曲美他嗪預(yù)處理BMSCs移植對(duì)心肌缺血再灌注大鼠心功能改善的影響

胡小武1惠杰沈振亞1滕小梅1楊君杰1陳維倩1

(蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科，江蘇蘇州215006)

摘要〔〕目的探討曲美他嗪(TMZ)預(yù)處理骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)移植到缺血再灌注(I/R)微環(huán)境下細(xì)胞生存及對(duì)心功能改善的影響。方法將TMZ預(yù)處理或未預(yù)處理的BMSCs與心肌細(xì)胞H/R上清液共培養(yǎng)，采用CCK-8法檢測細(xì)胞活性、RT-PCR檢測Bcl-2、Bax的基因表達(dá)水平。32只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham組)、心肌I/R組、干細(xì)胞移植組(BMSCs組)及TMZ預(yù)處理干細(xì)胞移植組(BMSCs+TMZ組)。建立大鼠心肌缺血再灌注模型，當(dāng)再灌注平穩(wěn)后于損傷心肌邊緣注入干細(xì)胞(細(xì)胞數(shù)5×105)。1 w后用熒光顯微鏡觀察BMSCs存活數(shù)，4 w后應(yīng)用超聲心動(dòng)圖評(píng)估心功能，TTC法檢測梗死面積，Western印跡分析移植周圍區(qū)域Bcl-2及Bax的蛋白表達(dá)。結(jié)果BMSCs與心肌細(xì)胞H/R上清液共培養(yǎng)后細(xì)胞活性顯著下降，但TMZ預(yù)處理后使其下降趨勢(shì)得到明顯逆轉(zhuǎn)。RT-PCR結(jié)果表明，與未預(yù)處理BMSCs相比，在TMZ預(yù)處理BMSCs中，Bcl-2基因表達(dá)水平上調(diào)，Bax基因表達(dá)水平下調(diào)。在體內(nèi)，術(shù)后1 w，BMSCs+TMZ組每個(gè)高倍鏡下雙標(biāo)記細(xì)胞數(shù)顯著高于BMSCs組。術(shù)后4 w，BMSCs+TMZ組和BMSCs組均較I/R組心功能明顯改善，心肌梗死面積縮?。粌山M間進(jìn)一步比較，BMSCs+TMZ組表現(xiàn)出了更進(jìn)一步的心功能改善與更小的心肌梗死面積。Western印跡結(jié)果表明，與未預(yù)處理BMSCs相比，在TMZ預(yù)處理BMSCs組中，Bcl-2表達(dá)上調(diào)，Bax蛋白下調(diào)。結(jié)論血運(yùn)重建聯(lián)合TMZ預(yù)處理BMSCs移植治療急性心肌梗死增加BMSCs存活和心功能的恢復(fù)上優(yōu)于單純BMSCs移植，可能通過上調(diào)Bcl-2及下調(diào)Bax的表達(dá)而發(fā)揮抗凋亡作用。

關(guān)鍵詞〔〕骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；急性心肌梗死；心肌缺血再灌注；曲美他嗪預(yù)處理

中圖分類號(hào)〔〕R541.4〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.30972696)

通訊作者：惠杰(1959-)，男，副教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事老年冠心病與心律失常的研究。

1蘇州大學(xué)心血管病研究所

第一作者：胡小武(1987-)，男，在讀碩士，主要從事老年冠心病的基礎(chǔ)與臨床研究。

Effect of trimetazidine preconditioning BMSCs transplantation on myocardial ischemia and reperfusion improved cardiac function in rats

HU Xiao-Wu,HUI Jie,SHEN Zhen-Ya,etal.

Department of Cardiology,the First Affiliated Hospital of Soochow University,Suzhou 215006,Jiangsu,China

