程鵬飛 王海霞 伯亞慧 周成旭 嚴小軍

(1. 寧波大學食品與藥學學院, 寧波 315000; 2. 浙江海洋大學國家海洋設施養(yǎng)殖工程技術研究中心, 舟山 316022)

角鯊烯是一類具有六個雙鍵的全反式三萜烯類天然化合物, 廣泛存在于動物、植物、微生物等多種生物中, 人體的皮脂中也有角鯊烯的存在[1, 2]。角鯊烯可以為膽固醇、膽汁酸和類固醇的合成提供碳骨架, 是動植物甾醇和三萜類物質(zhì)合成的重要中間產(chǎn)物。同時, 角鯊烯還具有多種生物活性, 如抗氧化、調(diào)節(jié)膽固醇代謝、解毒等, 被廣泛應用于功能性食品、藥品及化妝品等領域的研究開發(fā)[3—5]。

傳統(tǒng)的角鯊烯主要來源于鯊魚等海洋動物及某些植物。但由于對海洋野生動物及生態(tài)環(huán)境的保護, 角鯊烯生產(chǎn)受到極大限制。而以植物源的角鯊烯也受限于原材料的季節(jié)性以及密集勞動力需求。因此, 尋找并篩選可持續(xù)的角鯊烯資源, 利用某些微生物(尤其是微藻)以替代傳統(tǒng)的動植物來源, 對角鯊烯的生產(chǎn)成本降低及海洋生態(tài)環(huán)境改善都具有重要的意義。微藻是一類廣泛存在于淡水及海水, 可進行光合作用的低等植物, 并作為一種新型的角鯊烯替代來源已引起人們的關注[6]。微藻生物質(zhì)常用于多糖、蛋白質(zhì)、類胡蘿卜素等高價值物質(zhì)的生長, 在一定條件下能積累豐富的角鯊烯[7]。但目前對于以微生物(微藻)為角鯊烯潛在來源的研究并不常見, 利用微生物合成角鯊烯的機制仍未明確?；诖? 本文主要概述了高價值角鯊烯的特征、來源、代謝通路及生產(chǎn)應用, 以期為角鯊烯的工藝化生產(chǎn)與應用提供理論基礎。

1 角鯊烯的化學特征

角鯊烯是由六個異戊二烯單元作為基本碳骨架組成的高度不飽和長鏈三萜類化合物(圖 1), 分子式為C30H50, 是幾類常見甾醇的前體物質(zhì)。一般而言, 角鯊烯主要以對稱、線性或卷曲等幾種構象出現(xiàn)[8]。角鯊烯屬于脂質(zhì)不皂化物, 常溫下呈液態(tài),不溶于水, 易溶于乙醚、石油醚、丙酮及四氯化碳等有機溶劑, 具有較強的疏水性。由于其化學結構的高度不飽和性, 角鯊烯易在鎳、鉑等金屬作用下氧化形成角鯊烷[9]。此外, 細胞角鯊烯在有氧條件下會被進一步代謝, 以合成固醇的形式在細胞膜中存在。在有氧培養(yǎng)下, 角鯊烯的含量與培養(yǎng)時間密切相關, 隨著時間的延長, 其含量相應減少, 這可能與角鯊烯向固醇等下游產(chǎn)物的轉化有關[10]。因此,在實際利用微生物進行角鯊烯的工業(yè)化生產(chǎn)時, 還應考慮培養(yǎng)時間等因素對角鯊烯產(chǎn)量的影響。

圖1 角鯊烯及其前體的化學結構Fig. 1 Chemical structure of squalene and its precursor

2 角鯊烯的來源

目前, 角鯊烯的商業(yè)來源主要是深海鯊魚的肝臟油和高等植物種子油。相比于動物、高等植物源, 一些微生物或低等植物來源的角鯊烯目前也越來越受到重視, 它們快速生長的優(yōu)勢為角鯊烯基礎研究及其資源開發(fā)利用提供了新方向。

2.1 角鯊烯的動物來源

人們在過去幾十年的研究中發(fā)現(xiàn), 由于軟骨魚體內(nèi)沒有魚鰾, 需要借助脂肪和油等來降低它們的身體密度。因而, 鯊魚、鯨魚等軟骨魚體內(nèi)的角鯊烯含量較為豐富。鯊魚肝油中, 角鯊烯含量高達80%[11], 一般在40 g/100 g以上[12], 以獵捕鯊魚為代價提取其體內(nèi)角鯊烯而造成的海洋生態(tài)環(huán)境破壞不容忽視[13]。

