徐亞維+李福新+薛建+王霞

摘要： 利用冷休克表達載體構建含有人胸腺肽α原（proTα）編碼基因的質粒并在大腸桿菌單一蛋白生產(chǎn)（SPP）系統(tǒng)中表達單一的可溶性蛋白。以proTα mRNA基因序列為模板敲出ACA序列，設計并合成proTα-lessACA目的基因片段后，直接克隆到原核冷休克表達載體pColdⅡ（sp-4）上，將pColdⅡ（sp-4）-proTα-lessACA質粒轉化到Escherichia coli BL21感受態(tài)細胞中，篩選陽性克隆后采用Nde Ⅰ和Hind Ⅲ限制性內切酶雙酶切鑒定。共轉pMazF質粒后，采用冷休克方法表達proTα并采用SDS-PAGE檢測鑒定。結果成功構建重組表達質粒pCold Ⅱ（sp-4）- proTα-lessACA，經(jīng)冷休克表達后在E. coli BL21（DE3）菌中獲得大量單一的proTα。原核表達質粒pCold Ⅱ（sp-4）- proTα-lessACA構建和單一proTα在SPP系統(tǒng)中表達的成功，為進一步研究proTα結構和生理功能提供幫助。

關鍵詞： 人胸腺肽α原；單一蛋白生產(chǎn)系統(tǒng)；冷休克表達

中圖分類號： Q786 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）22-0038-02

胸腺肽（thymosin）是一組由胸腺組織分泌的具有調節(jié)和增強人體細胞免疫功能的生物活性肽，能促使有絲分裂原激活后的外周血中的T淋巴細胞成熟，主要包括胸腺五肽、胸腺肽α和胸腺肽β等[1]。其中由Goldstein等在1977年首次分離獲得具有28個氨基酸組成的胸腺肽α1（thymosin alpha 1，Tα1），效果尤為顯著[2]，主要分布于胸腺上皮細胞，也存在于淋巴、腦、脾、肺、腎等組織細胞中[3]。Tα1在機體免疫應答中發(fā)揮重要作用，可以促進干擾素及各種淋巴介素的分泌，增強自然殺傷細胞介導的細胞毒性，是一種強效的細胞免疫增強劑[4]，廣泛應用于治療抗生素不能有效控制的嚴重感染，惡性腫瘤所致的免疫功能低下，乙型肝炎、丙型肝炎及其并發(fā)癥等[5]。Tα1最初從動物胸腺中提取，這種制備方法由于原料來源有限、含量極低、純化工藝復雜等原因逐漸被淘汰。目前臨床上所用的Tα1均為人工化學合成制備，但化學合成生產(chǎn)成本較高，合成的雜質較多，不易純化，還會造成環(huán)境污染[6]。因此，采用基因工程方法制備Tα1勢在必行。目前，Tα1雖然通過細菌或酵母菌表達成功[7]，但一直未能真正實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，其主要原因是Tα1分子量太小，難于大量表達和純化。現(xiàn)有研究表明胸腺肽α原（prothymosin alpha，proTα）在體內被修飾后具有與Tα1相同的作用[8]，故而可以考慮表達分子量較大的proTα作為新的目的蛋白。

單一蛋白生產(chǎn)（single protein production，SPP）系統(tǒng)是近幾年以大腸桿菌（Escherichia coli，E.coli）為宿主開發(fā)的一種可高效生產(chǎn)單一蛋白的表達系統(tǒng)[9]。該系統(tǒng)中含有一種核糖核酸內切酶MazF，可專一性地識別菌體mRNA中ACA序列并將其切斷，將菌體內所有含有ACA序列的mRNA降解，剔除目的基因中的ACA序列全部，而不改變氨基酸序列，其轉錄的mRNA則不能被MazF所降解。這樣在SPP系統(tǒng)中就可以單一地表達目的蛋白，而沒有明顯的背景細胞蛋白合成。本研究利用冷休克載體pColdⅡ（sp-4）構建含有proTα基因的質粒，并將其與pMazF質粒共轉于E.coli BL21（DE3）菌株中，實現(xiàn)單一proTα的高效表達。

1 材料與方法

1.1 質粒和菌株

pMzaF和pColdII（sp-4）購于寶生物工程（大連）有限公司。E. coli BL21（DE3）由筆者所在實驗室保留。

1.2 試劑

胰蛋白胨、酵母粉購于Oxiod公司，質粒提取試劑盒（E.Z.N.A.Plasmid Mini Kit I）購于OMEGA公司，限制性內切酶購于寶生物工程（大連）有限公司；SYBRGreenⅠ購于Invitrogen公司，蛋白質分子量標準購于GE有限公司，10 kb GeneRuler DNA Ladder Mix購于Fermentas公司，其他化學試劑均購于北京化工廠。

1.3 主要儀器

DYY-5 型電泳儀（北京市六一電子儀器廠），Universal Hood Ⅱ型凝膠成像儀（美國 BIO-RAD 公司），HZQ-X100型恒溫振蕩培養(yǎng)箱（黑龍江哈爾濱東聯(lián)電子技術開發(fā)公司），JY99-2D型超聲波細胞破碎儀（浙江寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.4 試驗方法

