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        重組人胸腺肽α原在單一蛋白生產(chǎn)系統(tǒng)中的高效表達(dá)

        2018-01-06 20:04:19徐亞維李福新薛建王霞
        江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2017年22期

        徐亞維+李福新+薛建+王霞

        摘要: 利用冷休克表達(dá)載體構(gòu)建含有人胸腺肽α原(proTα)編碼基因的質(zhì)粒并在大腸桿菌單一蛋白生產(chǎn)(SPP)系統(tǒng)中表達(dá)單一的可溶性蛋白。以proTα mRNA基因序列為模板敲出ACA序列,設(shè)計(jì)并合成proTα-lessACA目的基因片段后,直接克隆到原核冷休克表達(dá)載體pColdⅡ(sp-4)上,將pColdⅡ(sp-4)-proTα-lessACA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到Escherichia coli BL21感受態(tài)細(xì)胞中,篩選陽(yáng)性克隆后采用Nde Ⅰ和Hind Ⅲ限制性內(nèi)切酶雙酶切鑒定。共轉(zhuǎn)pMazF質(zhì)粒后,采用冷休克方法表達(dá)proTα并采用SDS-PAGE檢測(cè)鑒定。結(jié)果成功構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pCold Ⅱ(sp-4)- proTα-lessACA,經(jīng)冷休克表達(dá)后在E. coli BL21(DE3)菌中獲得大量單一的proTα。原核表達(dá)質(zhì)粒pCold Ⅱ(sp-4)- proTα-lessACA構(gòu)建和單一proTα在SPP系統(tǒng)中表達(dá)的成功,為進(jìn)一步研究proTα結(jié)構(gòu)和生理功能提供幫助。

        關(guān)鍵詞: 人胸腺肽α原;單一蛋白生產(chǎn)系統(tǒng);冷休克表達(dá)

        中圖分類(lèi)號(hào): Q786 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A

        文章編號(hào):1002-1302(2017)22-0038-02

        胸腺肽(thymosin)是一組由胸腺組織分泌的具有調(diào)節(jié)和增強(qiáng)人體細(xì)胞免疫功能的生物活性肽,能促使有絲分裂原激活后的外周血中的T淋巴細(xì)胞成熟,主要包括胸腺五肽、胸腺肽α和胸腺肽β等[1]。其中由Goldstein等在1977年首次分離獲得具有28個(gè)氨基酸組成的胸腺肽α1(thymosin alpha 1,Tα1),效果尤為顯著[2],主要分布于胸腺上皮細(xì)胞,也存在于淋巴、腦、脾、肺、腎等組織細(xì)胞中[3]。Tα1在機(jī)體免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用,可以促進(jìn)干擾素及各種淋巴介素的分泌,增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性,是一種強(qiáng)效的細(xì)胞免疫增強(qiáng)劑[4],廣泛應(yīng)用于治療抗生素不能有效控制的嚴(yán)重感染,惡性腫瘤所致的免疫功能低下,乙型肝炎、丙型肝炎及其并發(fā)癥等[5]。Tα1最初從動(dòng)物胸腺中提取,這種制備方法由于原料來(lái)源有限、含量極低、純化工藝復(fù)雜等原因逐漸被淘汰。目前臨床上所用的Tα1均為人工化學(xué)合成制備,但化學(xué)合成生產(chǎn)成本較高,合成的雜質(zhì)較多,不易純化,還會(huì)造成環(huán)境污染[6]。因此,采用基因工程方法制備Tα1勢(shì)在必行。目前,Tα1雖然通過(guò)細(xì)菌或酵母菌表達(dá)成功[7],但一直未能真正實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化,其主要原因是Tα1分子量太小,難于大量表達(dá)和純化?,F(xiàn)有研究表明胸腺肽α原(prothymosin alpha,proTα)在體內(nèi)被修飾后具有與Tα1相同的作用[8],故而可以考慮表達(dá)分子量較大的proTα作為新的目的蛋白。

