缺血后處理對(duì)再灌注損傷后炎癥因子的調(diào)節(jié)作用

陳艷1高丹姜云鵬張蕾2

(吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,吉林長(zhǎng)春130021)

摘要〔〕目的探討缺血后處理(POC)調(diào)節(jié)腎缺血再灌注損傷(RIPI)后炎癥因子的表達(dá)水平及其對(duì)大鼠腎臟保護(hù)作用的機(jī)制。方法成年SD大鼠隨機(jī)分成：假手術(shù)組(Sham組)、缺血再灌注組(I/R組)、POC組。Sham組為對(duì)照組。I/R組: 采用無創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉左腎動(dòng)脈45 min，切除右腎，然后去除血管夾，恢復(fù)血流灌流。POC組:在I/R組的基礎(chǔ)上再進(jìn)行3個(gè)循環(huán)的30 s缺血/30 s再灌注的手術(shù)干預(yù)(共計(jì)3 min)，最后打開血管夾使血液再灌注。將各組動(dòng)物于清潔條件下飼養(yǎng)，于第2天及1個(gè)月時(shí)收集各組動(dòng)物血清，檢測(cè)腎臟功能。第2天時(shí)，蘇木素-伊紅(HE)染色觀察腎臟組織結(jié)構(gòu)。RT-PCR法檢測(cè)各組中腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-6和IL-10的表達(dá)水平。結(jié)果再灌注第2天，Sham組血清肌酐(Cr)和血尿酸氮(BUN)的濃度維持在正常水平，而I/R組Cr和BUN的濃度明顯增高(P<0.01)，POC組Cr和BUN的濃度顯著低于I/R組(P<0.05)。再灌注1個(gè)月，三組中Cr的濃度無明顯差異(P>0.05)。HE染色結(jié)果顯示，再灌注第2天，Sham組中腎組織形態(tài)正常，I/R組腎小管上皮細(xì)胞變性，部分脫落，管腔內(nèi)可見管型，POC組腎組織病變較輕。RT-PCR法檢測(cè)結(jié)果顯示，再灌注第2天，Sham組TNF-α、IL-6和IL-10的表達(dá)水平很低，I/R組中TNF-α、IL-6的表達(dá)水平明顯升高，POC組低于I/R組，而IL-10的表達(dá)水平明顯高于I/R組。結(jié)論P(yáng)OC降低了缺血再灌注后的急性炎癥反應(yīng)，從而對(duì)大鼠的腎臟起到了保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞〔〕缺血再灌注損傷；缺血后處理；炎癥因子

中圖分類號(hào)〔〕R6〔

通訊作者：張蕾(1974-)，女，博士，副主任醫(yī)師，主要從事缺血再灌注損傷機(jī)制研究。

1吉林大學(xué)附屬吉林醫(yī)院 吉林市中心醫(yī)院病理科

2吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院

第一作者：陳艷(1988-)，女，碩士,主要從事腎缺血再灌注損傷機(jī)制研究。

腎臟缺血再灌注損傷(RIPI)廣泛發(fā)生于腎移植、腎部分切除術(shù)、腎動(dòng)脈血管成形術(shù)、腎積水、泌尿外科手術(shù)、心肺分流術(shù)、主動(dòng)脈搭橋手術(shù)、膿毒癥和肝移植等情況下〔1,2〕。腎缺血再灌注后會(huì)引發(fā)急性炎癥反應(yīng)，包括巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)和激活，促炎性細(xì)胞因子和趨化因子的釋放以及黏附分子表達(dá)的增強(qiáng)〔3〕。研究表明，急性炎癥反應(yīng)在引起腎臟損害的過程中扮演一個(gè)關(guān)鍵性的角色〔4,5〕。缺血后處理(POC)即缺血后持續(xù)再灌注前，通過給予多次短暫的再灌注/缺血(I/R)處理可減輕再灌注損傷。但POC的具體保護(hù)機(jī)制還不明確。本文通過研究POC對(duì)大鼠腎臟RIPI后炎癥因子的調(diào)節(jié)作用，從而闡明其對(duì)腎臟的保護(hù)作用，為其臨床應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料、試劑及儀器清結(jié)級(jí)雄性SD大鼠，體重180～220 g，由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。無創(chuàng)動(dòng)脈夾，手術(shù)鑷，手術(shù)剪，眼科剪，眼科鑷，止血鉗，持針器，醫(yī)用紗布，醫(yī)用手術(shù)縫合線，醫(yī)用棉簽，一次性注射器(1 ml,5 ml)，無菌EP管，大鼠飼養(yǎng)籠、墊料及鼠糧等。

