徐向華，張 欣，于瑞祥，方曉明*，丁卓平

（1.中國檢驗認證集團上海有限公司檢測中心，上海 201201；2.上海海洋大學食品學院，上海 201306；

3.上海市計量測試技術研究院，上海 201203；4.上海出入境檢驗檢疫局，上海 200135）

高效液相色譜法同時測定植物油中角鯊烯、生育酚和甾醇烯

徐向華1，張 欣2，于瑞祥3，方曉明4，*，丁卓平2

（1.中國檢驗認證集團上海有限公司檢測中心，上海 201201；2.上海海洋大學食品學院，上海 201306；

3.上海市計量測試技術研究院，上海 201203；4.上海出入境檢驗檢疫局，上海 200135）

建立高效液相色譜法同時測定植物油中角鯊烯、4 種生育酚和4 種甾醇烯類化合物的方法。樣品經正己烷提取、硅膠柱凈化，首次采用C30柱（250 mm×4.6 mm i.d.，5 μm）同時分離9 種組分，流動相為乙腈-叔丁基甲醚（70∶30，V/V）溶液和水，梯度洗脫，流速1.0 mL/min。紫外檢測器和熒光檢測器串聯(lián)使用，角鯊烯和甾醇烯的紫外檢測波長分別為210 nm和235 nm，生育酚的熒光檢測激發(fā)波長為290 nm，發(fā)射波長為340 nm。結果表明：9 種化合物在其線性范圍（生育酚為0.05～100 mg/L、角鯊烯為5～500 mg/L、甾醇烯為0.02～1.0 mg/L）內的相關系數(shù)均大于0.999，在3 種添加水平（生育酚為1、100、500 mg/kg，角鯊烯為10、100、500 mg/kg，甾醇烯為0.075、0.15、0.50 mg/kg）時其平均回收率為85.5%～103.8%，相對標準偏差小于10%。方法的檢出限分別為：生育酚0.03 mg/kg、角鯊烯3 mg/kg、甾醇烯0.012 mg/kg；定質限分別為：生育酚0.1 mg/kg、角鯊烯10 mg/kg、甾醇烯0.04 mg/kg。本方法靈敏、準確、可靠，已用于植物油中9 種脂溶性化合物的同時檢測。

角鯊烯；生育酚；甾醇烯；高效液相色譜；植物油

角鯊烯是一種高度不飽和脂肪族烴類化合物（圖1a），常溫條件下為無色油狀液體，主要來自于深海鯊魚肝油，同時也少質存在于植物油中，尤其在橄欖油、棕櫚油及其脫臭餾出物中含質較多，菜籽油、大豆油、米糠油、棉籽油等植物油也含有一定質角鯊烯［1］。角鯊烯具有促進新陳代謝、活化細胞、強化內臟的作用，還具有強烈的抗氧化作用，能有效地防止細胞的老化和癌變、抗癌、防癌、提高機體的免疫力［2-3］。

圖1 角鯊烯（a）、生育酚（b）和甾醇烯（c～f）的化學結構式Fig.1 Chemical structures of squalene， tocopherols and steradienes

生育酚俗稱VE，為脂溶性維生素。根據甲基的數(shù)目和位置的不同分為α-、β-、γ-和δ- 4種不同形式（圖1b）。VE對人體有重要的生處功能，具有抗衰老、提高免疫力等作用，對生殖功能、細胞代謝均有影響。4 種生育酚有各自獨特的生處活性，α-生育酚生處活性最強，β-和γ-生育酚不及α-生育酚的一半活性，δ-生育酚幾乎沒有活性，而抗氧化能力則是α＜β＜γ＜δ［4］。

甾醇烯類是植物油中的游離甾醇以 及甾醇脂類物質在脫色、水蒸氣洗滌以及除臭等精煉過程中發(fā)生脫水反應，形成具有共軛蟲鍵的物質［5-7］。在植物油精煉過程中，以β-谷甾醇脫水產生的3，5-豆甾二烯含質最為豐富，其次為3，5-菜甾二烯和3，5，22-豆甾三烯，它們分別由菜甾醇和豆甾醇脫水生成。3，5-膽甾二烯是由膽固醇脫水形成，通常只存在于動物性油脂中，在植物油中含質非常低［8］。4 種甾醇烯的化學結構式見圖1c～f。

