反相液相色譜中調(diào)整流動相組分比例對分離效果的影響

黃強1李華勇1劉新國2

(1.江西省吉安市質(zhì)量技術監(jiān)督檢測中心，江西 吉安 343000；

2.江西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢測院，江西 南昌 33000)

摘要：用國標法同時測定苯甲酸、山梨酸和糖精鈉，通過改變流動相組分比例，即改變流動相極性，對三種比例所得出的分離效果進行比較，考察了三種組分的保留時間、分離度及拖尾因子等參數(shù)變化。試驗結果表明：(1)增加甲醇比例，三種待測組分保留時間都提前，且糖精鈉的變化最大；(2)增加甲醇比例可以使三種組分的分離度和拖尾因子都變小，同時也可以滿足對分離度的要求；(3)綜合分析試驗所得各參數(shù)，得出色譜系統(tǒng)所需最適流動相配比，實現(xiàn)較好的分離效果，試驗的精密度也滿足要求。

關鍵詞：液相色譜流動相分離度系統(tǒng)適用性試驗

反相色譜法是以表面非極性載體為固定相，以比固定相極性強的溶劑為流動相的一種色譜分離模式，是基于樣品中的不同組分和固定相之間作用的不同而將各組分分離，具有柱效高、分離能力強、保留機理清楚等特點，是液相色譜分離模式中使用最為廣泛的一種。反相色譜系統(tǒng)中的固定相一般采用硅膠表面鍵合疏水基團，流動相首選甲醇-水系統(tǒng)，在一些大分子物質(zhì)的分離中，多采用離子強度較低的酸性水溶液，添加一定量的乙腈或甲醇等與水互溶的有機溶劑作流動相。

色譜系統(tǒng)的適用性試驗通常包括理論板數(shù)、分離度、重復性和拖尾因子等四個參數(shù)。其中，分離度和拖尾因子是考察分離效果的重要指標。實際檢測中，各品種項下規(guī)定的條件除固定相種類、流動相組分、檢測器類型不得改變外，其余如色譜柱內(nèi)徑、長度、載體粒度、流動相流速、混合流動相各組分的比例、柱溫、進樣量、檢測器的靈敏度等，均可適當改變，以適應供試品并達到系統(tǒng)適用性試驗的要求。

筆者根據(jù)自己多年該方面工作的實際經(jīng)驗出發(fā)，以國標法測定苯甲酸、山梨酸和糖精鈉為試驗方法。在色譜系統(tǒng)的適用性試驗時，通過改變甲醇在流動相中的比例，實現(xiàn)了待測組分較好的分離效果。

1、材料與方法

1.1　儀器與試劑

島津LC-2010A型高效液相色譜儀，配紫外檢測器，色譜工作站。

苯甲酸、山梨酸、糖精鈉混合標準溶液：濃度均為0.100 mg/mL。

乙酸銨為分析純，甲醇為色譜純，試驗用水為超純水。

1.2　儀器工作條件

色譜柱為C18柱，4.6 mm×250 mm，5 μm；柱溫為30 ℃；檢測器為紫外檢測器，檢測波長為230 nm；流動相為甲醇與0.02 mol/L乙酸銨的混合溶液；流速為1.0 ml/min；進樣量為10 μL。

1.3　試驗方法

本文試驗采用GB/T 23495-2009中對苯甲酸、山梨酸、糖精鈉的測定方法，甲醇與0.02 mol/L乙酸銨溶液分別過0.45 μm微孔濾膜，通過改變甲醇與乙酸銨溶液的體積比來調(diào)節(jié)流動相的極性，采用甲醇與0.02 mol/L乙酸銨溶液體積比分別為：5：95、10：90和15：85三種比例來進行，將苯甲酸、山梨酸、糖精鈉混合標準溶液進樣10 μL，在儀器工作條件下進行測定，比較不同比例下混合標準溶液中三種組分的保留時間、分離度及拖尾因子等參數(shù)的變化。