在哺乳動物體內(nèi), 角鯊烯一般來源于外源食物的攝入, 部分也可通過生物的內(nèi)源合成。其中, 皮膚是人體產(chǎn)生角鯊烯的主要來源, 由皮脂合成的角鯊烯含量約占總脂質(zhì)的13%[14, 15]。人體角鯊烯的分泌因皮膚部位而異, 但只有極少量能進一步轉化為膽固醇, 攝入較高含量的角鯊烯也不會改變體內(nèi)膽固醇水平。因此, 適當增加血清中角鯊烯的含量不僅安全, 而且具有降低膽固醇等化學預防作用。

2.2 角鯊烯的高等植物來源

除了一些傳統(tǒng)的動物來源, 某些植物, 包括各類水果、葉子和子實體等也是角鯊烯生產(chǎn)的重要來源。Thorbjarnson等[16]于1935年首次在橄欖油中發(fā)現(xiàn)角鯊烯, 而后以植物為來源的角鯊烯研究與開發(fā)也受到越來越多的關注。橄欖油是公認的角鯊烯主要來源之一, 但其含量與生長階段、季節(jié)性有關, 難以滿足人們的需求[17]。此外, 由于橄欖油不是大宗化油類, 致使其角鯊烯生產(chǎn)始終有限。植物原材料的季節(jié)性生產(chǎn)和密集的勞動力需求等可能會限制其作為潛在替代來源[18], 進而限制角鯊烯的工業(yè)化應用[19]。隨著角鯊烯資源的“稀缺”, 海洋微生物生產(chǎn)角鯊烯或許有引人矚目的發(fā)展趨勢。

2.3 角鯊烯的微生物來源

為了追求可持續(xù)、環(huán)保的角鯊烯生產(chǎn)工藝, 近些年研究人員開始嘗試開發(fā)廉價無毒的角鯊烯生產(chǎn)方法。微生物發(fā)酵雖然積累的角鯊烯產(chǎn)量低于一些高等植物及鯊魚肝油等, 但發(fā)酵過程中具有生長周期短、產(chǎn)量高、方法簡單、原料豐富、價格低廉、環(huán)境約束少等優(yōu)點, 是一種經(jīng)濟有效的潛在角鯊烯生產(chǎn)方法。

Chang等[20]從海水中分離得到一株Pseudozymogenus, 利用葡萄糖和鈉氮作為營養(yǎng)源, 能產(chǎn)生340.52 mg/L角鯊烯。此外, 利用釀酒酵母(Saccharomyces cerevisia)的萜類途徑生產(chǎn)角鯊烯, 工程菌株(FOH-0)比野生型產(chǎn)生的角鯊烯產(chǎn)量提高了29.41倍[21]。盡管如此, 酵母生產(chǎn)角鯊烯含量依然相對較低, 適合大規(guī)模生產(chǎn)的工藝還需要進一步研究。

破囊壺菌(Thraustochytrids)由于缺乏固定碳的光合器官, 能在異養(yǎng)條件下生產(chǎn)較高含量的角鯊烯[22, 23]。研究發(fā)現(xiàn),ThraustochydridACEM 6063和Aurantiochytrium mangroveiFB1含有較高的角鯊烯, 分別可達到細胞干重的0.1和0.162 mg/g[24]。研究還認為,少數(shù)破囊壺菌屬可產(chǎn)生約占細胞干重30%的角鯊烯, 如Aurantiochytriumsp.18 W-13a菌株, 其角鯊烯含量可達干重的32%[25, 26], 是迄今為止發(fā)現(xiàn)的角鯊烯產(chǎn)量最高的微生物。Chen等[27]通過對Aurantiochytriumsp.生長所需的氮源谷氨酸鈉、酵母提取物及胰蛋白胨的最佳濃度進行了優(yōu)化, 最終角鯊烯含量和產(chǎn)率分別達到0.72 mg/g和5.90 mg/L。此外,研究還發(fā)現(xiàn), 酶抑制劑特比萘芬可以促進角鯊烯的生物合成, 并且對藻細胞生長的抑制作用較小[28]。然而, 利用破囊壺菌屬生產(chǎn)角鯊烯仍然在藻株選擇和累積動力學等方面存在不少問題。