1.4.1 pColdⅡ（sp-4）-proTα-lessACA質粒的構建

根據(jù)人源proTα的mRNA序列（GenBank：M14794.1）設計在SPP系統(tǒng)中表達的proTα基因序列，采用E. coli通用密碼子將Tα原中的ACA堿基序列敲除并由上海海捷瑞生物科技有限公司合成pGH-proTα-lessACA質粒。將pGH-proTα-lessACA質粒與pColdⅡ （sp-4）質粒用Nde Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切后凝膠回收目的基因與載體基因，再用T4 DNA連接酶進行連接。雙酶切體系：pGH-proTα-lessACA與pColdⅡ（sp-4）10 μL，10×Buffer 2 μL，Nde Ⅰ 1 μL，Hind Ⅲ 1 μL，H2O 6 μL，37 ℃溫育4 h。連接體系：雙酶切后的proTα-lessACA基因4.5 μL，雙酶切后的pColdⅡ （sp-4）1.5 μL，H2O 1.5 μL，10×連接緩沖液1 μL，T4 DNA連接酶0.5 μL，16 ℃連接16 h后凝膠回收pColdⅡ （sp-4）-proTα-lessACA質粒。最后將pColdⅡ （sp-4）-proTα-lessACA質粒經(jīng)CaCl2法轉化至E. coli BL21（DE3）菌株中，再經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定和酶切鑒定。其表達的proTα的氨基酸序列為MSDAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEE AENGRDAPANGNANEENGEQEADNEVDEEEEEGGEEEEEEEE GDGEEEDGDEDEEAESATGK。endprint

1.4.2 proTα在SPP系統(tǒng)中的表達與鑒定

將pColdⅡ （sp-4）-proTα-lessACA轉入E. coli BL21（DE3）感受態(tài)細胞。經(jīng)氨芐青霉素篩選后，再將pMzaF質粒轉入已含有pColdⅡ （sp-4）-proTα-lessACA質粒的 E. coli BL21（DE3）感受態(tài)細胞，氯霉素篩選后獲得共轉細胞。采用冷休克表達方法。挑取陽性克隆，接種于5 mL LB培養(yǎng)基（含100 μg/mL Amp和34 μg/mL Cm）中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至D600 nm為0.5左右，接種于100 mL LB（含100 μg/mL Amp和34 μg/mL Cm）液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至D600 nm為0.4左右，加入IPTG（終濃度為1 mmol/L），16 ℃誘導表達5 d。在表達0、8、16、24、48、72、96、120 h時，6 000 r/min離心 10 min 收集菌體，50 mmol/L Tris-HCl（pH值8.0）緩沖液洗菌體后離心收集，加入4倍體積50 mmol/L Tris-HCl（pH值8.0）緩沖液重懸超聲后的破碎菌體，12 000 r/m離心30 min，上清用0.45 mm濾膜過濾，采用Tricine-SDS-PAGE凝膠電泳鑒定Tα1的表達[10]。采用考馬斯亮藍法測蛋白表達量，用牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）作為標準[11]。

2 結果與分析

2.1 pColdⅡ （sp-4）-proTα-lessACA質?；虻脑O計

設計適于在SPP系統(tǒng)中表達的proTα基因序列，采用E. coli通用密碼子將proTα中的ACA堿基序列全部敲除，其基因序列見圖1。

2.2 pColdⅡ （sp-4）-proTα-lessACA質粒的鑒定

構建的pColdⅡ （sp-4）-proTα-lessACA質粒經(jīng)限制性內切酶Nde Ⅰ和HindⅢ單/雙酶切后由1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結果說明質粒構建成功（圖2）。

2.3 proTα的冷休克表達與鑒定

共轉化pColdⅡ（sp-4）-proTα-lessACA質粒和pMazF質粒的E. coli BL21（DE3）受到IPTG誘導后開始表達Tα1。分別收集0、8、16、24、48、72、96、120 h的可溶性蛋白，理論上即為SPP系統(tǒng)表達的純蛋白，Tricine-SDS-PAGE凝膠電泳鑒定結果見圖3。結果顯示，在表達的第2天即可表達較純的可溶性蛋白，說明Tα1可以在SPP系統(tǒng)成功表達。在誘導120 h后，在上清液中的可溶性蛋白的最終產(chǎn)率為16.27±0.94 mg/L（BSA標準曲線為 y=0.005 26x+0.070 03，r2=0.999 8）。人源性proTα的理論分子量為9.45 ku，而在SPP系統(tǒng)中所表達的proTα由于在其N端增加了轉錄增強元件（transcription enhancer element，TEE）和6×His標簽共11個氨基酸，因此其理論分子量增加至10.97 ku。

3 結論

采用共轉法建立的SPP表達系統(tǒng)能夠在E. coli中正確高效表達proTα，其產(chǎn)量可達16 mg/L。通過SPP系統(tǒng)表達最終制備獲得了大量的proTα，可以省去純化蛋白的步驟，大大節(jié)省了純化所需的人力、物力和時間。采用SPP系統(tǒng)表達的proTα經(jīng)RP-HPLC分析，純度可達97 %以上。采用SPP系統(tǒng)冷休克表達proTα工藝簡單，整個過程約在1 周內完成，不需要純化過程即可獲得純度較高的產(chǎn)品，為利用基因工程方法大量制備proTα提供了一種簡便而又切實可行的方法。

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