區(qū)，并與金屬離子螯合，進(jìn)而干擾病毒DNA的結(jié)合。因此，圖8-B～圖8-D對應(yīng)的CCD區(qū)是小分子RAL實(shí)際結(jié)合的區(qū)域。雖然三者的對接打分值很接近，但是從圖8-B中可以看出，雖然由于空間位阻的原因，二酮基并未與Mg2+螯合，但RAL與D116形成了較穩(wěn)定的氫鍵，而C、D中RAL的二酮基與Mg2+距離較遠(yuǎn)，并且沒有與周圍殘基形成較強(qiáng)的作用力。另外可以看出，圖8-B的對接打分也較C、D好，因此推測小分子RAL更加偏向于結(jié)合在四聚體模型中間的CCD與病毒DNA結(jié)合的區(qū)域，這也驗(yàn)證了Dayam等的結(jié)論[33]。endprint

3 結(jié)論

采用同源模建及疊落的方法得到了IN四聚體模型，并用Tn5轉(zhuǎn)座酶結(jié)合的DNA作為病毒DNA，建立了四聚體與DNA復(fù)合物的模型。用Ramachandran Plot和Profile-3D參數(shù)驗(yàn)證了模型的可靠性，有97.5%的殘基落入允許區(qū)，僅有2.5%的殘基位于錯(cuò)誤區(qū)，整體來說，由于模建體系較大，該模建結(jié)果是可靠的。采用基于GNM、ANM的粗?；椒?，深入分析了IN-DNA四聚體模型的運(yùn)動(dòng)情況，發(fā)現(xiàn)模型的各個(gè)區(qū)域均存在較強(qiáng)的內(nèi)運(yùn)動(dòng)相關(guān)性，說明每個(gè)結(jié)構(gòu)域都有特定的運(yùn)動(dòng)方向。另外，A、B的CTD與病毒DNA呈現(xiàn)相向的運(yùn)動(dòng)，這種運(yùn)動(dòng)模式更有利于DNA的結(jié)合，并且證明 CCD區(qū)的穩(wěn)定狀態(tài)是IN發(fā)揮整合作用的前提。最后，采用分子對接方法分析了模型的4個(gè)CCD區(qū)結(jié)合小分子的偏好性，結(jié)果顯示抑制劑小分子更偏向于結(jié)合在四聚體模型中間CCD與病毒DNA結(jié)合的區(qū)域，從而干擾金屬離子的催化作用，阻礙病毒DNA與IN的結(jié)合。模建結(jié)果、運(yùn)動(dòng)性分析以及分子對接結(jié)果對于更深入認(rèn)識(shí)IN的結(jié)構(gòu)與功能，以及DKAs類IN抑制劑的新藥設(shè)計(jì)具有一定的指導(dǎo)意義。

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