徐亞維+李福新+薛建+王霞

摘要： 利用冷休克表達(dá)載體構(gòu)建含有人胸腺肽α原（proTα）編碼基因的質(zhì)粒并在大腸桿菌單一蛋白生產(chǎn)（SPP）系統(tǒng)中表達(dá)單一的可溶性蛋白。以proTα mRNA基因序列為模板敲出ACA序列，設(shè)計(jì)并合成proTα-lessACA目的基因片段后，直接克隆到原核冷休克表達(dá)載體pColdⅡ（sp-4）上，將pColdⅡ（sp-4）-proTα-lessACA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到Escherichia coli BL21感受態(tài)細(xì)胞中，篩選陽(yáng)性克隆后采用Nde Ⅰ和Hind Ⅲ限制性內(nèi)切酶雙酶切鑒定。共轉(zhuǎn)pMazF質(zhì)粒后，采用冷休克方法表達(dá)proTα并采用SDS-PAGE檢測(cè)鑒定。結(jié)果成功構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pCold Ⅱ（sp-4）- proTα-lessACA，經(jīng)冷休克表達(dá)后在E. coli BL21（DE3）菌中獲得大量單一的proTα。原核表達(dá)質(zhì)粒pCold Ⅱ（sp-4）- proTα-lessACA構(gòu)建和單一proTα在SPP系統(tǒng)中表達(dá)的成功，為進(jìn)一步研究proTα結(jié)構(gòu)和生理功能提供幫助。

關(guān)鍵詞： 人胸腺肽α原；單一蛋白生產(chǎn)系統(tǒng)；冷休克表達(dá)

中圖分類(lèi)號(hào)： Q786 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）22-0038-02

胸腺肽（thymosin）是一組由胸腺組織分泌的具有調(diào)節(jié)和增強(qiáng)人體細(xì)胞免疫功能的生物活性肽，能促使有絲分裂原激活后的外周血中的T淋巴細(xì)胞成熟，主要包括胸腺五肽、胸腺肽α和胸腺肽β等[1]。其中由Goldstein等在1977年首次分離獲得具有28個(gè)氨基酸組成的胸腺肽α1（thymosin alpha 1，Tα1），效果尤為顯著[2]，主要分布于胸腺上皮細(xì)胞，也存在于淋巴、腦、脾、肺、腎等組織細(xì)胞中[3]。Tα1在機(jī)體免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，可以促進(jìn)干擾素及各種淋巴介素的分泌，增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性，是一種強(qiáng)效的細(xì)胞免疫增強(qiáng)劑[4]，廣泛應(yīng)用于治療抗生素不能有效控制的嚴(yán)重感染，惡性腫瘤所致的免疫功能低下，乙型肝炎、丙型肝炎及其并發(fā)癥等[5]。Tα1最初從動(dòng)物胸腺中提取，這種制備方法由于原料來(lái)源有限、含量極低、純化工藝復(fù)雜等原因逐漸被淘汰。目前臨床上所用的Tα1均為人工化學(xué)合成制備，但化學(xué)合成生產(chǎn)成本較高，合成的雜質(zhì)較多，不易純化，還會(huì)造成環(huán)境污染[6]。因此，采用基因工程方法制備Tα1勢(shì)在必行。目前，Tα1雖然通過(guò)細(xì)菌或酵母菌表達(dá)成功[7]，但一直未能真正實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，其主要原因是Tα1分子量太小，難于大量表達(dá)和純化?，F(xiàn)有研究表明胸腺肽α原（prothymosin alpha，proTα）在體內(nèi)被修飾后具有與Tα1相同的作用[8]，故而可以考慮表達(dá)分子量較大的proTα作為新的目的蛋白。

單一蛋白生產(chǎn)（single protein production，SPP）系統(tǒng)是近幾年以大腸桿菌（Escherichia coli，E.coli）為宿主開(kāi)發(fā)的一種可高效生產(chǎn)單一蛋白的表達(dá)系統(tǒng)[9]。該系統(tǒng)中含有一種核糖核酸內(nèi)切酶MazF，可專(zhuān)一性地識(shí)別菌體mRNA中ACA序列并將其切斷，將菌體內(nèi)所有含有ACA序列的mRNA降解，剔除目的基因中的ACA序列全部，而不改變氨基酸序列，其轉(zhuǎn)錄的mRNA則不能被MazF所降解。這樣在SPP系統(tǒng)中就可以單一地表達(dá)目的蛋白，而沒(méi)有明顯的背景細(xì)胞蛋白合成。本研究利用冷休克載體pColdⅡ（sp-4）構(gòu)建含有proTα基因的質(zhì)粒，并將其與pMazF質(zhì)粒共轉(zhuǎn)于E.coli BL21（DE3）菌株中，實(shí)現(xiàn)單一proTα的高效表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒和菌株

pMzaF和pColdII（sp-4）購(gòu)于寶生物工程（大連）有限公司。E. coli BL21（DE3）由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保留。