不同的是, 微藻作為一種新型的角鯊烯替代來源已引起人們的關注。微藻是一類廣泛存在于各類水域中, 能進行光合作用的低等植物[6]。微藻生物質(zhì)常用于多糖、蛋白質(zhì)、類胡蘿卜素等高價值物質(zhì)的生長。一些典型微藻包括斜生柵藻(Scenedesmus obliquus)、萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、小球藻(Chlorella fusca)和布朗葡萄藻(Botryococcus braunii)等, 在一定條件下都能積累豐富含量的角鯊烯[7]。角鯊烯的含量在不同藻株之間有所差異, 且角鯊烯的累積程度與藻株的生長階段和脂質(zhì)積累密切相關[29]。

布朗葡萄藻被認為是可高產(chǎn)角鯊烯的優(yōu)勢藻株, 在合成過程中, 不會損害藻細胞, 其高產(chǎn)角鯊烯的代謝途徑為工程菌株的應用提供了方向。本文團隊前期將B品系葡萄藻B. braunii Showa貼壁培養(yǎng)于1/4 N濃度的BG11培養(yǎng)基中, 結果發(fā)現(xiàn)角鯊烯的含量約提高了50%, 而且對藻細胞生長影響不大,這意味著基于低N誘導的葡萄藻高產(chǎn)角鯊烯特性研究可以為闡釋角鯊烯代謝調(diào)控機制提供可行性思路[30]。此外, 前期研究還證實相比較于液體培養(yǎng),B品系葡萄藻在貼壁培養(yǎng)過程中具有較高的光合利用效率和生物量產(chǎn)率, 可誘導產(chǎn)生較高的角鯊烯[31]。該藻株生長緩慢的特性限制了角鯊烯的工業(yè)化生產(chǎn)[32], 但對葡萄藻產(chǎn)角鯊烯的代謝途徑展開研究是有必要的。此外, Fagundes等[33]在利用農(nóng)業(yè)廢水培養(yǎng)Phormidium autumnale生產(chǎn)角鯊烯時, 角鯊烯含量可達0.18 g/kg, 其中不飽和脂肪酸含量占52%, 這為角鯊烯低成本資源化生產(chǎn)提供了一種新的方法。

與傳統(tǒng)的動植物源油脂產(chǎn)角鯊烯相比, 微生物培養(yǎng)成本低, 可定向改造。同時, 在利用微藻產(chǎn)角鯊烯時, 還含有豐富的DHA、DPA等, 具有較廣闊的應用前景。但目前仍有待于進一步考察微藻藻株、提取工藝等的差異對角鯊烯含量的影響。此外, 在后續(xù)的研究中也可考慮微藻的異養(yǎng)或兼養(yǎng)發(fā)酵, 并對微藻進行定向培育以及通過基因工程手段,以獲得繁殖速度快且穩(wěn)定、高產(chǎn)的角鯊烯來源。

3 微生物細胞角鯊烯的代謝調(diào)控

由于角鯊烯的市場需求量較大, 使得通過人工對定向基因進行改造以實現(xiàn)角鯊烯的大規(guī)模生產(chǎn)成為可能。一般而言, 不同生物體合成角鯊烯的途徑有許多相似之處, 主要分為3個階段: 首先通過兩條獨立的途徑——甲羥戊酸途徑(MVA)與甲基赤蘚糖醇磷酸化途徑(MEP), 形成角鯊烯重要的前體物質(zhì)異戊二烯(IPP)和二甲烯丙基焦磷酸(DMAPP)[34];骨架形成階段, IPP與 DMAPP經(jīng)催化形成多種三萜骨架; 最終經(jīng)環(huán)化及后修飾完成三萜骨架的氧化、酰基化、糖基化及基團置換, 形成多樣的萜類產(chǎn)物。

3.1 原核生物中角鯊烯的合成

原核生物中角鯊烯的合成因物種而異。角鯊烯的前體物質(zhì)IPP和DMAPP主要通過MVA、MEP或由兩種途徑共同合成[34]。MEP途徑主要發(fā)生在真細菌和藍細菌中, 而MVA途徑主要存在于古細菌、真核生物和某些植物的細胞質(zhì)與線粒體中[35, 36]。一些專性寄生真細菌, 如立克次氏體或支原體由于可以從宿主細胞獲得IPP, 因而不會利用上述兩條途徑合成IPP[37, 38]。

