胎盤生長因子基因沉默對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響

李海芳1，蘇衛(wèi)東1，劉傳麗2，徐晨1，邱麗君1

(1天津市第四中心醫(yī)院，天津300140；2武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院)

摘要：目的觀察沉默胎盤生長因子(PGF)基因?qū)χ嗵?LPS)誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)炎性因子表達(dá)的影響。方法體外培養(yǎng)HUVECs細(xì)胞至第3代，分為A、B、C、D、E組。A組轉(zhuǎn)染siRNA-NC質(zhì)粒(為非特異性沉默對(duì)照質(zhì)粒)，B組轉(zhuǎn)染siRNA-PGF質(zhì)粒，C組轉(zhuǎn)染siRNA-NC+pcDNA3質(zhì)粒(為NF-κB過表達(dá)對(duì)照質(zhì)粒)，D組轉(zhuǎn)染siRNA-PGF+pcDNA3質(zhì)粒，E組轉(zhuǎn)染siRNA-PGF+pcDNA3-NF-κB質(zhì)粒。上述各組轉(zhuǎn)染24 h后與100 ng/mL的LPS共孵育24 h，收集各組細(xì)胞及細(xì)胞上清液，分別用于相關(guān)細(xì)胞因子mRNA(實(shí)時(shí)熒光定量PCR法)及蛋白(ELISA法)的檢測(cè)。結(jié)果與A組相比，B組MCP-1、IL-1、IL-6、TNF-α、NF-κB mRNA和蛋白的表達(dá)均明顯下降，兩組相比，P均<0.05。與D組相比，E組MCP-1、IL-1、TNF-α mRNA和蛋白的表達(dá)均上升，兩組相比，P均<0.05。結(jié)論 沉默PGF基因可以通過NF-κB信號(hào)通路的介導(dǎo)在mRNA和蛋白水平上抑制HUVECs炎癥因子MCP-1、IL-1、TNF-α的表達(dá)，從而減輕炎癥反應(yīng)。

關(guān)鍵詞：胎盤生長因子；基因沿默;脂多糖；動(dòng)脈粥樣硬化；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞;炎性因子

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.43.009

中圖分類號(hào)：R543;Q78 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

基金項(xiàng)目：天津市第四中心醫(yī)院博碩基金資助項(xiàng)目。

收稿日期：(2015-07-16)

通信作者：邱麗君

動(dòng)脈粥樣硬化(AS)是由炎癥因子和趨化因子介導(dǎo)的全身炎癥及免疫反應(yīng)性疾病[1]。內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)(尤其是炎癥反應(yīng))被認(rèn)為是AS發(fā)病機(jī)制中的一個(gè)關(guān)鍵性環(huán)節(jié)。炎性因子脂多糖(LPS)能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)[2]。研究[3，4]發(fā)現(xiàn)，胎盤生長因子(PGF)能夠在血管新生、側(cè)支血管生成、造血、腫瘤發(fā)生、炎癥反應(yīng)動(dòng)和AS等方面發(fā)揮作用，但其作用機(jī)制尚不明確。2015年1月，我們觀察了沉默PGF基因?qū)PS誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)炎性因子表達(dá)的影響，探討PGF在AS發(fā)病中的作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1LPS的配置將10 mg的LPS加入1 mL的PBS，配制成10 g/L的LPS母液，分裝后置-20 ℃保存，使用前用DMEM培養(yǎng)液配制成終濃度為10 mg/L的LPS培養(yǎng)液。

1.2HUVECs的培養(yǎng)及鑒定取新鮮人臍帶(由武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院提供，離體時(shí)間不超過2 h，產(chǎn)婦知情同意)，長約20 cm，無菌PBS洗凈后灌注0.2%胰蛋白酶20 mL，血管鉗夾閉其兩端，置37 ℃孵箱中10 min。收集HUVECs，1 200 r/min離心10 min，棄上清，加入培養(yǎng)基，置37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)24 h。PBS洗滌，加入含有10%胎牛血清培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，2～3 d換液1次，至貼壁細(xì)胞70%～80%融合時(shí)消化傳代。倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞呈單層鵝卵石樣排列，Ⅷ因子免疫熒光染色陽性，即確定為HUVECs。