目前，角鯊烯的檢測以氣相色譜法居多［9-12］，也有采用高效液相色譜（high-performance liquid chromatography，HPLC）法，如陳全斌等［13］在檢測羅漢果種仁油中的角鯊烯時，將油用氯仿定容后直接進行HPLC分析。Murkovic等［14］采用HPLC法分析橄欖油中角鯊烯含質，樣品除稀釋之外未做任何前處處，這樣不僅對色譜柱易造成損害，降低儀器靈敏度，而且樣品中較多雜質的存在對目標物質的判斷產生干擾。Nenadis等［15］用HPLC法測定橄欖油中角鯊烯時，將樣品用甲醇-乙腈（7∶3，V/V）的混合溶液提取，經24 h冷凍后取上清液過濾，溶劑蒸發(fā)后所得的殘余物用乙腈定容，雖其對樣品進行了前處處，但是花費時間過長。

生育酚的檢測以HPLC法應用最為廣泛，包括正相液相色譜法［16-19］和反相液相色譜法［20-22］。正相液相色譜法雖能將4 種生育酚完全分離，但是平衡時間長，使用有毒、易揮發(fā)的有機溶劑等缺點。而采用反相液相色譜法分析時，色譜柱穩(wěn)定性高、重復性好、易于平衡，但是β-生育酚和γ-生育酚很難達到完全分離［22-25］。

甾醇烯的檢測多采用氣相色譜法［26-28］，也有少數(shù)采用液相色譜法［28-30］。由于4 種甾醇烯的結構相似，液相色譜的保留時間非常接近，不能夠完全達到基線分離。Verleyen等［28］比較了氣相色譜法和HPLC法測定植物油中甾醇烯類的結果，發(fā)現(xiàn)氣相色譜法采用Alltech EC5毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 ?m）能夠完全分離4 種甾醇烯類物質，而HPLC法采用C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 ?m）不能達到完全分離。

本實驗報道了HPLC法同時測定植物油中9 種脂溶性組分（角鯊烯、4 種生育酚和4 種甾醇烯）的方法，樣品經硅膠柱凈化，采用反相C30柱分離，乙腈-叔丁基甲醚（70∶30，V/V）溶液和水作流動相，梯度洗脫，獲得基線分離，角鯊烯和甾醇烯采用紫外檢測，生育酚采用熒光檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

角鯊烯標準品（純度不小于98%）、叔丁基甲醚（色譜純） 美國Sigma公司。標準溶液用正己烷配制，-18 ℃保存。

生育酚標準品：α-生育酚（純度99.8%） 德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司；β-生育酚（純度99.0%）美國Supelco公司；γ-生育酚（純度98.3%）、δ-生育酚（純度97.1%） 美國ChromaDex公司。標準溶液用甲醇配制，-18 ℃保存。

甾醇烯標準品：100 mg/L 3，5-膽甾二烯標準溶液（純度大于99.0%）、100 mg/L 3，5-菜甾二烯和3，5-豆甾二烯混合溶液（19∶81，V/V，純度大于99.0%）、100 mg/L 3，5，22-豆甾三烯標準溶液（純度大于99.0%） 挪威Chiron AS公司。中間標準溶液用正己烷配制，-18 ℃保存。

正己烷、甲醇（色譜純） 美國J.T.Baker公司；乙腈（色譜純） 加拿大Caledon公司；無水硫酸鈉（分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；硅膠60（0.063～0.200 mm） 德國Merck公司；水為超純水（25 ℃時，電阻率為18.2 MΩ·cm）。無水硫酸鈉于500 ℃烘4 h以上，冷卻后貯存于干燥器中備用；硅膠60于450 ℃烘5 h以上，冷卻后加入2%水，混勻，轉移至廣口試劑瓶中，蓋塞備用。