以大腸桿菌(E. Coli.)為例, 真細菌中角鯊烯形成的MEP途徑如下圖所示(圖 2)。這條途徑的關鍵是1-脫氧-木酮糖-5磷酸合酶(DXS), 它在原核生物的MEP途徑中起著限速作用[39—43]。在MEP途徑中,DXS能催化丙酮酸與3-磷酸甘油醛(G3P)縮合生成1-脫氧-D-木酮糖-5磷酸酯(DXP), 進而在DXR酶的作用下反應形成MEP。Sangari等[44]在布魯氏菌(Brucella abortus)中發(fā)現(xiàn)了一種DXR樣酶(DRL酶),它同樣能夠催化DXP向MEP轉化。因此, 盡管有些細菌可能缺乏DXR, 但DRL酶的存在也可以催化該反應。隨后, MEP經(jīng)一系列焦磷酸化、脫羧和脫水等反應后, 形成IPP。形成的IPP在異戊二烯異構酶(IDI)的作用下, 進一步被催化生成DMAPP。此外,許多細菌中存在兩種類型的IDI, 即IDI Ⅰ型和Ⅱ型。Ⅰ型反應依賴二價陽離子, 在厭氧條件下的反應Ⅱ型需要金屬離子、FMN和NADPH的參與[45—47]。與大腸桿菌中典型的MEP途徑不同, 藍細菌細胞內(nèi)Ⅱ型IDI失活時, DMAPP也能通過其他替代途徑被合成。

圖2 大腸桿菌合成角鯊烯的MEP途徑[62]Fig. 2 Squalene synthesized via methylerythritol phosphate(MEP) pathway in E. coli.

古細菌大多利用MVA途徑合成角鯊烯, 例如極端嗜鹽桿菌(Halobacterium cutirubrum)或嗜酸桿菌(Caldariella acidophilus)[48, 49]。其中, 參與形成MVA的三種酶主要是羥甲基戊二酸單酰輔酶A合成酶(HMGS)、3-羥基-3甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGR)和甲羥戊酸激酶。此外, 在古細菌中也發(fā)現(xiàn)了IDI Ⅱ型。例如, 在一些鏈霉菌(Streptomyces)中, 發(fā)現(xiàn)了完整的MEP和MVA途徑[50]。研究表明,MEP途徑主要合成初級代謝產(chǎn)物, 在次級代謝物的合成中, MVA途徑并不是一個必需的代謝途徑[51, 52]。因此, 從目前的研究來看, 相比于MEP途徑, 利用MVA 途徑生產(chǎn)異戊二烯化起源更早且更為有效。

原核生物通過上述途徑形成IPP和DMAPP后,將會進一步合成法尼基焦磷酸(FPP), 然后在角鯊烯合成酶(SQS)的作用下, 兩個FPP分子縮合形成角鯊烯[53—55]。角鯊烯是生成三萜類化合物重要的前體物質(zhì), 可經(jīng)過角鯊烯環(huán)氧化酶(SQE)催化氧原子插入線性角鯊烯, 形成2, 3-氧化角鯊烯, 最后在2,3-氧化鯊烯環(huán)化酶家族的作用下, 經(jīng)過一系列氧化還原反應生成不同碳骨架的三萜類化合物。

原核生物形成角鯊烯后向其他化合物的轉化各不相同。細菌中主要是產(chǎn)生一些三萜類、五環(huán)藿烷類化合物參與細胞膜上的生物反應[56, 57]。藿烷類化合物主要維持膜完整性和滲透性[58], 并可以應對外部壓力, 如乙醇耐受性[59]、氧擴散[60]等。藿烷類化合物的合成始于角鯊烯, 由SQE催化, 也可能通過S-2,3-氧化角鯊烯環(huán)化酶合成甾體。以上兩種酶活性均在莢膜甲基球菌(Methylococcus capsulatus)中得到證實。最近, Lamb等[61]研究發(fā)現(xiàn)在角鯊烯形成后存在羊毛甾醇合成酶, 它是原核生物合成甾醇的一個關鍵組成部分, 這也證實了一些細菌可能具有合成甾醇的能力, 這可能是了解甾醇和甾體合成系統(tǒng)的關鍵。