Abstract【】ObjectiveTo investigate the survival of cells under the microenvironment after trimetazidine (TMZ)pretreatment bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs)transplanted to ischemia-reperfusion (analog revascularization)and the influence on cardiac function,and the mechanism.MethodsThe TMZ pretreatment or pretreatment hypoxia/reoxygenation (H/R)BMSCs supernatant of cultured myocardial hypoxia,CCK-8 was used to assay cell activity,RT-PCR was used to detect levels of Bcl-2,Bax gene expression.32 SD rats were randomly divided into Sham,myocardial ischemia and reperfusion(I/R),stem cell transplantation(BMSCs)and TMZ pretreated stem cell transplantation (BMSCs+TMZ)groups.BMSCs survival was observed by fluorescence microscope,four weeks later,the heart function was assessed by echocardiography,infarct size was tested by TTC,the protein expressions of Bcl-2 and Bax around the transplanted area were analyzed by Western blot.ResultsThe activities of cultured cells with BMSCs and cardiomyocytes after H / R supernatants were significantly decreased,but it declined after TMZ pretreatment significantly reversed.Compared with that of non-pretreated BMSCs group,after TMZ pretreatment,the Bcl-2 gene expression level was increased,while Bax gene expression levels was decreased.In vivo,after one week treatment,each high magnification double labeled cells was significantly higher in BMSCs+TMZ group than that of BMSCs group.After four weeks,the heart function was significantly improved in BMSCs+TMZ group and BMSCs group than that of I / R group,myocardial infarct size was reduced.Compared with non-pretreated BMSCs,Bcl-2 expression of BMSCs at TMZ pretreatment group was upregulated,whereas the expression of Bax was lower.ConclusionsRevascularization combined trimetazidine pretreatment BMSCs transplantation on acute myocardial infarction could increase survival of BMSCs and improve recovery of cardiac function.It may be related with upregulating the expression of Bcl-2 and down regulating the expression of Bax.

【Key words】Bone marrow mesenchymal stem cells；Acute myocardial infarction；Myocardial ischemia and reperfusion；Trimetazidine preconditioning

目前可通過及時(shí)開通病變血管部分挽救瀕臨死亡的心肌細(xì)胞和通過藥物抑制過度的心肌重構(gòu)，但對(duì)已死亡的心肌細(xì)胞仍無有效治療辦法。干細(xì)胞由于具有自我更新及定向分化為某種特定細(xì)胞的能力已開始應(yīng)用于臨床替代治療AMI和預(yù)防心梗后心衰的發(fā)生發(fā)展。然而，最近的研究顯示骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)移植后只有輕微有的甚至沒有看到心功能恢復(fù)〔1〕，而植入到心肌梗死區(qū)域的BMSCs細(xì)胞存活率低是主要問題〔2〕。

曲美他嗪(TMZ)作為是一種新型的抗心肌缺血藥物，能夠選擇性地抑制線粒體酶——長鏈3-酮酰輔酶A-硫解酶(3-KAT)、部分抑制脂肪酸β氧化(高耗氧產(chǎn)能途徑)、增進(jìn)葡萄糖氧化(低耗氧產(chǎn)能途徑)，提高心肌細(xì)胞氧的利用率，從而增加ATP合成〔3〕，與此同時(shí)還能顯著減輕細(xì)胞內(nèi)酸中毒、減輕Ca2+超載、減少自由基損害、減少細(xì)胞凋亡，從而起到保護(hù)心肌細(xì)胞的作用〔4〕。本研究擬探討TMZ預(yù)處理BMSCs移植到上述微環(huán)境下細(xì)胞的生存及對(duì)心功能改善的影響機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料、試劑及儀器無特殊病原體級(jí)新生1～3 d SD乳鼠28只，健康清潔級(jí)雄性SD大鼠32只，體重(200±50)g，由蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。TMZ純粉購自美國Sigma公司，乳酸脫氫酶(LDH)、超氧化物歧化物酶(SOD)、微量丙二醛(MDA)等試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，Bcl-2抗體購自美國Cell Signaling Tech 公司，Bax抗體購自英國Abcam公司。流式細(xì)胞儀為美國Beckman Coulter公司產(chǎn)品，超聲心動(dòng)圖檢測采用美國GE公司Vivid 7型彩色多普勒超聲儀。

1.2BMSCs的分離、培養(yǎng)與鑒定取6～8周齡SD大鼠的脛骨及股骨分離BMSCs，用全骨髓差異貼壁法培養(yǎng)及純化BMSCs，第3代細(xì)胞(P3代)經(jīng)鑒定后用于實(shí)驗(yàn)。

1.3心肌細(xì)胞的分離、培養(yǎng)無菌條件下取出新生1～3 d的SD乳鼠心臟，利用酶消化法和差速貼壁法獲得原代心肌細(xì)胞，取第3天的心肌細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.4心肌細(xì)胞經(jīng)缺血再灌注(H/R)處理后上清液的收集與檢測將心肌細(xì)胞換成無血清的DMEM培養(yǎng)液，放置于37℃、95%N2、5%CO2的缺氧(O2≤2%)培養(yǎng)箱中，3 h后再放于正常培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，并對(duì)其中的LDH、MDA及SOD進(jìn)行檢測(按照試劑說明書要求測定)。