1.3HUVECs分組、PGF基因沉默及其炎癥因子mRNA和蛋白的檢測(cè)① HUVECs分組：取第3代HUVECs接種到12孔板，待細(xì)胞長滿時(shí)隨機(jī)分組，分別為A、B、C、D、E組，每組6孔。②基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染：首先構(gòu)建PGF沉默質(zhì)粒(siRNA-PGF)且實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該質(zhì)?？捎行Ц蓴_HUVECs的PGF表達(dá)。構(gòu)建NF-κB過表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA3-NF-κB)且實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該質(zhì)?？擅黠@升高HUVECs的NF-κB表達(dá)。A組轉(zhuǎn)染siRNA-NC質(zhì)粒，B組轉(zhuǎn)染siRNA-PGF質(zhì)粒，C組轉(zhuǎn)染siRNA-NC+pcDNA3質(zhì)粒，D組轉(zhuǎn)染siRNA-PGF+pcDNA3質(zhì)粒，E組轉(zhuǎn)染siRNA-PGF+pcDNA3-NF-κB質(zhì)粒。其中，siRNA-NC為非特異性沉默對(duì)照質(zhì)粒，pcDNA3為NF-κB過表達(dá)對(duì)照質(zhì)粒。上述各組轉(zhuǎn)染不同基因質(zhì)粒24 h后與100 ng/mL的LPS共孵育24 h。分別收集各組細(xì)胞及細(xì)胞上清液，用于相關(guān)細(xì)胞因子mRNA及蛋白的檢測(cè)。A組和B組檢測(cè)單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)、白細(xì)胞介素1(IL-1)、白細(xì)胞介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)及核因子κB(NF-κB)的mRNA和蛋白；C、D、E組檢測(cè)MCP-1、IL-1、IL-6、TNF-α的 mRNA和蛋白。③HUVECs炎癥因子mRNA檢測(cè)：采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。抽提各組HUVECs總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。PCR反應(yīng)體系20 μL，其中含SYBR Premix EX Taq II(2×)10 μL 、ROX Reference Dye II(50×)0.4 μL 、反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物4 μL 、上下游引物各0.5 μL、dH2O 3.6 μL。PCR反應(yīng)條件為90 ℃ 12 min進(jìn)行預(yù)變性，然后兩步法進(jìn)行擴(kuò)增，95 ℃ 10 s、58 ℃ 40 s，共42個(gè)循環(huán)。將目的基因的Ct值用GAPDH的Ct值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并以此作為目的基因的相對(duì)表達(dá)量。④HUVECs培養(yǎng)上清液中炎癥因子蛋白檢測(cè)：采用ELISA法。按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，在實(shí)驗(yàn)板內(nèi)每孔加標(biāo)準(zhǔn)品及待測(cè)HUVECs上清液，37 ℃反應(yīng)120 min；甩去板內(nèi)液體，洗板；每孔加酶標(biāo)抗體工作液，37 ℃反應(yīng)60 min；甩去板內(nèi)液體，洗板；每孔加入底物工作液，37 ℃暗處反應(yīng)15 min；最后加入終止液，用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)吸光度值。

2結(jié)果

2.1A、B組炎癥因子mRNA和蛋白的表達(dá)比較A、B組炎癥因子mRNA和蛋白的表達(dá)見表1、2。表1、2顯示，與A組相比，B組轉(zhuǎn)染siRNA-PGF沉默PGF的表達(dá)后，HUVECs 的MCP-1、IL-1、IL-6、TNF-α、NF-κB mRNA和蛋白表達(dá)量均減少。

表1　 A、B組炎癥因子mRNA的表達(dá)比較

注：與A組相比，*P<0.05。

表2　A、B組炎癥因子蛋白的表達(dá)比較(吸光度值， ± s)

