郭曉霞，李良學，武玉鵬，劉改萍，馮瑪莉

1.山西省中醫(yī)院肝病科，山西 太原030012;2.山西省中醫(yī)藥研究院臨床藥理實驗室;3.山西省中醫(yī)院病理科

原發(fā)性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis，PBC)是一種自身免疫性、慢性進行性膽汁淤積性肝臟疾病，該病以肝臟門靜脈炎性細胞浸潤和免疫系統(tǒng)介導的肝小葉膽管損傷為特征，病理特征為慢性非化膿性膽管炎，主要累及小葉間隔及間隔膽管［1］。熊去氧膽酸膠囊是目前唯一被美國食品及藥品監(jiān)督管理局批準的用于原發(fā)性膽汁性肝硬化治療的藥物，為此本研究利用聚肌胞苷酸(Polyinosinic-polycytidylic acid，poly I∶C)建立PBC 動物模型，并給予熊去氧膽酸膠囊治療，觀察其對PBC 肝組織病理及超微結(jié)構改變的保護作用，并對其作用機制進行探討。

1 資料與方法

1.1 動物 SPF 級C57BL/6 小鼠，雌性，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可號:SCXK(京)2009-0004。符合本醫(yī)院的動物管理與動物實驗的章程。

1.2 試劑與儀器 熊去氧膽酸膠囊(德國福克制藥股份有限公司，規(guī)格250 mg/粒)、聚肌胞苷酸(太原博科生物有限公司)、CK19 抗體(Santa Cruz 公司)、兔超敏二步法免疫組化檢測試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)、光學顯微鏡(日本奧林巴斯，BX51TPHD-J11)、多功能真彩色細胞圖像分析管理系統(tǒng)(美國Media Cybernetics 公司)、透射電子顯微鏡JEM-1011 型(日立公司產(chǎn)品)、超薄切片機LKB 型(瑞典)。

1.3 實驗方法 取小鼠40 只，體質(zhì)量(20 ±2)g，適應性飼養(yǎng)1 周后，采用隨機數(shù)字表法隨機分為正常組、模型組、熊去氧膽酸低劑量組(0.1 g/kg)、熊去氧膽酸高劑量組(0.4 g/kg)，每組10 只(實驗開始每組12只，造模過程中模型組及熊去氧膽酸低劑量組各死亡2 只，熊去氧膽酸高劑量組死亡1 只，灌胃所致死亡，造模結(jié)束后，經(jīng)課題組商討，每組均以10 只為基數(shù)進行分析)。在標準飼料喂養(yǎng)的基礎上，參照文獻［2］，模型組及治療組給予poly I:C 5 mg/kg 腹腔注射，正常組小鼠給予等體積生理鹽水腹腔注射，2 次/周，直至24 周。同時熊去氧膽酸組按照20 ml/kg 的體質(zhì)量灌胃治療，1 次/d，連續(xù)24 周。

1.4 肝組織病理學檢查 24 周頸脫位法處死小鼠(處理前禁食1 d)，采集肝臟，于冰生理鹽水中清洗，在10%緩沖甲醛固定液中固定，石蠟包埋，切片，HE、Masson 染色，由我院2 名病理科醫(yī)師獨立讀片。

1.5 細胞角蛋白19(cytokeratin19，CK19)的表達選取與常規(guī)HE 切片系同一蠟塊組織的連續(xù)切片，根據(jù)HE 切片中的組織學表現(xiàn)，選定各級別病變所對應的區(qū)域，應用免疫組織化學SP(streptavidin-perosidase)法檢測肝組織中CK19 的表達情況。CK19 為膽管上皮細胞表達，免疫組化染色后，棕色為CK19 陽性表達，應用多功能真彩色細胞圖像分析管理系統(tǒng)分析各組陽性細胞染色強度。免疫組化方法結(jié)果判斷參照IHS(immunohistochemical scores，IHS)評分［3］:IHS=A×B;A 為陽性細胞數(shù)分級:0 ～1% =0、1% ～10% =1、11% ～50% =2、51% ～80% =3、81% ～100% =4;B為陽性細胞顯色強度分級:0(陰性)、1(弱陽性)、2(陽性)、3(強陽性)。