1.5共培養(yǎng)的分組及細(xì)胞活性檢測將P3代BMSCs按相同的細(xì)胞密度接種于96孔板中，當(dāng)細(xì)胞生長至接近形成單層時(shí)，吸去培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)浸洗2次，分為四組：Control組為BMSCs+正常細(xì)胞培養(yǎng)液，H/R組為BMSCs+H/R上清液，TMZ組為TMZ預(yù)處理BMSCs+正常細(xì)胞培養(yǎng)液，TMZ+H/R組為TMZ預(yù)處理BMSCs+H/R上清液。上述TMZ+H/R組中BMSCs為先以10 μmol/L的TMZ預(yù)處理6 h，吸去培養(yǎng)液，用PBS浸洗2次，再加入H/R上清液繼續(xù)培養(yǎng)12 h。然后用CCK-8法檢測共培養(yǎng)后細(xì)胞活性，方法如下：(1)向上述每孔中加入10 μl的CCK-8溶液；(2)將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h；(3)用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度。每組3個(gè)平行孔，重復(fù)3次。

1.6RT-PCR檢測Bcl-2、Bax的基因表達(dá)以Trizol法提取各組BMSCs的總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和目的基因的擴(kuò)增。PCR引物Bcl-2(80 bp)，上游：5′GAACTGGGGGAGGATTGTGG 3′，下游：5′GGGGTGACATCTCCCTGTTG 3′；Bax(128 bp)，上游：5′CTCAAGGCCCTGTGCACTAA 3′，下游：5′TAGGAAAGGAGGCCATCCCA 3′；GAPDH(496 bp)，上游：5′CAAGGTCATCCATGACAACTTTG 3′，下游；5′GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG 3′。

1.7體內(nèi)移植前細(xì)胞標(biāo)記在體內(nèi)移植當(dāng)天用熒光染料CM-Dil標(biāo)記BMSCs，最后用PBS洗2遍，洗去未結(jié)合的CM-Dil，重懸，臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)，調(diào)整濃度為5×105/100 μl。

1.8I/R造模、實(shí)驗(yàn)分組和BMSCs移植以10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉后將其仰臥固定于動(dòng)物手術(shù)臺(tái)上。頸正中切口，于3、4氣管環(huán)處氣管切開插入氣管插管，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)輔助呼吸，設(shè)置呼吸頻率為90次/min，呼氣與吸氣比為1∶1，潮氣量為35 ml/kg。沿胸骨左緣第4肋間打開胸腔，暴露心臟，打開心包。冠狀動(dòng)脈左前降支(LAD)中、上1/3處穿繞無損傷縫線，將置于LAD下的無損傷縫線雙活結(jié)結(jié)扎，以結(jié)扎區(qū)室壁運(yùn)動(dòng)幅度減弱或消失、顏色變暗紫、心電圖相鄰的2個(gè)導(dǎo)聯(lián)ST段抬高>0.2 mV為結(jié)扎成功標(biāo)志。維持1 h后，放松結(jié)扎線，恢復(fù)血流灌注(模擬血運(yùn)重建)。將標(biāo)記的BMSCs以濃度為5×105/100 μl裝入微量注射器，32只大鼠隨機(jī)分為四組，每組8只：Sham組假手術(shù)組即冠脈只穿線不結(jié)扎，I/R組注射不含細(xì)胞的上清液，BMSCs組注射無藥物預(yù)處理干細(xì)胞，BMSCs+TMZ組注射藥物預(yù)處理干細(xì)胞。心肌內(nèi)注射區(qū)域?yàn)镮/R區(qū)邊緣4個(gè)點(diǎn)，每處25 μl，總體積為100 μl，注射成功后可見局部顏色由紅色轉(zhuǎn)為白色。

1.9大鼠血清中LDH、SOD及MDA的測定各組SD大鼠于I/R后3 h經(jīng)股靜脈取血2 ml，室溫3 000 r/min，離心10 min，獲得的血清進(jìn)行LDH、MDA及SOD的檢測(按照試劑說明書要求測定)。