注：與A組相比，*P<0.05。

2.2C、D、E組炎癥因子mRNA和蛋白的表達(dá)比較C、D、E組炎癥因子mRNA和蛋白的表達(dá)見表3、4。表3、4顯示，過表達(dá)NF-κB可挽救沉默PGF導(dǎo)致的HUVECs的MCP-1、IL-1、TNF-α表達(dá)下降，而對(duì)IL-6的表達(dá)沒有明顯影響，表明PGF可以通過NF-κB信號(hào)通路的介導(dǎo)調(diào)節(jié)HUVECs 的MCP-1、IL-1、TNF-α表達(dá)。

表3　C、D、E組炎癥因子mRNA的表達(dá)比較

注：與C組相比，*P<0.05；與D組相比，#P<0.05。

表4　C、D、E組炎癥因子蛋白的表達(dá)比較(吸光度值， ± s)

注：與C組相比，*P<0.05；與D組相比，#P<0.05。

3討論

AS斑塊的主要組成細(xì)胞為單核細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及血管平滑肌細(xì)胞[5～7]。內(nèi)皮功能異常及內(nèi)皮細(xì)胞的激活是血管病變的早期表現(xiàn)，在炎癥、高血糖、高血脂、高胰島素血癥等影響下，各種黏附分子及趨化因子的表達(dá)增加，募集各種細(xì)胞向動(dòng)脈內(nèi)膜遷移，導(dǎo)致AS的形成[8]。LPS屬于促炎癥細(xì)胞因子，可刺激內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞釋放一系列炎癥介質(zhì)，如趨化因子、氧自由基、細(xì)胞因子等，這些炎癥介質(zhì)可造成血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、內(nèi)皮細(xì)胞間隙增大、血管基膜暴露、中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞等遷移至內(nèi)皮下，加劇炎癥反應(yīng)[9]。

MCP-1屬趨化因子家族中的β亞家族，由于其氨基端含兩個(gè)半胱氨酸，以Cys-Cys方式排列，因此也稱為CC趨化性細(xì)胞因子，可由多種細(xì)胞合成分泌。Hoogeveen等[10]在研究血漿MCP-1水平與外周動(dòng)脈疾病或冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病之間關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，MCP-1水平隨冠狀動(dòng)脈粥樣硬化程度增加而升高，抑制MCP-1的生成或者應(yīng)用MCP-1拮抗劑不僅可限制粥樣斑塊的進(jìn)展，而且能穩(wěn)定斑塊。IL-1主要由活化的巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞產(chǎn)生，可以促進(jìn)白細(xì)胞和血小板黏附于受損的內(nèi)皮細(xì)胞以及血小板活化，是一種敏感和特異的急性期炎性指標(biāo)。IL-6在免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，是一種重要的炎癥因子，主要作用是誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞分化和產(chǎn)生抗體，誘導(dǎo)多種急性期蛋白質(zhì)合成和分泌等。NF-κB為具有多向轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的蛋白質(zhì),與許多基因特別是免疫炎癥相關(guān)基因(如各種細(xì)胞因子、趨化因子和黏附分子等)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控密切相關(guān)，而這些因子又對(duì)相應(yīng)細(xì)胞的活化、增殖、浸潤、趨化和分泌功能起著直接的調(diào)控作用。AS斑塊處的血管內(nèi)皮細(xì)胞中存在NF-κB的激活[11]。