1.6 肝組織光電鏡標本的處理 樣品經(jīng)2%戊二醛預固定，用鋨酸(1%OsO4)后固定組織，丙酮系列脫水，環(huán)氧樹脂618 包埋，半薄切片光學定位，超薄切片，醋酸鈾及枸櫞酸鉛雙重染色，日立JEM-1011 型透射電鏡觀察。

1.7 統(tǒng)計學方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理，計量資料以±s 表示，等級資料采用非參數(shù)檢驗Kruskal-Wallis H 精確概率法檢驗，P ＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 肝組織病理學表現(xiàn) HE 染色結(jié)果顯示，正常組小鼠肝小葉結(jié)構清晰，肝索排列整齊，肝細胞大小正常，染色均勻，核圓形，核仁清晰，匯管區(qū)及膽管周圍未見明顯的炎性細胞浸潤及纖維化形成(見圖1A)。模型組肝小葉結(jié)構紊亂，匯管區(qū)周圍肝細胞腫脹，染色淡，可見少量雙核肝細胞，部分出現(xiàn)點狀及灶性壞死，匯管區(qū)擴大，周圍區(qū)域膽小管損傷嚴重，出現(xiàn)細小的膽管增生，膽管上皮細胞空泡變性，形態(tài)大小不規(guī)則，核濃縮，個別細胞消失，上皮呈假復層，部分膽管擴張，匯管區(qū)及損傷的膽管周圍淋巴細胞浸潤，散在嗜酸性粒細胞及類上皮肉芽腫圍繞損傷膽管，界板出現(xiàn)碎屑樣壞死，并可見橋接纖維化(見圖1B)。熊去氧膽酸低劑量組小鼠肝細胞腫脹較模型組減輕，匯管區(qū)周圍可見淋巴細胞及漿細胞浸潤，并可見淋巴濾泡形成，有少量膽小管增生畸形(見圖1C)。熊去氧膽酸高劑量組小鼠肝小葉結(jié)構基本正常，未見雙核肝細胞，輕度變性，少見壞死，匯管區(qū)輕度擴大，周圍少量炎細胞浸潤，膽小管損傷較模型組明顯減輕，未見明顯的膽小管增生及纖維化形成(見圖1D)。

Masson 染色結(jié)果顯示，正常組小鼠肝小葉結(jié)構正常，匯管區(qū)未見明顯藍綠色膠原纖維分布(見圖2A)。模型組匯管區(qū)擴大水腫，匯管區(qū)及纖維間隔內(nèi)膽小管數(shù)量明顯增加，膽小管管腔擴大并扭曲，膠原纖維明顯增多、相互連接且分布異常，向四周延伸，形成較厚的纖維間隔，但未見形成假小葉(見圖2B)。與模型組比較，熊去氧膽酸低劑量組膠原纖維有所減少，少量膽小管增生(見圖2C)。熊去氧膽酸高劑量組藍綠色膠原纖維增生明顯減少，未見纖維間隔形成，未見明顯膽小管增生(見圖2D)。

2.2 肝組織匯管區(qū)膽管上皮細胞CK19 表達情況正常組肝組織匯管區(qū)膽小管形態(tài)大小規(guī)則，管腔明顯，細胞界限清楚，未見膽小管增生(見圖3A)。模型組匯管區(qū)和纖維間隔內(nèi)膽管上皮細胞CK19 表達明顯增強，膽小管數(shù)量增加，膽管上皮細胞形態(tài)及大小不規(guī)則，排列紊亂，部分細胞消失(見圖3B)。與模型組比較，熊去氧膽酸低劑量組匯管區(qū)膽管上皮細胞CK19表達有所降低，可見少量膽小管增生，部分膽管上皮細胞消失(見圖3C)。熊去氧膽酸高劑量組匯管區(qū)周圍未見明顯的膽小管增生，個別膽管上皮細胞消失(見圖3D)。各組CK19 免疫組化評分比較，模型組IHS評分值明顯高于正常組(P ＜0.05)，高劑量組HIS 評分與模型組之間差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05);與正常組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05，見表1)。

表1 各組小鼠膽管上皮細胞CK19 免疫組化IHS 評分(%，±s)Tab 1 The scores of CK19 by immunohistochemistry in different groups(%，±s)

表1 各組小鼠膽管上皮細胞CK19 免疫組化IHS 評分(%，±s)Tab 1 The scores of CK19 by immunohistochemistry in different groups(%，±s)