1.10計(jì)數(shù)熒光標(biāo)記細(xì)胞數(shù)量術(shù)后1 w，各組隨機(jī)選2只，經(jīng)下腔靜脈注入10%的氯化鉀2 ml，使心臟停搏于舒張期。從胸腔取出心臟，用PBS洗去血污剔除血管脂肪等非心肌組織，經(jīng)結(jié)扎點(diǎn)位置橫斷切除心房及結(jié)扎點(diǎn)以上部分心室，烏氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶(OCT)包埋，立刻行快速冰凍切片機(jī)連續(xù)橫軸切片，片厚6 μm，二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)復(fù)染，直接熒光顯微鏡下觀察。每個(gè)心臟標(biāo)本至少各挑選具有一定間隔的切片3張，每張切片挑選I/R邊緣區(qū)4個(gè)視野，計(jì)數(shù)CM-Dil及DAPI雙標(biāo)記的細(xì)胞數(shù)量。

1.11心超評(píng)估心功能術(shù)后4 w，在彩色多普勒超聲儀(GE公司超聲工作系統(tǒng)，15 MHz探頭)上進(jìn)行大鼠心功能測定，于胸骨旁連續(xù)至少記錄3個(gè)左心室長軸和短軸，記錄測得的左心室射血分?jǐn)?shù)(EF%)和左心室短軸縮短率(FS%)。

1.12氯化三苯基四氮唑(TTC)法計(jì)算心肌梗死面積檢測超聲心動(dòng)圖后，按上述同樣方法處死動(dòng)物。將心臟標(biāo)本于-80℃冷凍30 min后沿左室長軸將左室橫切為厚約2 mm的薄片，稱重后將其置于30 ml 1%TTC溶液中，37℃水浴30 min。10%甲醛中浸泡過夜。根據(jù)不同的顏色將壞死心肌與存活心肌分離，分別稱重。以壞死心肌重量與左室心肌重量百分比表示心肌梗死面積。

1.13Western印跡檢測Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)100 mg鄰近移植位點(diǎn)的冰凍心臟組織置于裂解緩沖液中勻漿。裂解心肌組織獲取蛋白后，用二喹啉甲酸(BCA)比色法測定蛋白濃度。加入上樣緩沖液，煮沸變性，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗4℃孵育過夜，Tris鹽酸緩沖液(TBST)洗滌3次，再分別加入二抗室溫孵育1 h，TBST洗滌3次，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)發(fā)光，凝膠成像儀(美國BIO-RAD公司)內(nèi)保存圖片，并用圖像分析軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度分析。

2結(jié)果

2.1體外TMZ預(yù)處理對(duì)BMSCs活性的影響心肌細(xì)胞經(jīng)H/R處理后，其上清液中LDH、MDA活性顯著升高〔(18.17±2.36)U/L vs (79.35±4.11)U/L，(3.80±0.81)nmol/ml vs (8.58±1.10)nmol/ml，P<0.05〕，SOD活性顯著降低〔(13.88±1.82)U/ml vs (5.15±1.26)U/ml，P<0.05〕。BMSCs與H/R上清液共培養(yǎng)后，采用CCK-8法檢測結(jié)果表明細(xì)胞活性均顯著下降，但TMZ預(yù)處理后使其下降趨勢(shì)得到明顯逆轉(zhuǎn)(56.66%±4.41% vs 78.54%±4.34%，P<0.05)。

2.2TMZ預(yù)處理對(duì)凋亡相關(guān)基因的作用與未預(yù)處理BMSCs相比，在TMZ預(yù)處理BMSCs中，抗凋亡基因Bcl-2表達(dá)上調(diào)(0.978 4±0.068 42 vs 2.891 2±0.182 48)，而促凋亡基因Bax表達(dá)下調(diào)(1.061 8±0.086 28 vs 0.318 5±0.035 49)(P<0.05)。

2.3各組大鼠血清中LDH、SOD及MDA的含量比較與Sham組相比，再灌注后3 h其余各組LDH、MDA活性均顯著升高(P<0.05)，SOD活性均顯著降低(P<0.05)，三組組間兩兩比較無明顯差異(P>0.05)。見表1。