非活化的NF-κB通常在細(xì)胞胞質(zhì)中與抑制性卡巴蛋白(κB)結(jié)合，炎癥因子的刺激通過多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑使IκB磷酸化，在蛋白水解酶作用下發(fā)生降解，釋放NF-κB并轉(zhuǎn)運(yùn)至核內(nèi)，誘導(dǎo)炎癥因子如TNF、IL-6、MCP-1等表達(dá)[12]。有研究者[13]在血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中過表達(dá)PGF后，用ELISA檢測(cè)到NF-κB的表達(dá)明顯增加，同時(shí)發(fā)現(xiàn)IL-6、TNF-α表達(dá)也增加。本研究發(fā)現(xiàn)，在沉默PGF基因后，HUVECs的MCP-1、IL-1、IL-6、TNF-α、NF-κB mRNA及蛋白表達(dá)均明顯減少，表明沉默PGF基因能從基因和蛋白水平抑制LPS引起的HUVECs炎癥因子的表達(dá)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)NF-κB可以挽救沉默PGF基因誘導(dǎo)的MCP-1、IL-1、TNF-α的表達(dá)下降。但是，本研究并未發(fā)現(xiàn)NF-κB介導(dǎo)PGF對(duì)IL-6的調(diào)控，可能是由于不同的細(xì)胞模型所導(dǎo)致的。

總之，本研究結(jié)果表明，沉默PGF基因可以通過NF-κB信號(hào)通路的介導(dǎo)而從mRNA和蛋白水平上抑制HUVECs炎癥因子MCP-1、IL-1、TNF-α的表達(dá)，從而減輕炎癥反應(yīng)，這有可能成為AS潛在的治療靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：

[1] Roncal C, Buysschaert I, Gerdes N, et al. Short-term delivery of anti-PlGF antibody delays progression of atherosclerotic plaques to vulnerable lesions [J]. Cardiovasc Res, 2010,86(1):9-36.

[2] 張肇林,韓雪瑩,鄧景惕,等.辛伐他汀對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞炎性反應(yīng)抑制作用[J].中國現(xiàn)代普通外科進(jìn)展,2011,14(11):841-845.

[3] Desai J, Holt-Shore V, Torry RJ, et al. Signal transduction and biological function of placenta growth factor in primary human trophoblast [J]. Biol Reprod, 1999,60(4):887-892.

[4] Yoo SA, Yoon HJ, Kim HS , et al. Role of placenta growth factor and its receptor flt-1 in rheumatoid inflammation: a link between angiogenesis and inflammation[J]. Arthritis Rheum, 2009,60(2):345-354.

[5] Ross R. Atherosclerosis is an inflammatory disease [J]. Am Heart J, 1999，138(5 Pt 2):419-420.

[6] Kartinen M, van der Wal AC, van der Loos CM, et al. Mast cell infiltration in acute coronarysyndromes: implications for plaque rupture [J]. J Am Coll Cardiol， 1998，32(3):606-612.

[7] van der Wal AC, Piek JJ,de Boer OJ, et al. Recent activation of the plaque immune response in coronary lesions underlying acute coronary syndromes [J]. Heart, 1998，80(1):14-18.

[8] Zhao J, Yan HM, Li Y, et al. Pitavastatin calcium improves endothelial function and delays the progress of atherosclerosis in patients with hypercholesterolemia [J]. Biomedic Biotechnol， 2015,16(5):380-387.

[9] 周信,張小容,張秋燕,等.生半夏及其炮制品對(duì)小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞炎性因子分泌的影響[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013,19(10): 261-265.

[10] Hoogeveen RC, Morrison A, Boerwinkle E, et al. Plasma MCP-1 level and risk for peripheral arterial disease and incident coronary heart disease: atherosclerosis risk in communities study [J]. Atherosclerosis， 2005，183(2):301-307.

[11] 段巖,李杰,陶杰,等.E1A激活基因阻遏子對(duì)抗腫瘤壞死因子α引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞炎性損傷[J].中國動(dòng)脈硬化雜志，2011,19(9): 721-726.

[12] Ghanim H, Garg R, Aljada A, et al. Suppression of nuclear factor-κB and stimulation of inhibitor κB by troglitazone: evidence for an anti- inflammatory effect and a potential[J]. J Clin Endocrinol Metab， 2001，86(3):1306-1312.

[13] Kitasato L, Tojo T, Hashikata T, et al. Vascular fibrosis enhanced by embryonic signal switching: a novel mechanism of placental growth factor-induced coronary artery sclerosis[J]. Euro Heart J，2013，34(Suppl 1)：4167.