1.2 試劑

胰蛋白胨、酵母粉購(gòu)于Oxiod公司，質(zhì)粒提取試劑盒（E.Z.N.A.Plasmid Mini Kit I）購(gòu)于OMEGA公司，限制性內(nèi)切酶購(gòu)于寶生物工程（大連）有限公司；SYBRGreenⅠ購(gòu)于Invitrogen公司，蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)于GE有限公司，10 kb GeneRuler DNA Ladder Mix購(gòu)于Fermentas公司，其他化學(xué)試劑均購(gòu)于北京化工廠。

1.3 主要儀器

DYY-5 型電泳儀（北京市六一電子儀器廠），Universal Hood Ⅱ型凝膠成像儀（美國(guó) BIO-RAD 公司），HZQ-X100型恒溫振蕩培養(yǎng)箱（黑龍江哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)公司），JY99-2D型超聲波細(xì)胞破碎儀（浙江寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 pColdⅡ（sp-4）-proTα-lessACA質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)人源proTα的mRNA序列（GenBank：M14794.1）設(shè)計(jì)在SPP系統(tǒng)中表達(dá)的proTα基因序列，采用E. coli通用密碼子將Tα原中的ACA堿基序列敲除并由上海海捷瑞生物科技有限公司合成pGH-proTα-lessACA質(zhì)粒。將pGH-proTα-lessACA質(zhì)粒與pColdⅡ （sp-4）質(zhì)粒用Nde Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切后凝膠回收目的基因與載體基因，再用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接。雙酶切體系：pGH-proTα-lessACA與pColdⅡ（sp-4）10 μL，10×Buffer 2 μL，Nde Ⅰ 1 μL，Hind Ⅲ 1 μL，H2O 6 μL，37 ℃溫育4 h。連接體系：雙酶切后的proTα-lessACA基因4.5 μL，雙酶切后的pColdⅡ （sp-4）1.5 μL，H2O 1.5 μL，10×連接緩沖液1 μL，T4 DNA連接酶0.5 μL，16 ℃連接16 h后凝膠回收pColdⅡ （sp-4）-proTα-lessACA質(zhì)粒。最后將pColdⅡ （sp-4）-proTα-lessACA質(zhì)粒經(jīng)CaCl2法轉(zhuǎn)化至E. coli BL21（DE3）菌株中，再經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定和酶切鑒定。其表達(dá)的proTα的氨基酸序列為MSDAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEE AENGRDAPANGNANEENGEQEADNEVDEEEEEGGEEEEEEEE GDGEEEDGDEDEEAESATGK。endprint

1.4.2 proTα在SPP系統(tǒng)中的表達(dá)與鑒定

將pColdⅡ （sp-4）-proTα-lessACA轉(zhuǎn)入E. coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)氨芐青霉素篩選后，再將pMzaF質(zhì)粒轉(zhuǎn)入已含有pColdⅡ （sp-4）-proTα-lessACA質(zhì)粒的 E. coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，氯霉素篩選后獲得共轉(zhuǎn)細(xì)胞。采用冷休克表達(dá)方法。挑取陽(yáng)性克隆，接種于5 mL LB培養(yǎng)基（含100 μg/mL Amp和34 μg/mL Cm）中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至D600 nm為0.5左右，接種于100 mL LB（含100 μg/mL Amp和34 μg/mL Cm）液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至D600 nm為0.4左右，加入IPTG（終濃度為1 mmol/L），16 ℃誘導(dǎo)表達(dá)5 d。在表達(dá)0、8、16、24、48、72、96、120 h時(shí)，6 000 r/min離心 10 min 收集菌體，50 mmol/L Tris-HCl（pH值8.0）緩沖液洗菌體后離心收集，加入4倍體積50 mmol/L Tris-HCl（pH值8.0）緩沖液重懸超聲后的破碎菌體，12 000 r/m離心30 min，上清用0.45 mm濾膜過(guò)濾，采用Tricine-SDS-PAGE凝膠電泳鑒定Tα1的表達(dá)[10]。采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)蛋白表達(dá)量，用牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）作為標(biāo)準(zhǔn)[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 pColdⅡ （sp-4）-proTα-lessACA質(zhì)?；虻脑O(shè)計(jì)

設(shè)計(jì)適于在SPP系統(tǒng)中表達(dá)的proTα基因序列，采用E. coli通用密碼子將proTα中的ACA堿基序列全部敲除，其基因序列見(jiàn)圖1。