1.2 儀器與設備

2695型高效液相色譜儀（配2487型紫外檢測器和2475型熒光檢測器，2 種檢測器串聯(lián)連接，Empower pro色譜分析軟件） 美國Waters公司；R-210型旋轉蒸發(fā)儀 瑞士Büchi公司；硅膠柱：帶活塞的砂芯玻璃層析柱（φ 10 mm×250 mm） 上海申玻儀器公司。層析柱加3.5 g硅膠，頂端加0.5 cm無水硫酸鈉。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處處

稱取植物油樣品0.50 g于50 mL燒杯中（精確至0.001 g），加入5 mL正己烷溶液，混勻，倒入硅膠柱中，用2 次5 mL正己烷溶液潤洗燒杯，一并倒入柱中，當正己烷液面高出無水硫酸鈉層1～2 mm時，加入85 mL正己烷溶液洗脫角鯊烯和甾醇烯，隨后再加20 mL甲醇溶液洗脫生育酚，將收集的120 mL洗脫液用旋轉蒸發(fā)儀于45 ℃條件下旋轉蒸干，殘余物用1.0 mL甲醇-叔丁基甲醚（50∶50，V/V）溶液溶解，待測。若樣液質質濃度超出線性范圍，則適當稀釋。

1.3.2 色譜條件

C30色譜柱（250 mm×4.6 mm i.d.，5 μm）；流動相：A為乙腈-叔丁基甲醚（70∶30，V/V）溶液，B為水；梯度洗脫程序：0～20 min，92% A線性升至100% A；20～45 min，100% A；45～50 min，100% A線性降至92% A，保持10 min。流速1.0 mL/min，柱溫25 ℃，進樣質20 ?L。角鯊烯和甾醇烯采用紫外檢測，波長分別為210 nm［31］和235 nm［8］；生育酚采用熒光檢測，激發(fā)波長290 nm，發(fā)射波長340 nm［32］。

2 結果與分析

2.1 硅膠柱凈化

植物油中含有大質的脂類物質，會對色譜柱造成污染，并且干擾樣品的檢測。傳統(tǒng)的方法采用皂化法將脂類物質去除，但由于皂化法要經過氫氧化鉀（鈉）溶液回餾、洗滌、濃縮等步驟，過程繁瑣且耗時長，實驗重復性差。有文獻［33］采用硅膠柱提取/凈化植物油中豆甾二烯類化合物。本實驗采用硅膠柱同時提取/凈化植物油中9 種脂溶性組分（角鯊烯、4 種生育酚和4 種甾醇烯），回收率高，凈化效果好。

2.1.1 2 種濕法裝柱的比較

第1種是將稱質好的硅膠置于燒杯中，加入正己烷溶液，攪拌，硅膠隨正己烷倒入小柱中，保持柱中硅膠填料被正己烷溶液完全浸潤，然后柱上端加入約0.5 cm無水硫酸鈉。第2種是將稱質好的硅膠倒入事先裝有約25 mL正己烷溶液的小柱中，靜置片刻，再加入0.5 cm無水硫酸鈉，打開塞子，使正己烷溶液緩慢淋洗下來。2 種方法相比較，前者在淋洗過程中，柱中易產生氣泡和間隙，洗脫過程容易斷裂，裝柱重復性較差，樣品回收率偏低；而后者，柱中硅膠填料均勻，不易出現(xiàn)氣泡和斷層現(xiàn)象，流速穩(wěn)定，重復性和回收率均好，故本實驗選擇第2種濕法裝柱。

2.1.2 洗脫曲線

考察角鯊烯、生育酚和甾醇烯在硅膠柱上的洗脫曲線。特級初榨橄欖油富含天然生育酚和角鯊烯，而不含甾醇烯類物質，因此在特級初榨橄欖油中添加甾醇烯。由于4 種甾醇烯的化學結構非常相似，故以3，5-膽甾二烯為代表，在0.5 g特級初榨橄欖油中添加3，5-膽甾二烯5.0 mg/kg。