戊巴比妥鈉(Sigma,USA)，TRIzol?Reagent(Invitrogen,USA)，RNLater(北京泰天和生物技術(shù)有限公司)，TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒〔寶生物工程(大連)有限公司〕，無水乙醇(北京化工廠)，0.9%氯化鈉注射液(四川科倫藥業(yè)股份有限公司)，10%中性甲醛緩沖液，伊紅染液，蘇木精染液等。

半自動(dòng)輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī)(Leica RM2245,Germany)，微量臺(tái)式低溫離心機(jī)(Thermo Scientific,USA)，PCR儀(Thermo Scientific,USA)，KD-BMⅡ生物組織包埋機(jī)(浙江金華科迪儀器設(shè)備有限公司)，分析天平(沈陽龍騰電子稱量?jī)x器有限公司)，凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)等。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物模型的制備將清潔級(jí)雄性成年SD大鼠隨機(jī)分為，假手術(shù)組(Sham組)，缺血再灌注組I/R組及POC組每組8只。應(yīng)用50 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉SD大鼠后，將其腹部朝上，四肢固定于手術(shù)板上。大鼠腹部皮膚經(jīng)過75%乙醇消毒后，用手術(shù)剪刀剪開腹部，暴露其腹腔臟器，然后用棉簽輕輕將其撥開，找到大鼠左側(cè)腎臟，剝離腎蒂被膜，分離出左腎動(dòng)脈。Sham組大鼠：暴露出左腎但不進(jìn)行任何處理。I/R組大鼠：用無創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉左腎動(dòng)脈45 min，切除右腎，然后去除血管夾，恢復(fù)血流灌注。POC組大鼠：用無創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉左腎動(dòng)脈45 min，切除右腎，然后去除無創(chuàng)動(dòng)脈夾，之后進(jìn)行3個(gè)循環(huán)的30 s缺血/30 s再灌注的手術(shù)干預(yù)(共計(jì)3 min)，最后打開血管夾恢復(fù)血流灌注。各組手術(shù)完成后，分別縫合關(guān)閉腹腔。將其于清潔級(jí)條件下飼養(yǎng)，補(bǔ)充水及飼料。

1.2.2標(biāo)本的采集將各組動(dòng)物模型，于清潔級(jí)條件下飼養(yǎng)2 d。采用50 mg/kg戊巴比妥鈉將大鼠麻醉使其腹部朝上并于手術(shù)板上固定，用剪刀沿腹中線打開腹腔，使用一次性注射器抽取其腹靜脈血液于已標(biāo)記好的EP管中，并將其放置冰上暫存。然后找到左腎，用鑷子剝離左腎被膜，剪斷腎蒂，取出腎臟，立即置于冰上的培養(yǎng)皿中暫存。輕輕擠出腎臟中的血液，應(yīng)用紗布將其吸干，然后將腎臟縱向切開，取一小塊放于10%中性甲醛緩沖液中保存，其余部分組織切碎并分成幾份置于已加入RNlater的EP管中，于-20℃冰箱中保存。

1.2.3 腎臟功能學(xué)的檢測(cè)將以上收集的各組動(dòng)物血液放于4℃離心機(jī)中，4 000 r/min，離心10 min。使用加樣器分別收集EP管中上層血清成分，注意在吸取的過程中切勿觸到下層血細(xì)胞。然后分別檢測(cè)各組動(dòng)物血清肌酐(Cr)和血尿素氮(BUN)的含量。

1.2.4蘇木素-伊紅(HE)染色觀察腎臟組織結(jié)構(gòu)將10%中性甲醛緩沖液中的組織固定48 h后，對(duì)其進(jìn)行脫水、透明及包埋。使用石蠟切片機(jī)對(duì)于已包埋好的組織塊進(jìn)行切片，其厚度為5 μm，并于干燥箱中烘干。將各組石蠟切片進(jìn)行常規(guī)的HE染色，并在顯微鏡下觀察各組切片并進(jìn)行圖像的采集。