3.2 微藻中角鯊烯的合成

與藍細菌不同, 目前對于其他微藻中角鯊烯的形成機制尚未明細。以布朗葡萄藻為例, 它能合成多種烴類化合物, 依據(jù)其合成碳氫化合物的種類,可分為A型、B型和L型[62]。A型布朗葡萄藻主要積累長鏈脂肪酸衍生而成的奇數(shù)碳的二烯烴或者三烯烴; B型布朗葡萄藻主要合成三萜類化合物如甲基化角鯊烯; L型布朗葡萄藻則主要合成四萜類化合物[63]。B型布朗葡萄藻中的角鯊烯主要通過由光合反應產(chǎn)生的底物經(jīng)MEP途徑合成[64, 65](圖 3)。簡言之, 兩個IPP和一個DMAPP分子縮合產(chǎn)生FPP。此外, 法尼醇或其衍生物法尼醛和3-羥基-2, 3-二氫法尼醛也可以作為FPP合成的底物[66, 67]。隨后, 兩個FPP分子縮合生成角鯊烯二磷酸酯, 并由SQS催化重排環(huán)丙烷的裂解從而產(chǎn)生角鯊烯。但環(huán)丙烷的直接裂解也會產(chǎn)生一種碳原子數(shù)為C30—C37的多不飽和三萜類碳氫化合物, 被稱為Botryococcenes, 隨后Botryococcenes進一步甲基化形成更高的同系物。目前, 已經(jīng)鑒定出了一種SQS酶, 但尚不清楚該酶是否能催化角鯊烯或Botryococcenes的合成[68, 69]。角鯊烯中未用于甾醇合成的部分通常被非特異性甲基化酶甲基化, 并與其他碳氫化合物一起儲存[70]。甲基化角鯊烯可進一步代謝產(chǎn)生botryoxanthins[71]、braunixanthin[72]和四甲基角鯊烯環(huán)氧化物[73]。然而, 一些環(huán)氧化酶會將角鯊烯轉化為氧化鯊烯[74]。因此, 需要阻止B型布朗葡萄藻產(chǎn)生的脂質(zhì)與氧原子接觸, 使得脂質(zhì)始終保持游離細胞外烴類化合物的形式, 例如Botryococcenes或甲基化角鯊烯。因此, 明晰B品系布朗葡萄藻產(chǎn)角鯊烯的代謝途徑和關鍵酶的作用是進一步研究的重點。

圖3 布朗葡萄藻合成角鯊烯的MEP途徑[74]Fig. 3 Squalene synthesized via methylerythritol phosphate(MEP) pathway in green algae B. braunii

3.3 酵母中角鯊烯的合成

7與許多真核生物相似, 酵母中甾醇的形成可以分為兩部分, 首先通過MVA途徑生成角鯊烯的前體物質(zhì)FPP, 進而由FPP分子縮合形成角鯊烯和甾醇等物質(zhì)(圖 4)。研究人員前期開展了許多以酵母為真核生物模型合成角鯊烯的系統(tǒng)性研究。一般認為, MVA的合成途徑始于乙酰輔酶A, 進而被還原為MVA。這個過程主要通過激活或降低HMGR表達來實現(xiàn)角鯊烯積累的高度調(diào)控。HMGR是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的完整蛋白質(zhì), 含有一個跨膜蛋白固醇敏感結構域, 在蛋白酶體的降解中起著重要的作用。MVA經(jīng)焦磷酸化、脫羧和脫水后, 形成IPP,然后在IDI的作用下, 進一步被催化生成DMAPP[75]。隨后, DMAPP在香葉基焦磷酸(GPPS)和法尼基焦磷酸合成酶(FPPS)的催化下, 依次與IPP單元生成FPP, 進而轉化為角鯊烯和甾醇, 或者直接合成異戊二烯化的細胞代謝產(chǎn)物, 如血紅素、多里醇和泛醌等物質(zhì)[76, 77]。

圖4 酵母中角鯊烯的合成途徑[88]Fig. 4 Squalene synthesis in yeast

酵母MVA途徑中的第一個調(diào)控點是HMGR。酵母細胞一般具有由HMG1和HMG2編碼的兩種HMGR酶, 粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces)除外, 僅包含一個HMGR基因[78]。研究表明, 截短的HMG1過表達將會導致HMG-CoA還原酶活性增加約40倍, 從而提高角鯊烯積累的干重產(chǎn)量[79]。雖然Hmg1p和Hmg2p在功能上相似, 但它們的表達調(diào)控卻不同。Thorsness等[80]報道血紅素能夠刺激HMG1的表達, 并會抑制HMG2的表達。此外, 將酵母細胞中的HMG1和HMG2敲除后, 由于無法生成甲羥戊酸而會失去細胞活性[80]。