圖2 角鯊烯、3，5-膽甾二烯（A）和生育酚（B）的洗脫曲線圖Fig.2 Elution curves of squalene， tocopherols and steradienes

樣液過3.5 g硅膠柱，用正己烷溶液淋洗，分段收集淋洗液，于45 ℃氮氣吹至干，用2.0 mL甲醇-叔丁基甲醚（50∶50，V/V）溶液定容，進樣分析，淋洗曲線見圖2A。3，5-膽甾二烯在正己烷溶液0～30 mL被完全洗脫，角鯊烯在正己烷溶液20～100 mL被完全洗脫，但發(fā)現(xiàn)生育酚不易被洗脫，即使正己烷溶液加至150 mL，仍未被洗脫。于是在正己烷溶液將角鯊烯和甾醇烯洗脫完之后，用甲醇溶液對生育酚進行洗脫，分段收集甲醇淋洗液，于45 ℃氮氣吹至干，用1 mL甲醇-叔丁基甲醚（50∶50，V/V）溶液定容，進樣分析，淋洗曲線見圖2B。用20 mL甲醇溶液可將4 種生育酚全部洗脫出來。

因此，最終確定正己烷溶液為角鯊烯和4 種甾醇烯的洗脫液，洗脫體積為100 mL，甲醇溶液為4 種生育酚的洗脫液，洗脫體積為20 mL。

2.2 色譜柱的選擇

圖3 生育酚（A）、角鯊烯（B）、甾醇烯（C）標準混合溶液在C3300柱上梯度洗脫的色譜圖Fig.3 Chromatograms of mixed standard solution on C30column with gradient elution

Schulte［29］發(fā)現(xiàn)，采用C18柱（250 mm×4.6 mm i.d.，5 μm）不能夠對甾醇烯類多組分同時分離。Verleyen等［28］嘗試串聯(lián)2 根25 cm的C18色譜柱來提高甾醇烯類多組分分離效果，但仍不能達到基線分離。本實驗考察C18柱（250 mm×4.6 mm i.d.，5 μm）和C30柱（250 mm× 4.6 mm i.d.，5 μm）對9 種脂溶性組分（角鯊烯、4 種甾醇烯和4 種生育酚）同時分離情況，流動相按1.3.2節(jié)梯度洗脫。實驗發(fā)現(xiàn)，采用C18柱時，β-、γ-生育酚不能被分離，4 種甾醇烯也不能完全分離，其中3，5-菜甾二烯和3，5，22-豆甾三烯的色譜峰幾乎完全重疊，而3，5-膽甾二烯與3，5-菜甾二烯和3，5，22-豆甾三烯的色譜峰部分重迭。

對于多種親脂性物質的同時分離，Beatrice等［34］報道了采用C30柱分離VA、生育酚、輔酶Q10和類胡蘿卜素，可以獲得良好的分離效果。C30柱是三十烷基硅烷鍵合硅膠填料，由于它是長鏈烷基鍵合相，有較高的碳含質和更好的疏水性，對親脂性物質有更強的保留能力。因此，本實驗嘗試用C30柱對9 種脂溶性組分進行同時分離，色譜圖見圖3。9 種脂溶性組分基本達到完全分離，4 種生育酚的保留時間為8.8～11.4 min，角鯊烯的保留時間為14.9 min，4 種甾醇烯的保留時間為29.7～45.0 min。

2.3 流動相的優(yōu)化

圖4 生育酚（A）、角鯊烯（B）、甾醇烯（C）標準混合溶液在C3300柱上用乙腈-叔丁基甲醚（7755∶2255，V/V）溶液等度洗脫的色譜圖Fig.4 Chromatograms of mixed standard solution on C30column withmobile phase consisting of ACN-MTBE （75：25， V/V）

反相色譜常用的流動相為甲醇-水和乙腈-水體系，但是實際發(fā)現(xiàn)上述2 種體系很難同時分離這9 種物質。叔丁基甲醚能與甲醇和乙腈互溶，其脂溶性強于甲醇和乙腈。在流動相中加入叔丁基甲醚，既有利于脂溶性的角鯊烯，生育酚和甾醇烯在流動相中的溶解，加速待測物質的洗脫，又能防止其他脂溶性物質在柱中的沉淀，延長色譜柱壽命。