        單一蛋白生產(chǎn)(single protein production,SPP)系統(tǒng)是近幾年以大腸桿菌(Escherichia coli,E.coli)為宿主開(kāi)發(fā)的一種可高效生產(chǎn)單一蛋白的表達(dá)系統(tǒng)[9]。該系統(tǒng)中含有一種核糖核酸內(nèi)切酶MazF,可專(zhuān)一性地識(shí)別菌體mRNA中ACA序列并將其切斷,將菌體內(nèi)所有含有ACA序列的mRNA降解,剔除目的基因中的ACA序列全部,而不改變氨基酸序列,其轉(zhuǎn)錄的mRNA則不能被MazF所降解。這樣在SPP系統(tǒng)中就可以單一地表達(dá)目的蛋白,而沒(méi)有明顯的背景細(xì)胞蛋白合成。本研究利用冷休克載體pColdⅡ(sp-4)構(gòu)建含有proTα基因的質(zhì)粒,并將其與pMazF質(zhì)粒共轉(zhuǎn)于E.coli BL21(DE3)菌株中,實(shí)現(xiàn)單一proTα的高效表達(dá)。

        1 材料與方法

        1.1 質(zhì)粒和菌株

        pMzaF和pColdII(sp-4)購(gòu)于寶生物工程(大連)有限公司。E. coli BL21(DE3)由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保留。

        1.2 試劑

        胰蛋白胨、酵母粉購(gòu)于Oxiod公司,質(zhì)粒提取試劑盒(E.Z.N.A.Plasmid Mini Kit I)購(gòu)于OMEGA公司,限制性內(nèi)切酶購(gòu)于寶生物工程(大連)有限公司;SYBRGreenⅠ購(gòu)于Invitrogen公司,蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)于GE有限公司,10 kb GeneRuler DNA Ladder Mix購(gòu)于Fermentas公司,其他化學(xué)試劑均購(gòu)于北京化工廠。

        1.3 主要儀器

        DYY-5 型電泳儀(北京市六一電子儀器廠),Universal Hood Ⅱ型凝膠成像儀(美國(guó) BIO-RAD 公司),HZQ-X100型恒溫振蕩培養(yǎng)箱(黑龍江哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)公司),JY99-2D型超聲波細(xì)胞破碎儀(浙江寧波新芝生物科技股份有限公司)。

        1.4 試驗(yàn)方法

        1.4.1 pColdⅡ(sp-4)-proTα-lessACA質(zhì)粒的構(gòu)建

        根據(jù)人源proTα的mRNA序列(GenBank:M14794.1)設(shè)計(jì)在SPP系統(tǒng)中表達(dá)的proTα基因序列,采用E. coli通用密碼子將Tα原中的ACA堿基序列敲除并由上海海捷瑞生物科技有限公司合成pGH-proTα-lessACA質(zhì)粒。將pGH-proTα-lessACA質(zhì)粒與pColdⅡ (sp-4)質(zhì)粒用Nde Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切后凝膠回收目的基因與載體基因,再用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接。雙酶切體系:pGH-proTα-lessACA與pColdⅡ(sp-4)10 μL,10×Buffer 2 μL,Nde Ⅰ 1 μL,Hind Ⅲ 1 μL,H2O 6 μL,37 ℃溫育4 h。連接體系:雙酶切后的proTα-lessACA基因4.5 μL,雙酶切后的pColdⅡ (sp-4)1.5 μL,H2O 1.5 μL,10×連接緩沖液1 μL,T4 DNA連接酶0.5 μL,16 ℃連接16 h后凝膠回收pColdⅡ (sp-4)-proTα-lessACA質(zhì)粒。最后將pColdⅡ (sp-4)-proTα-lessACA質(zhì)粒經(jīng)CaCl2法轉(zhuǎn)化至E. coli BL21(DE3)菌株中,再經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定和酶切鑒定。其表達(dá)的proTα的氨基酸序列為MSDAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEE AENGRDAPANGNANEENGEQEADNEVDEEEEEGGEEEEEEEE GDGEEEDGDEDEEAESATGK。endprint