注:與正常組比較，* P ＜0.05;與模型組比較，△P ＜0.05。

組別 只IHS正常組10 4.40 ±0.89模型組 10 7.20 ±1.64*熊去氧膽酸低劑量組 10 6.23 ±1.28熊去氧膽酸高劑量組 10 4.95 ±1.36▲F 值 4.211 P 值0.022

2.3 肝組織超微結(jié)構表現(xiàn) 正常組大鼠肝細胞結(jié)構清晰，胞質(zhì)豐富，核膜完整清楚，核仁致密核大而圓，可見糖原顆粒和少量溶酶體。肝血竇面及膽小管腔面可見較多微絨毛。胞質(zhì)內(nèi)線粒體數(shù)量多，包膜清晰完整，嵴清晰可見并呈平行排列，胞質(zhì)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)成群分布，呈層狀排列整齊有序，膜表面有核糖體分布(見圖4A)。

模型組肝細胞核畸形，核膜呈溝狀凹入核內(nèi)，核仁松散，核內(nèi)異染色質(zhì)凝聚、趨邊，核基質(zhì)空化。胞質(zhì)中含有大量脂滴，毛細膽管明顯擴張，管壁結(jié)構不清，管腔內(nèi)隱約可見無定型物。細胞質(zhì)內(nèi)空泡較多。線粒體腫脹畸形，呈分叉型，部分相互融合，嵴減少、破裂及呈管泡狀，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊性擴張、斷裂，同時出現(xiàn)大量溶酶體(見圖4B)。肝組織內(nèi)膽管增生活躍，形成典型的管腔，管腔寬大畸形，微絨毛散亂稀少甚至消失，周圍有大量的膠原纖維沉積和大量的成纖維細胞聚集(見圖4C)。部分膽管上皮出現(xiàn)壞死，周邊有嗜酸性粒細胞及漿細胞聚集，相鄰細胞膜間有橋粒及緊密連接出現(xiàn)(見圖4D)。肝竇周間隙擴張，內(nèi)有顆粒狀蛋白沉著。竇周間隙內(nèi)可見大量肝星狀細胞，細胞核形態(tài)不規(guī)則，胞漿中可見脂肪空泡及少量的微管(見圖4E)。

圖1 各組小鼠肝組織匯管區(qū)的炎性改變(HE 100 ×) 圖2 各組小鼠肝組織匯管區(qū)纖維化程度的改變(Masson 100 ×) 圖3各組小鼠小鼠肝組織匯管區(qū)膽管上皮細胞CK19 表達(400 ×) A:正常組;B:模型組;C:熊去氧膽酸低劑量組;D:熊去氧膽酸高劑量組Fig 1 The inflammatory changes of hepatic portal area in different groups(HE 100 ×) Fig 2 The degree of hepatic tissue fibers of portal area in different groups (Masson 100 ×) Fig 3 The expression of CK19 by immunohistochemistry in hepatic tissue(400 ×) A:normal group;B:model group;C:low Ursodeoxycholic acid group;D:high Ursodeoxycholic acid group

熊去氧膽酸低劑量組肝細胞核畸形，細胞膜、核仁松散，可見少量塊狀的異染色質(zhì)，胞漿內(nèi)偶見脂滴。線粒體腫大畸形，嵴減少或呈空泡狀，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴張(見圖4F)。匯管區(qū)出現(xiàn)膽小管樣細胞團，周圍有基底膜和膠原纖維沉積，中間形成具有微絨毛的管腔，微絨毛排列散亂，肝竇內(nèi)散在淋巴細胞和庫普弗細胞，竇周間隙有大量膠原纖維聚集(見圖4G)。

熊去氧膽酸高劑量組肝細胞體積稍大，核呈圓形或多邊形，細胞膜大部分保持完好，核仁明顯，可見少量塊狀的異染色質(zhì)，胞漿內(nèi)偶見脂滴。與模型組比較，胞質(zhì)內(nèi)線粒體輕度腫脹，部分嵴減少。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)接近正常，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)池輕度擴張，偶見脂褐素顆粒(見圖4H)。膽管上皮細胞增生明顯減少，管腔內(nèi)微絨毛較多，排列整齊，周圍竇周間隙少有成纖維細胞的聚集，可見少量增生的膠原纖維(見圖4I)。