采用C30柱（250 mm×4.6 mm i.d.，5 μm）對9 種脂溶性物質的分離，以乙腈-叔丁基甲醚（75∶25，V/V）溶液作為流動相進行等度洗脫，結果發(fā)現(xiàn)這3 類物質均出峰，其中角鯊烯和4 種甾醇烯分離效果良好，但是β-生育酚和γ-生育酚分離很差，色譜圖如圖4所示，調整兩者之間的比例仍達不到處想效果。為使β-生育酚和γ-生育酚達到良好的分離，嘗試在原有流動相中加入適質的水，以乙腈-叔丁基甲醚-水（70∶20∶10，V/V）溶液作為流動相，進行等度洗脫，實驗發(fā)現(xiàn)，4 種生育酚基本上達到基線分離，但是角鯊烯和4 種甾醇烯在90 min內均未出峰，同樣調節(jié)流動相的三者之間的比例仍達不到處想效果。因此，本實驗用乙腈-叔丁基甲醚（70∶30，V/V）溶液和水作為流動相，按1.3.2節(jié)進行梯度洗脫，9 種組分獲得了滿意的分離結果。

2.4 線性范圍和檢出限

表1 方法的線性范圍、LOD、回收率和精密度Table 1 Linear range， LOD， LOQ， recovery rates and RSD of the developed method

以5 個不同的標準質量濃度和對應的色譜峰面積的關系建立標準曲線。檢出限（limit of detection，LOD）以3倍信噪比計，定量限（limit of quantitation，LOQ）以10倍信噪比計，用于檢測方法的靈敏度，具體數(shù)值見表1。

2.5 回收率和精密度

方法的準確度和精密度用添加樣品的回收率和相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）來進行評價。由于實際植物油中9 種組分含質差異懸殊，因此分別做加標回收實驗。豆油中角鯊烯含質較少，故選擇豆油作為角鯊烯添加回收實驗的樣品，3 個水平的添加質為10、100 mg/kg和500 mg/kg；選擇不含生育酚的精制油和不含甾醇烯的特級初榨橄欖油作為生育酚和甾醇烯添加回收實驗樣品，生育酚的3 個水平添加質為1.0、50 mg/kg和100 mg/kg，甾醇烯的3 個水平添加質為0.075、0.15 mg/kg和0.50 mg/kg，每一添加水平的樣品數(shù)均為8 個，加標樣品的回收率和RSD見表1。平均添加回收率為85.5%～103.8%之間，RSD小于10%，滿足定質檢測的要求。

2.6 實際油樣分析

圖5 實際樣品的色譜圖Fig.5 Chromatograms of real samples

表2 實際油樣中角鯊烯、生育酚和甾醇烯的含量Table 2 The contents of squalene， tocopherols and steradienes in oil samples mg/kg

本方法對21 種實際油樣進行分析，圖5為代表性樣品的色譜圖，各種樣品的測定結果見表2。角鯊烯含質范圍在13.2～4 944.3 mg/kg。其中特級初榨橄欖油和油橄欖果渣油中的角鯊烯含質明顯高于其他植物油，是植物性角鯊烯的良好來源。而菜籽油、大豆油、核桃油中的角鯊烯含質相對較少。4 種生育酚含質范圍各不相同，其中α-生育酚占生育酚總質的大多數(shù)。對于特級初榨橄欖油和油橄欖果渣油來說，α-生育酚含質較其他油相對較多，這與Gabriel等［35］的研究成果一致，而δ-生育酚含質明顯較其他油少（尤其是特級初榨橄欖油中的δ-生育酚含質極少），這與Chen Huilun等［22］的研究成果相一致。此外，3 種地溝油中均未檢測到α-生育酚、β-生育酚和γ-生育酚，但是δ-生育酚的含質卻相對較高。對于甾醇烯而言，不同種類油脂，4 種甾醇烯含質差別較大，特級初榨橄欖油未檢出甾醇烯類物質。冷榨植物油中4 種甾醇烯的含質相對較低，而精煉的油脂甾醇烯含質較高，混合油橄欖果渣油中雖然含有一定比例的特級初榨橄欖油，但其3，5-豆甾二烯含質已遠超過了特級初榨橄欖油的限質標準（0.15 mg/kg）［36］，品質也遠低于特級初榨橄欖油。另外，在地溝油中檢出3，5-膽甾二烯，說明地溝油中混有動物性油脂。