1.2.5RT-PCR法檢測(cè)各組中的腫瘤壞死因子(TNF)-α，白細(xì)胞介素(IL)-6，IL-10表達(dá)水平將保存于RNLater中的腎組織，取出少量，加入一定量的Trizol裂解液，裂解提取總RNA。按照TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書來逆轉(zhuǎn)錄合成相應(yīng)的cDNA，以cDNA 作為模板，分別加入TNF-α、IL-6、IL-10、β-actin引物及其他反應(yīng)液，然后分別進(jìn)行反應(yīng)得到PCR產(chǎn)物。TNF-α引物：正義:5’-GACCCTCACACTCAgATCAT-3′，反義：5′-TTGAAGAGAACCTGGGAGTA-3′；IL-6引物：正義：5′-TCCTACCCCAACTTCCAATGCTC-3′，反義：5′-TTGGATGGTCTTGGTCCTTAGCC-3′；IL-10引物：正義：5′-CACTGCTATGTTGCCTGCTC-3′，反義：5′-TGTCCAGCTGGTCCTTCTTT-3′；β-actin引物：正義：5′- TGTATGCCTCTGGTCGTACC-3′，反義: 5′-CAACGTCACACTTCATGATGG- 3′。采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察PCR產(chǎn)物，應(yīng)用凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行各電泳帶灰度值的測(cè)定。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS17.0軟件行t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1血清Cr和血BUN的檢測(cè)結(jié)果在第2天，Sham組Cr〔(0.7±0.08)mg/dl〕和BUN〔(18.7±4.5)mg/dl〕的濃度維持在正常水平，而I/R組Cr〔(5.3±0.75)mg/dl〕和BUN〔(148.1±25.1)mg/dl〕的濃度明顯增高(P<0.01)，POC組Cr〔(1.9±0.35)mg/dl〕和BUN〔(49.2±9.1)mg/dl〕的濃度顯著低于I/R組(P<0.05)。在再灌注1個(gè)月，三組中Cr的濃度無明顯差異〔Sham組(0.75±0.04)mg/dl,POC組(1.35±0.08)mg/dl,I/R組(1.75±0.25)mg/dl〕(P>0.05)。I/R組中Cr和BUN的濃度與其他兩組差異不明顯，但仍有高于Sham組和POC組的趨勢(shì)〔Sham組BUN(18.7±2.6)mg/dl，POC組(46.1±5.3)mg/dl,I/R組(68.3±13.7)mg/dl〕。

2.2各組動(dòng)物腎臟組織結(jié)構(gòu)的改變?cè)俟嘧? d，Sham組中腎組織形態(tài)正常。I/R組中腎組織結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著病變，腎小管上皮細(xì)胞腫脹，壞死細(xì)胞脫落至管腔造成管腔狹窄，并且出現(xiàn)蛋白管型等。而POC組的腎組織病變較輕，其形態(tài)接近于Sham組。見圖1。

2.3各組動(dòng)物TNF-α，IL-6，IL-10的表達(dá)水平再灌注2 d，Sham組TNF-α、IL-6、IL-10的表達(dá)很低，I/R組中TNF-α、IL-6的表達(dá)水平明顯升高，POC組TNF-α，IL-6的表達(dá)水平低于I/R組，而IL-10的表達(dá)水平明顯高于I/R組。見圖2。

圖1　腎臟組織學(xué)的檢測(cè)(×200)

圖2　TNF-α、IL-6、IL-10表達(dá)水平的檢測(cè)

3討論

RIPI是住院患者發(fā)病率和死亡率的一個(gè)重要原因〔6～9〕。RIPI主要?dú)w因于大量的活性氧簇(ROS)的產(chǎn)生以及炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致的一系列的細(xì)胞凋亡和壞死的發(fā)生〔10,11〕。POC是一種有效的保護(hù)手段，其最早是由Zhao等〔12〕在犬心肌缺血模型中提出來的，該研究是在再灌注早期通過一系列交替的動(dòng)脈再灌注和再閉塞的人工操作，其稱為后處理。已有報(bào)道〔13〕，POC在大腦、心臟、肝臟及腎臟等多種臟器中具有保護(hù)作用。

Cr和BUN作為臨床上檢測(cè)腎臟功能的主要指標(biāo)，其值的升高意味著腎臟的功能受到了損害。本研究結(jié)果表明，在缺血再灌注早期，POC可以大幅度降低血清中Cr和BUN的含量，使其恢復(fù)正常水平，而且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，I/R大鼠的腎功能逐漸代償。

TNF-α主要由活化的單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，是炎癥反應(yīng)的一個(gè)重要介質(zhì)。IL-6主要是由淋巴細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞合成和分泌，也是炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)，具有多種生物化學(xué)活性。本研究說明POC可以有效降低促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生。

IL-10由活化的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，作為一種重要的抗炎性細(xì)胞因子，能抑制促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生。本研究說明POC可以促進(jìn)抗炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生。

綜上所述，POC以降低缺血再灌注后的急性炎癥反應(yīng)，從而對(duì)大鼠的腎臟起到了保護(hù)作用。

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〔2013-09-12修回〕

(編輯袁左鳴)