前期合成的FPP分子進一步轉化, 將形成該途徑的終產(chǎn)物, 由兩個FPP分子結合在SQS Erg9p的催化下產(chǎn)生一個角鯊烯分子[81]。與HMGR相似, ERG9也受到高度的轉錄調(diào)控[82]。在正常生長條件下, 酵母中的角鯊烯不會在細胞內(nèi)積累, 它能有效地轉化為麥角甾醇。Milla等[83]在野生型的脂滴中僅檢測到了少量角鯊烯, 其余以甘油三酯(TAGs)和甾酯等形式存在。這也說明, 角鯊烯的積累并不會引起脂質(zhì)毒性作用。

在麥角甾醇合成途徑中, 通過上述反應形成的角鯊烯被SQE Erg1p[84]進一步轉化為角鯊烯環(huán)氧化物[85], 隨后進行2, 3-氧化角鯊烯的環(huán)化和羊毛甾醇的合成。該反應由ERG7基因編碼的羊毛甾醇合成酶催化[86, 87]。

目前, 對于角鯊烯代謝途徑的相關研究主要集中于酵母和大腸桿菌中, 而微藻生產(chǎn)角鯊烯的代謝通路仍不明晰。布朗葡萄藻因其低N下誘導產(chǎn)生角鯊烯的獨特的性質(zhì)有望通過對其基因注釋和相關基因功能分析, 篩選與角鯊烯合成有關的基因, 研究角鯊烯合成代謝通路, 為從基因層面探究微藻角鯊烯合成機制提供基礎。

4 角鯊烯的提取

一般來說, 角鯊烯主要貯藏在脂滴、膜及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等不同細胞器中。因此, 采取經(jīng)濟有效的方法從細胞中提取角鯊烯至關重要。目前, 角鯊烯的提取方法主要分為傳統(tǒng)提取方法和新型提取方法。由于角鯊烯是一種親脂性小分子化合物, 傳統(tǒng)的提取方法如皂化法等需要消耗大量有機溶劑, 存在熱不穩(wěn)定性, 且操作過程繁瑣、耗時等缺陷[89—91]。新型提取方法主要包括有超聲波輔助提取、固相萃取法和超臨界CO2提取法等, 這些方法在某種程度上能克服傳統(tǒng)提取過程的局限性[92]。

4.1 超聲波輔助提取法

超聲波輔助提取法, 指的是借助超聲波輔助溶劑從細胞中提取角鯊烯。在超聲波的強烈作用下,植物和其他原料的細胞壁被破壞, 使溶劑滲透到細胞內(nèi)充分反應。Kalaivani等[93]使用幾種方法從啤酒酵母中提取角鯊烯, 基于超聲波輔助粉碎酵母細胞, 并通過氯仿-甲醇混合有機溶劑提取, 能夠有效回收細胞中的角鯊烯。該研究發(fā)現(xiàn), 與60% KOH皂化法、酸性皂化法及玻璃珠法比較, 超聲波輔助提取法相對高效、安全, 且超聲波提取工藝回收的角鯊烯產(chǎn)率分別可提高3.5倍、10倍和8.1倍, 具有較好的應用前景。

4.2 固相萃取法

固相萃取法是利用選擇性吸附和解析來提取、分離、富集及純化植物油中角鯊烯的方法。該方法首先用正己烷或甲醇活化固相萃取柱(Strata SI-1柱和Bond Elute LRC氨丙基柱), 通過樣品溶解到固相萃取柱后進行洗脫及后續(xù)的角鯊烯分析[94]。Sagratini等[95]用正己烷活化硅膠固相萃取柱后, 用正己烷-乙酸乙酯(體積比9﹕1)進行樣品洗脫, 再以體積比為7﹕3的異丙醇-四氫呋喃溶解, 最后基于HPLC方法同時測得的角鯊烯、生育酚及β-胡蘿卜素等含量。與傳統(tǒng)的有機溶劑萃取法、皂化法相比, 固相萃取法具有有機溶劑消耗少、樣品回收率高等優(yōu)點。但該方法需要特定的萃取柱和萃取裝置, 這在一定程度上導致角鯊烯提取成本的增加。