3 討論

PBC 是一種病因不明的慢性進展性自身免疫性疾病。在環(huán)境和遺傳因素的作用下，患者免疫系統(tǒng)調(diào)控機制被破壞，從而產(chǎn)生針對肝臟的自身免疫反應，常見于中年女性［4］，近年來發(fā)現(xiàn)該病也可累及年輕的育齡婦女和男性［5］。有研究表明PBC 可能與肝癌、乳腺癌的風險增加有關［6］。目前PBC 的發(fā)病機制尚不完全清楚，推測可能與自身抗體及HLA 基因有關［7］。PBC 的組織學特征主要表現(xiàn)為自身免疫介導的肝內(nèi)小膽管進行性破壞，肝細胞損傷，最終導致纖維化及肝硬化，而膽管周圍嗜酸性粒細胞及漿細胞的浸潤并形成肉芽腫對其最有診斷價值［8］，而膽管上皮細胞的損傷可能是PBC 發(fā)病機制的初始步驟［9］。

圖4 各組小鼠肝組織超微結(jié)構的改變(TEM 8 000 ×) A:正常組;B ～E:模型組;F ～G:熊去氧膽酸低劑量組;H ～I:熊去氧膽酸高劑量組Fig 4 The ultramicrostructure changes of hepatic tissues in different groups(TEM 8 000 ×) A:normal group;B ～E:model group;F ～G:low Ursodeoxycholic acid group;H ～I:high Ursodeoxycholic acid group

臨床和實驗證據(jù)表明，熊去氧膽酸膠囊可促進內(nèi)源性膽汁酸的排泄并抑制其重吸收，拮抗疏水性膽酸的細胞毒作用，刺激肝細胞和膽小管細胞分泌物的釋放，對細胞因子誘導的損傷細胞具有保護作用，并有免疫調(diào)節(jié)及抗炎作用［10］。由于熊去氧膽酸膠囊特殊的藥理作用，臨床上已被廣泛用于自身免疫性肝病尤其是PBC、膽道疾病、肝內(nèi)膽汁淤積等疾病。經(jīng)大量臨床研究報道熊去氧膽酸膠囊可以改善PBC 患者的生化指標、肝臟組織學及遠期生存率［11］，但熊去氧膽酸膠囊對肝組織病理、免疫組化CK19 及超微結(jié)構影響的相關動物實驗報道較少。

本實驗通過poly I∶C 5 mg/kg 腹腔注射C57BL/6小鼠成功建立PBC 動物模型，poly I∶C 是一種Ⅰ型干擾素，在自身免疫病的發(fā)生和進展過程中發(fā)揮作用［12］。本實驗結(jié)果顯示造模成功后，模型組肝組織匯管區(qū)炎癥伴有肉芽腫形成、膽小管的異常增生和破壞及膠原纖維的沉積，但未見肝硬化形成，被認為是PBC早期病變發(fā)生的主要特征。免疫組化結(jié)果顯示，模型組小鼠匯管區(qū)膽管上皮細胞CK19 表達增多。透射電鏡顯示模型組肝細胞核畸形，胞質(zhì)中含有大量脂滴，毛細膽管明顯擴張，線粒體腫脹畸形，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊性擴張、斷裂，同時出現(xiàn)大量溶酶體。肝組織內(nèi)膽管增生活躍，管腔寬大畸形，微絨毛散亂稀少，周圍有大量的膠原纖維沉積和大量的成纖維細胞聚集，周邊有嗜酸性粒細胞及漿細胞聚集。因此膽管上皮細胞的增生及膠原纖維的沉積在PBC 的發(fā)病中起重要作用。熊去氧膽酸低劑量組、高劑量組膽小管增生及膠原纖維沉積較模型組均明顯減少，免疫組化結(jié)果顯示膽管上皮細胞CK19 表達明顯減弱;透射電鏡提示熊去氧膽酸可修復線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細胞器，減少膽管增生及膽管上皮細胞損傷，改善肝纖維化程度。

綜上所述，本研究從肝組織病理、免疫組化CK19及超微結(jié)構方面探討了熊去氧膽酸膠囊干預PBC 小鼠的作用機制，表明熊去氧膽酸膠囊以抑制膽管上皮細胞增殖和減輕細胞外基質(zhì)的沉積為主要作用途徑，為下一步探討其詳盡作用機制，并在此基礎上完善PBC 患者的治療方案提供一定的思路。

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