        1.4.2 proTα在SPP系統(tǒng)中的表達(dá)與鑒定

        將pColdⅡ (sp-4)-proTα-lessACA轉(zhuǎn)入E. coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)氨芐青霉素篩選后,再將pMzaF質(zhì)粒轉(zhuǎn)入已含有pColdⅡ (sp-4)-proTα-lessACA質(zhì)粒的 E. coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,氯霉素篩選后獲得共轉(zhuǎn)細(xì)胞。采用冷休克表達(dá)方法。挑取陽(yáng)性克隆,接種于5 mL LB培養(yǎng)基(含100 μg/mL Amp和34 μg/mL Cm)中,37 ℃振蕩培養(yǎng)至D600 nm為0.5左右,接種于100 mL LB(含100 μg/mL Amp和34 μg/mL Cm)液體培養(yǎng)基中,37 ℃振蕩培養(yǎng)至D600 nm為0.4左右,加入IPTG(終濃度為1 mmol/L),16 ℃誘導(dǎo)表達(dá)5 d。在表達(dá)0、8、16、24、48、72、96、120 h時(shí),6 000 r/min離心 10 min 收集菌體,50 mmol/L Tris-HCl(pH值8.0)緩沖液洗菌體后離心收集,加入4倍體積50 mmol/L Tris-HCl(pH值8.0)緩沖液重懸超聲后的破碎菌體,12 000 r/m離心30 min,上清用0.45 mm濾膜過(guò)濾,采用Tricine-SDS-PAGE凝膠電泳鑒定Tα1的表達(dá)[10]。采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)蛋白表達(dá)量,用牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)作為標(biāo)準(zhǔn)[11]。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 pColdⅡ (sp-4)-proTα-lessACA質(zhì)?;虻脑O(shè)計(jì)

        設(shè)計(jì)適于在SPP系統(tǒng)中表達(dá)的proTα基因序列,采用E. coli通用密碼子將proTα中的ACA堿基序列全部敲除,其基因序列見(jiàn)圖1。

        2.2 pColdⅡ (sp-4)-proTα-lessACA質(zhì)粒的鑒定

        構(gòu)建的pColdⅡ (sp-4)-proTα-lessACA質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶Nde Ⅰ和HindⅢ單/雙酶切后由1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,結(jié)果說(shuō)明質(zhì)粒構(gòu)建成功(圖2)。

        2.3 proTα的冷休克表達(dá)與鑒定

        共轉(zhuǎn)化pColdⅡ(sp-4)-proTα-lessACA質(zhì)粒和pMazF質(zhì)粒的E. coli BL21(DE3)受到IPTG誘導(dǎo)后開(kāi)始表達(dá)Tα1。分別收集0、8、16、24、48、72、96、120 h的可溶性蛋白,理論上即為SPP系統(tǒng)表達(dá)的純蛋白,Tricine-SDS-PAGE凝膠電泳鑒定結(jié)果見(jiàn)圖3。結(jié)果顯示,在表達(dá)的第2天即可表達(dá)較純的可溶性蛋白,說(shuō)明Tα1可以在SPP系統(tǒng)成功表達(dá)。在誘導(dǎo)120 h后,在上清液中的可溶性蛋白的最終產(chǎn)率為16.27±0.94 mg/L(BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線為 y=0.005 26x+0.070 03,r2=0.999 8)。人源性proTα的理論分子量為9.45 ku,而在SPP系統(tǒng)中所表達(dá)的proTα由于在其N(xiāo)端增加了轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)元件(transcription enhancer element,TEE)和6×His標(biāo)簽共11個(gè)氨基酸,因此其理論分子量增加至10.97 ku。

        3 結(jié)論

        采用共轉(zhuǎn)法建立的SPP表達(dá)系統(tǒng)能夠在E. coli中正確高效表達(dá)proTα,其產(chǎn)量可達(dá)16 mg/L。通過(guò)SPP系統(tǒng)表達(dá)最終制備獲得了大量的proTα,可以省去純化蛋白的步驟,大大節(jié)省了純化所需的人力、物力和時(shí)間。采用SPP系統(tǒng)表達(dá)的proTα經(jīng)RP-HPLC分析,純度可達(dá)97 %以上。采用SPP系統(tǒng)冷休克表達(dá)proTα工藝簡(jiǎn)單,整個(gè)過(guò)程約在1 周內(nèi)完成,不需要純化過(guò)程即可獲得純度較高的產(chǎn)品,為利用基因工程方法大量制備proTα提供了一種簡(jiǎn)便而又切實(shí)可行的方法。

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