4.3 超臨界流體萃取法

與其他方法不同, 超臨界流體萃取結合了液體和氣體的優(yōu)點, 分離選擇性較高, 可在低溫下提取,適用于分離和精制低揮發(fā)性、熱敏性、易氧化的物質(zhì)。由于CO2是一種“綠色溶劑”, 且無毒、不易燃、低廉可再生, 因此使用超臨界CO2提取角鯊烯是一種相對溫和的方法[96, 97]。利用超臨界CO2萃取技術從酒糟中分離提取角鯊烯, 樣品在12—30 MP和40℃的等溫條件下進行收集, 角鯊烯產(chǎn)量可達16.9 g/kg[98]。Kraujalis等[92]選擇超臨界CO2法提取角鯊烯, 當萃取壓力為55 MPa時, 添加5%的乙醇作為輔助溶劑對莧菜籽中角鯊烯和生育酚進行萃取,不皂化物中角鯊烯和生育酚含量分別為2.89 g/kg和317.3 mg/kg。Bouriakova等[99]對植物油脫臭餾出物(ODD)先進行超臨界乙醇酯化反應, 降低顆粒中FFA的含量, 再利用超臨界CO2萃取提取角鯊烯, 從橄欖、向日葵和大豆油中分別測定了角鯊烯的得率和純度。Bondioli等[100]利用超臨界CO2萃取法從橄欖油脫臭餾出物中回收角鯊烯, 該方法可回收約90%的高純度角鯊烯。比較而言, 超臨界CO2萃取法雖然萃取條件溫和、選擇性好、提取效率高、無毒害溶劑殘留, 但同時也存在設備成本高, 不能連續(xù)萃取等缺點。

總體來說, 目前已有的多種提取方法在甾醇、角鯊烯的分離及磷脂、多不飽和脂肪酸的萃取、分級等方面仍存在不同因素的限制。但隨著亞臨界、循環(huán)超聲等技術在油脂提取方面的應用與推廣, 角鯊烯提取制備技術有望實現(xiàn)新的突破。同時,在實際生產(chǎn)中應適當考慮經(jīng)濟效益情況, 選擇操作簡便、設備投資較低的提取方法, 或可考慮與其他技術相耦聯(lián), 以形成集成工藝在商業(yè)水平中降低成本, 獲得最大的經(jīng)濟效益。

5 角鯊烯的應用

角鯊烯作為一種有效的單線態(tài)氧淬滅劑, 含有六個非共軛雙鍵, 可以終止脂質(zhì)自氧化過程中過氧化物的鏈式反應, 以清除自由基, 實現(xiàn)抗氧化等作用。此外, 角鯊烯還可用于保健食品、化妝品和醫(yī)藥領域, 如抗衰老、抗疲勞、抗皮膚癌、修復細胞等[101]。

5.1 食品領域中的應用

角鯊烯作為一種自由基清除劑, 常以功能性食品添加劑的形式用于食品中, 制成膠囊, 以達到促進人體新陳代謝, 增強身體免疫力等目的。角鯊烯因具有良好的抗氧化活性, 已被添加到大豆油、花生油等食用植物油中[102], 通過抑制或延緩油脂氧化來提高食用植物油的穩(wěn)定性, 從而延長食品的保質(zhì)期[103]。然而, 角鯊烯因易氧化, 水溶性差等特性, 目前在我國仍未被明確列入食品添加劑的國家標準中。

5.2 化妝品領域中的應用

角鯊烯對自由基的穩(wěn)定性使人體皮膚表面能夠抵抗脂質(zhì)過氧化, 可作為保濕霜中的抗氧化劑、抗靜電劑和潤膚劑等。它能夠迅速滲透到皮膚中,不會留下油脂痕跡, 在與其他油脂和維生素充分混合后, 能避免高溫或紫外線對皮膚的傷害, 防止皮膚水分的流失, 從而達到保濕的目的。值得注意的是, 角鯊烯加氫后形成的角鯊烷是市場上比角鯊烯更有效的抗氧化劑, 純度高達99%。Okuda等[104]發(fā)現(xiàn), 角鯊烯經(jīng)過5%月桂基硫酸鈉處理后, 可以逆轉大鼠和人的皮膚失水狀況。因此, 角鯊烯在化妝品領域具有廣泛的應用價值。