表1　再灌注3 h后各組LDH、MDA及SOD活性的

與Sham組比較：1)P<0.05

2.4移植BMSCs存活數(shù)在熒光顯微鏡不同波長下采集到的圖像利用計(jì)算機(jī)軟件合并，可見雙標(biāo)記移植細(xì)胞，BMSCs+TMZ組每個(gè)高倍鏡下雙標(biāo)記細(xì)胞數(shù)顯著高于BMSCs組(9.17±3.40 vs 4.73±2.72，P<0.05)。見圖1。

CM-DiI：呈紅色熒光，標(biāo)記細(xì)胞膜；DAPI：呈藍(lán)色熒光，標(biāo)記細(xì)胞核；Merge：為復(fù)合圖 圖1　兩組移植細(xì)胞的存活數(shù)量比較(×200)

2.5心功能和梗死面積比較超聲心動(dòng)圖結(jié)果顯示Sham組、I/R組、BMSCs組、BMSCs+TMZ組的EF值分別為(78.1±3.6)%、(54.7±2.3)%、(63.1±2.0)%及(70.7±2.8)%，BMSCs組、BMSCs+ TMZ組EF值高于I/R組(P<0.05)。四組的FS值分別為(38.8±2.8)%、(26.2±1.5)%、(31.0±2.7)%及(35.2±1.7)%，BMSCs組、BMSCs+ TMZ組FS值高于I/R組(P<0.05)。后三組的梗死面積分別為(31.2±3.2)%、(22.8±2.2)%和(17.0±1.5)%，與I/R組相比，BMSCs組、BMSCs+ TMZ組的心肌梗死面積顯著縮小(P<0.05)，BMSCs+ TMZ組的心肌梗死面積比BMSCs組進(jìn)一步縮小(P<0.05)。

2.6TMZ預(yù)處理對(duì)凋亡相關(guān)蛋白的作用與BMSCs組比較，BMSCs+TMZ組的Bcl-2表達(dá)顯著上調(diào)，而Bax表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)。見圖2。

圖2　各組Bcl-2與Bax的蛋白表達(dá)

3討論

當(dāng)發(fā)生急性心肌梗死AMI時(shí)，傳統(tǒng)的治療方法可選用溶栓治療、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療或急診冠脈旁路移植術(shù)，使病變血管支配的梗死區(qū)域盡早得到血液供應(yīng)，梗死面積減至最小，從而改善臨床預(yù)后。研究證實(shí)，組織缺血缺氧性損傷不但發(fā)生于缺血時(shí)，更主要發(fā)生于恢復(fù)血液灌注后，其部分機(jī)制與自由基清除酶系活性降低、自由基含量增多有關(guān)。SOD是體內(nèi)清除自由基的一類酶，其活性降低可使脂質(zhì)代謝產(chǎn)物MDA水平升高，MDA可造成細(xì)胞損傷，是再灌注損傷的重要機(jī)制之一。SOD和MDA可反映機(jī)體清除氧自由基的能力〔5〕。LDH是一種穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，存在于正常細(xì)胞的胞質(zhì)中，一旦細(xì)胞膜受損，LDH即被釋放到細(xì)胞外，通過檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH的活性，可判斷細(xì)胞受損的程度。

從理論上講，開通已閉塞的冠脈后改善了心肌局部的血液供應(yīng)，使移植細(xì)胞生存的微環(huán)境得到改善，有利于細(xì)胞存活，但即刻也造成再灌注損傷，不利于細(xì)胞存活。Yang等〔6〕表明，大多數(shù)植入的BMSCs無法在梗死后心肌存活，心臟急性I/R的局部微環(huán)境不適合干細(xì)胞生存，使得AMI再灌注后細(xì)胞直接移植的心臟功能和形態(tài)無顯著改善。細(xì)胞凋亡，氧化應(yīng)激和強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)是已知的造成供體細(xì)胞死亡的不利因素。本研究的體外部分及體內(nèi)研究部分，均證實(shí)I/R產(chǎn)生的嚴(yán)重細(xì)胞毒性和氧化應(yīng)激對(duì)BMSCs存活十分不利，這與上述研究觀點(diǎn)一致。