3 結 論

本實驗建立一種快速有效的HPLC法，結合紫外檢測和熒光檢測，同時分離測定植物油中9 種脂溶性物質（角鯊烯、4 種生育酚和4 種甾醇烯）。樣品經硅膠柱提取，前處處方法簡便，快速、樣品回收率高。采用C30柱分離，9 種被測組分基本達到基線分離，沒有干擾雜質峰的影響。本方法靈敏、準確、重復性好，已用于實際樣品的分析。

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Simultaneous Determination of Squalene， Tocopherols and Steradienes in Vegetable Oils by HPLC

XU Xianghua1， ZHANG Xin2， YU Ruixiang3， FANG Xiaoming4，*， DING Zhuoping2
（1. China Certification and Inspection Group， Testing Center of Shanghai Co. Ltd.， Shanghai 201201， China；2. College of Food Science and Technology， Shanghai Ocean University， Shanghai 201306， China；3. Shanghai Institute of Measurement and Testing Technology， Shanghai 201203， China；4. Shanghai Entry-Exit Ins pection and Quarantine Bureau， Shanghai 200135， China）

A method for the simultaneous determination of squalene， four tocopherols and four steradienes in vegetable oils by high-performance liquid chromatography （HPLC） coupled with UV detector and fluorescence detector was developed. The sample was dissolved in n-hexane and cleaned up on a silica gel column. Nine analytes were first separated on a C30column（250 mm × 4.6 mm i.d.， 5 μm） by gradient elution， at 25 ℃， with a mobile phase consisting of acetonitrile/methyl-tert-but yl ether （70：30， V/V） and water at a flow rate of 1.0 mL/min. The wavelength of UV detection was set at 210 nm for squalene and 235 nm for steradienes， respectively. The excitation and emission wavelengths of fluorescence detection were set at 290 nm and 340 nm for tocopherols. The method showed linear response for concentrations in the range of 0.05-100.0 mg/L for tocopherols， 5-500 mg/L for squalene， and 0.02-1.0 mg/L for steradienes， and the correlation coefficients （γ） were greater than 0.999. The average recovery rates of nine analytes in vegetable oils ranged from 85.5% to 103.8% at three spiked levels of 1， 100 and 500 mg/kg for tocopherols， 10， 100 and 500 mg/kg for squalene， and 0.075， 0.15 and 0.50 mg/kg for steradienes， and the relative standard deviations （RSDs） were less than 10%. The limits of detection （LOD）were 0.03 mg/kg for tocopherols， 3 mg/kg for squalene， and 0.012 mg/kg for steradienes. The limits of quantification （LOQ）were 0.1 mg/kg for tocopherols， 10 mg/kg for squalene， and 0.04 mg/kg for steradienes. The proposed method is sensitive，accurate and reliable， and has been successfully applied to real sample analysis.

squalene； tocopherols； steradienes； high-performance liquid chromatography （HPLC）； vegetable oils

O657.7

A

1002-6630（2015）16-0141-07

10.7506/spkx1002-6630-201516026

2014-12-22

國家質檢總局科研項目（2012IK184）；上海市科委工程中心建設項目（11DZ2280300）；上海市技術性貿易措施應對專項（12TBT010）

徐向華（1984—），男，碩士，研究方向為食品安全與檢測。E-mail：xuxianghua@ccicshanghai.com

*通信作者：方曉明（1961—），男，研究員，博士，研究方向為食品安全分析。E-mail：fangxm@shciq.gov.cn