2.2 pColdⅡ （sp-4）-proTα-lessACA質(zhì)粒的鑒定

構(gòu)建的pColdⅡ （sp-4）-proTα-lessACA質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶Nde Ⅰ和HindⅢ單/雙酶切后由1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果說(shuō)明質(zhì)粒構(gòu)建成功（圖2）。

2.3 proTα的冷休克表達(dá)與鑒定

共轉(zhuǎn)化pColdⅡ（sp-4）-proTα-lessACA質(zhì)粒和pMazF質(zhì)粒的E. coli BL21（DE3）受到IPTG誘導(dǎo)后開(kāi)始表達(dá)Tα1。分別收集0、8、16、24、48、72、96、120 h的可溶性蛋白，理論上即為SPP系統(tǒng)表達(dá)的純蛋白，Tricine-SDS-PAGE凝膠電泳鑒定結(jié)果見(jiàn)圖3。結(jié)果顯示，在表達(dá)的第2天即可表達(dá)較純的可溶性蛋白，說(shuō)明Tα1可以在SPP系統(tǒng)成功表達(dá)。在誘導(dǎo)120 h后，在上清液中的可溶性蛋白的最終產(chǎn)率為16.27±0.94 mg/L（BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線為 y=0.005 26x+0.070 03，r2=0.999 8）。人源性proTα的理論分子量為9.45 ku，而在SPP系統(tǒng)中所表達(dá)的proTα由于在其N(xiāo)端增加了轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)元件（transcription enhancer element，TEE）和6×His標(biāo)簽共11個(gè)氨基酸，因此其理論分子量增加至10.97 ku。

3 結(jié)論

采用共轉(zhuǎn)法建立的SPP表達(dá)系統(tǒng)能夠在E. coli中正確高效表達(dá)proTα，其產(chǎn)量可達(dá)16 mg/L。通過(guò)SPP系統(tǒng)表達(dá)最終制備獲得了大量的proTα，可以省去純化蛋白的步驟，大大節(jié)省了純化所需的人力、物力和時(shí)間。采用SPP系統(tǒng)表達(dá)的proTα經(jīng)RP-HPLC分析，純度可達(dá)97 %以上。采用SPP系統(tǒng)冷休克表達(dá)proTα工藝簡(jiǎn)單，整個(gè)過(guò)程約在1 周內(nèi)完成，不需要純化過(guò)程即可獲得純度較高的產(chǎn)品，為利用基因工程方法大量制備proTα提供了一種簡(jiǎn)便而又切實(shí)可行的方法。

[HS2][HT8.5H]參考文獻(xiàn)：

[1] Zhang W，Zhang C，Lv Z，et al. Molecular characterization，tissue distribution，subcellular localization and actin-sequestering function of a thymosin protein from silkworm[J]. PLoS One，2012，7（2）：e31040.

[2]Goldstein A L，Low T L，McAdoo M，et al. Thymosin alpha1：isolation and sequence analysis of an immunologically active thymic polypeptide[J]. Proc Natl Acad Sci USA，1977，74（2）：725-729.

[3]Li C，Bo L，Liu Q，et al. Thymosin alpha1 based immunomodulatory therapy for sepsis：a systematic review and meta-analysis[J]. Int J Infect Dis，2015，33（C）：90-96.

[4]Serafino A，Pierimarchi P，Pica F，et al. Thymosin α1 as a stimulatory agent of innate cell-mediated immune response[J]. Ann N Y Acad Sci，2012，1270（1）：13-20.

[5]Tuthill C，Rios I，McBeath R. Thymosin alpha 1：past clinical experience and future promise[J]. Ann N Y Acad Sci，2010，1194（1）：130-135.

[6]Billich A. Thymosin alpha1. SciClone pharmaceuticals[J]. Current Opinion in Investigational Drugs，2002，3（5）：698-707.

[7]Li J，Liu C H，Wang F S. Thymosin alpha 1：biological activities，applications and genetic engineering production[J]. Peptides，2010，31（11）：2151-2158.[HJ1.5mm]

[8]Ioannou K，Samara P，Livaniou E，et al. Prothymosin alpha：a ubiquitous polypeptide with potential use in cancer diagnosis and therapy[J]. Cancer Immunol Immunother. 2012，61（5）：599-614.

[9]Suzuki M，Zhang J，Liu M，et al. Single protein productionin living cells facilitated by an mRNA interferase[J]. Mol Cell，2005，18（2）：253-261.

[10] Schgger H. Tricine-SDS-PAGE[J]. Nat Protoc，2006，1（1）：16-22.

[11]Bradford M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J]. Analytical Biochemistry，1976，72（S1/S2），248-254.endprint