由于移植后的干細(xì)胞存活率低，使其治療受到限制。除了移植的時(shí)間和途徑影響外，急性期的細(xì)胞死亡被認(rèn)為是制約BMSCs保護(hù)作用的主要因素〔2〕。基因修飾和BMSCs的預(yù)處理策略是流行和有效的促進(jìn)BMSCs存活及功能恢復(fù)的方法。由于目前尚不清楚永久性基因修飾導(dǎo)致長期的基因和蛋白表達(dá)是否會(huì)導(dǎo)致腫瘤等副作用，從而限制了干細(xì)胞移植的臨床應(yīng)用。與此相反，預(yù)處理由于能夠快速、簡單、有效地提高干細(xì)胞移植效率，可能符合上述要求。干細(xì)胞的藥物預(yù)處理成為提高移植細(xì)胞存活和功能恢復(fù)的一種新方法〔7〕。本研究根據(jù)Wisel等〔8〕有關(guān)TMZ和H2O2在治療期間的最佳劑量與劑量/時(shí)間研究，確定TMZ預(yù)處理BMSCs的藥物濃度為10 μmol/L，藥物預(yù)處理時(shí)間為6 h。

細(xì)胞的凋亡過程受促凋亡基因和抑制凋亡基因雙重調(diào)控，兩者的平衡對(duì)維持細(xì)胞的功能非常重要。Bca-2基因是一個(gè)重要的凋亡抑制基因，Bax與Bcl-2的作用相反，Bcl-2/Bax比值決定細(xì)胞在受到凋亡信號(hào)刺激時(shí)是否發(fā)生凋亡〔9〕。Bcl-2/Bax比值增加，細(xì)胞趨于存活；比值下降，細(xì)胞趨于凋亡。本研究結(jié)果表明，在體外共培養(yǎng)各組中，TMZ預(yù)處理可使細(xì)胞的活力下降趨勢(shì)獲得明顯逆轉(zhuǎn)；上調(diào)Bcl-2水平，下調(diào)Bax水平。總之，TMZ預(yù)處理BMSCs增強(qiáng)了移植細(xì)胞在惡劣環(huán)境中的抗凋亡能力，從而有利于移植細(xì)胞功能發(fā)揮，使其在心功能的恢復(fù)上獲得了更進(jìn)一步的改善。

4參考文獻(xiàn)

1Meyer GP，Wollert KC，Lotz J，etal.Intracoronary bone marrow cell transfer after myocardial infarction:eighteen months′ follow-up data from the randomized，controlled BOOST (Bone marrow transfer to enhance ST-elevation infarct regeneration)trial〔J〕.Circulation，2006；113(10)：1287-94.

2Tang YL，Tang Y，Zhang YC，etal.Improved graft mesenchymal stem cell survival in ischemic heart with a hypoxia-regulated heme oxygenase-1 vector〔J〕.J Am Coll Cardiol，2005；46(7)：1339-50.

3Marzilli M.Cardioprotective effects of trimetazidine：a review〔J〕.Curr Med Res Opin，2003；19(7)：661-72.

4Kantor PF，Lucien A，Kozak R，etal.The antianginal drug trimetazidine shifts cardiac energy metabolism from fatty acid oxidation to glucose oxidation by inhibiting mitochondrial long-chain 3-ketoacyl coenzyme A thiolase〔J〕.Circ Res，2000;86(5)：580-8.

5Kaminski K，Bonda T，Wojtkowska I，etal.Oxidative stress and antioxidative defense parameters early after reperfusion therapy for acute myocardial infarction〔J〕.Acute Card Care，2008;10(2)：121-6.

6Yang YJ，Qian HY，Huang J，etal.Atorvastatin treatment improves survival and effects of implanted mesenchymal stem cells in post-infarct swine hearts〔J〕.Eur Heart J，2008;29(12)：1578-90.

7Haider HK，Ashraf M.Strategies to promote donor cell survival：combining preconditioning approach with stem cell transplantation〔J〕.J Mol Cell Cardiol，2008;45(4)：554-66.

8Wisel S，Khan M，Kuppusamy ML，etal.Pharmacological preconditioning of mesenchymal stem cells with trimetazidine (1-〔2，3，4-trimethoxybenzyl〕piperazine)protects hypoxic cells against oxidative stress and enhances recovery of myocardial function in infarcted heart through Bcl-2 expression〔J〕.J Pharmacol Exp Ther，2009;329(2)：543-50.

9Kaga S，Zhan L，Altaf E，etal.Glycogen synthase kinase-3β/β-catenin promotes angiogenic and anti-apoptotic signaling through the induction of VEGF，Bcl-2 and survivin expression in rat ischemic preconditioned myocardium〔J〕.J Mol Cell Cardiol，2006;40(1)：138-47.

〔2014-06-13修回〕

(編輯袁左鳴)