2、結果與討論

2.1　流動相比例的選擇

調(diào)整流動相組分比例時，一方面以組分比例較低者(小于或等于50%)相對于自身的改變量不超過±30%且相對于總量的該變量不超過±10%為限，如30%相對改變量的數(shù)值超過總量的10%時，則改變量以總量的±10%為限；另一方面，對于十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的反相色譜系統(tǒng)，流動相中有機溶劑的比例通常應不低于5%。故本文采用5：95、10：90和15：85三種比例來進行。

2.2　三種組分保留時間的變化

保留時間是待測組分從進樣到出現(xiàn)峰最大值所需的時間。理論上來說，保留時間越長越有利于組分分離，但時間越長，待測組分在柱子里擴散越嚴重，越容易影響分析結果，而且人力及試劑損耗等成本也越高。

通過比較三張色譜圖1、2、3及表1、2、3可知：甲醇在流動相比例的較小變化都會使苯甲酸、山梨酸、糖精鈉的保留時間發(fā)生明顯的改變。增加甲醇在流動相中的比例，可以使得苯甲酸、山梨酸、糖精鈉的保留時間提前；糖精鈉的保留時間變化更大，由原來的最后出峰變?yōu)樽钕瘸龇濉?/p>

圖1　色譜圖(甲醇：乙酸銨=5：95)

序號名稱保留時間(min)分離度拖尾因子1苯甲酸10.9970.02.272山梨酸15.1095.42.273糖精鈉21.8416.32.36

圖2　色譜圖(甲醇：乙酸銨=10：90)

序號名稱保留時間(min)分離度拖尾因子1苯甲酸8.9410.02.162山梨酸11.9434.82.173糖精鈉13.6872.42.13

圖3　色譜圖(甲醇：乙酸銨=15：85)

序號名稱保留時間(min)分離度拖尾因子1苯甲酸7.5200.02.152糖精鈉9.3413.403山梨酸9.7620.70

2.3　三種組分之間的分離度

分離度的大小表示待測組分與相鄰共存物之間的分離程度，可以通過測定待測組分之間的分離度來對色譜系統(tǒng)進行評價與控制。分離度是兩個相鄰組分的保留值之差與其平均峰寬值之比，用R表示，當R>0.8時，兩組分不能完全分離；當0.8

2.4　三種組分的拖尾因子

拖尾因子反映了色譜峰的對稱性，可以用于評價待測組分之間的分離效果和測量精度。一般來說拖尾因子越小，反應出的分離效果也越好。通過比較表1、2、3可知，隨著甲醇在流動相中的比例增加，三種組分的拖尾因子變小，峰形更尖銳。

2.5　最佳流動相比例

綜合考慮保留時間、分離度及拖尾因子等參數(shù)，選擇甲醇與0.02 mol/L乙酸銨溶液體積比為10：90作為試驗方法，能實現(xiàn)苯甲酸、山梨酸和糖精鈉三種組分較好的分離效果。

2.6　精密度試驗

按2.5選擇的試驗方法做精密度試驗，測定6次，其中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的相對標準偏差分別為：0.12%，0.14%，0.11%，符合不大于2.0%的要求，說明試驗方法可以得出較好的測量精度。

參考文獻

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The effect of adjusting the mobile phasecomponents ratio on separation

efficiency in reversed phase liquid chromatography

HUANG Qiang1LI Hua-yong1LIU Xin-guo2

(1.Ji’anMunicipalCenterforSupervisionandInspectionofQualityandTechnology，Jiangxi，Ji’an343000；

2.JiangxiProvincialProductQualitySupervisionTestingCollege，Jiangxi，Nanchang33000)

Abstract：Simultaneous determination of benzoic acid，sorbic acid and saccharin sodium by GB method，changing the mobile phase components ratio，that is，changing the polarity of mobile phase，compared the separation efficiency of three components，inspected the changing of parameter include retention time，resolution and tailing factor.The test results show that：(1)Increasing the proportion of methanol，the retention time of three components shift to an earlier time，and the maximum change of saccharin sodium；(2)Increasing the proportion of methanol can decrease the resolution and tailing factor of three components，can also meet the requirement for the resolution；(3)The comprehensive analysis of the parameters obtained in the test shows that the optimum ratio of mobile phase for the chromatographic system，and the better separation effect，the precision can also meet the requirement.

Key Words：Liquid chromatographyMobile phaseResolutionTest of system suitability