5.3 醫(yī)學領域中的應用

在醫(yī)學領域, 角鯊烯佐劑常被廣泛用于疫苗和藥物載體[105], 可以刺激免疫系統(tǒng), 增強給定抗原的免疫反應。同時, 由于角鯊烯被公認為可以提高疫苗有效性, 這也是在近期全世界疫情大背景下制備新冠疫苗時所需的原材料之一。Schmidt等[106]發(fā)現(xiàn), 含角鯊烯的佐劑可使中和抗體反應增強約100倍, 并顯著降低病毒載量。同時, 作為合成甾醇的前體物質(zhì), 它對膽固醇的降低有一定作用, 可用于藥品和保健品, 以促進血液循環(huán), 預防和治療因血液循環(huán)不良引起的心臟病、高血壓、低血壓和中風等疾病, 顯著減緩冠心病、心肌炎、心肌梗塞等。研究人員通過添加外源角鯊烯可以降低HMGCoA還原酶的活性, 從而抑制膽固醇的合成[107]。Smith等報道角鯊烯可以通過激活過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARs)來調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝[2]。盡管角鯊烯對活體動物的心臟和血細胞有保護作用, 但其在活體動物中的作用機制尚不明確。

不僅如此, 許多研究結果還表明, 角鯊烯可以通過氧化應激發(fā)揮抗腫瘤作用, 或通過抑制某些致癌物的活性, 增強機體對腫瘤的抵抗力, 減輕上皮細胞的氧化應激反應。經(jīng)常大量食用包括橄欖油和鯊魚肝油等含角鯊烯產(chǎn)品的營養(yǎng)物質(zhì), 可以有效預防癌癥。在大鼠的活體實驗中發(fā)現(xiàn), 通過使用150 mg/kg環(huán)磷酰胺誘導實驗大鼠的毒性, 將不同濃度的角鯊烯[0.2—1.0 mL/(d·ind.)]添加到飲食中,0.4 mL劑量處理后能夠以最小劑量和最大效率減輕氧化損傷[108]。此外, 還有研究表明, 角鯊烯與抗腫瘤藥物阿霉素(角鯊烯基阿霉素, SQ-DOX)納米組裝后可以提高腫瘤細胞對阿霉素的敏感性, 降低心臟毒性, 具有顯著的抗腫瘤治療效果[109, 110]。Palaniyandi等[111]在對胃癌細胞系的體外研究發(fā)現(xiàn), 角鯊烯對癌細胞的增殖具有顯著抑制作用, 當角鯊烯濃度達到50μg/mL時, 抗胃癌效果更強。目前, 角鯊烯及其些衍生物也常被用作抗毒制劑[112]。除此之外, 角鯊烯對其他疾病如潰瘍、痔瘡、皮炎等也有一定的療效[113, 114]。

6 結論

角鯊烯因具有較強的生物活性而被廣泛應用于食品、醫(yī)藥及化妝品等領域。隨著對海洋野生動物、漁業(yè)資源及海洋環(huán)境的重點保護, 角鯊烯的商業(yè)化生產(chǎn)受到了極大限制。一些以破囊壺菌、微藻、酵母等微生物為綠色可持續(xù)源的角鯊烯開發(fā)越來越受到重視。目前的研究對于原核生物及以酵母為代表的真核生物的合成機制較為明晰, 對于以微藻這一成本低廉、易于繁殖、環(huán)境適應強的角鯊烯合成代謝通路研究較少。其中, 布朗葡萄藻在低氮脅迫下高產(chǎn)角鯊烯的代謝途徑或許為工程菌株的應用提供了方向。此外, 角鯊烯因自身易氧化、提取效率低、干擾物質(zhì)多等因素, 以及對綠色可持續(xù)源(藻類)角鯊烯合成途徑認知的缺乏, 角鯊烯的廣泛應用依然存在不少困難。因此, 未來的研究或可通過開展高含量角鯊烯的微生物(藻類)篩選, 利用基因工程手段提高角鯊烯代謝通路的相關水平, 以及優(yōu)化高效低成本的角鯊烯提取技術是角鯊烯產(chǎn)品開發(fā)與應用值得優(yōu)先考慮的技術工藝。