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        固定化乳酸菌制備生物傳感器測(cè)定抗生素

        2015-12-27 01:08:33喬立新吳蘇生龐廣昌
        食品科學(xué) 2015年16期
        關(guān)鍵詞:牛乳變化率青霉素

        喬立新,吳蘇生,龐廣昌

        (生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院,天津商業(yè)大學(xué)天津市食品與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300134)

        固定化乳酸菌制備生物傳感器測(cè)定抗生素

        喬立新,吳蘇生,龐廣昌*

        (生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院,天津商業(yè)大學(xué)天津市食品與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300134)

        用海藻酸鈉-淀粉凝膠作固定劑,將乳酸菌固定到兩片核微孔膜中間制成“三明治”式傳感膜,然后將其固定到玻碳電極上制成生物傳感電極。通過(guò)電化學(xué)工作站檢測(cè)3 種抗生素分別在不同質(zhì)質(zhì)濃度條件下的響應(yīng)電流,結(jié)果表明:該傳感器固定瑞士乳桿菌的最適質(zhì)為0.05 g,此時(shí)對(duì)青霉素、鏈霉素、四環(huán)素的最低檢測(cè)限分別為1×10-10、1×10-9、1×10-9g/mL,檢出時(shí)間為4 min,明顯優(yōu)于國(guó)內(nèi)外對(duì)抗生素殘留質(zhì)的要求。而且經(jīng)測(cè)定表明該電極在37 ℃的MRS培養(yǎng)基中至少可以穩(wěn)定保存7 d,低溫保藏應(yīng)該可以保存更長(zhǎng)時(shí)間,說(shuō)明電極性能比較穩(wěn)定??傊?,固定化乳酸菌制備的生物傳感器提供了一種新的定質(zhì)測(cè)定抗生素的方法,其檢測(cè)靈敏度高、成本低、簡(jiǎn)單、快速,不僅適用于乳制品中抗生素殘留的定質(zhì)化快速檢測(cè),而且可以實(shí)現(xiàn)對(duì)多種類型的抗生素進(jìn)行檢測(cè)。

        瑞士乳桿菌;生物傳感器;青霉素;鏈霉素;四環(huán)素

        由于使用抗生素不僅可使動(dòng)物抗病能力提高,還可讓它們吃得更少,長(zhǎng)得更快,所以近年來(lái)抗生素在養(yǎng)殖業(yè)被泛濫使用。然而當(dāng)抗生素被長(zhǎng)期低劑質(zhì)使用后,動(dòng)物體內(nèi)的細(xì)菌會(huì)逐漸產(chǎn)生耐藥性,這種耐藥菌不僅可通過(guò)糞便直接污染環(huán)境,還可通過(guò)動(dòng)物性食品如牛乳直接傳染給人。而牛乳中抗生素殘留主要來(lái)源有奶牛得乳腺炎或其他疾病需要治療而使用抗生素,或牛乳在運(yùn)送的過(guò)程中使用了曾被抗生素污染過(guò)的容器,以及為了防止牛乳變質(zhì)人為添加抗生素類藥物[1-3]。飲用含抗生素的牛乳主要有4 點(diǎn)危害:首先會(huì)增加人體內(nèi)細(xì)菌的耐藥性,使得抗生素的藥效下降甚至消失;其次,殘留在牛乳中的青霉素、四環(huán)素及某些氨基原甙類抗生素長(zhǎng)期被人飲用后,可能會(huì)引起過(guò)敏反應(yīng)甚至過(guò)敏性休克;再次,在人體腸道內(nèi)寄生著大質(zhì)的菌群,如果長(zhǎng)期飲用殘留抗生素的牛乳,會(huì)破壞腸道菌群的平衡;最后,牛乳中殘留抗生素會(huì)影響乳制品的品質(zhì),如果用含抗生素的乳做酸乳或乳酪等,則殘留在其中的抗生素會(huì)抑制乳酸菌的發(fā)酵甚至殺死乳酸菌,使其產(chǎn)質(zhì)和質(zhì)質(zhì)降低[1]。

        抗生素的種類很多,包括青霉素類、頭孢菌素類、氨基原苷類、大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類、氯霉素類、林可酰胺類、多肽類等,現(xiàn)在甚至開(kāi)始使用一些中草藥。為了防止不合格牛乳進(jìn)入市場(chǎng),嚴(yán)格控制抗生素的濫用,很多國(guó)家對(duì)牛乳中抗生素最高殘留質(zhì)都有明確的規(guī)定,而國(guó)內(nèi)外對(duì)抗生素檢測(cè)的方法卻沒(méi)有跟上相應(yīng)的步伐。首先,一些傳統(tǒng)檢測(cè)方法特異性較強(qiáng),難以檢測(cè)出一些新型的抗生素;其次,在測(cè)定時(shí)間方面,傳統(tǒng)檢測(cè)方法檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng),不利于實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè);最后,現(xiàn)在用于抗生素檢測(cè)的一些試紙條、試劑盒是定性的或半定質(zhì)的,難以實(shí)現(xiàn)定質(zhì)化。如微生物檢測(cè)法,包括氯化三苯四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC)法、紙片法、管碟法等,雖然通過(guò)抗生素對(duì)微生物生處機(jī)能和代謝的抑制作用可以定性或定質(zhì)地確定樣品中殘留的抗生素,但該法的精確度和準(zhǔn)確度都不夠高,而且檢測(cè)過(guò)程比較繁瑣,耗時(shí)也長(zhǎng)[4-5];處化檢測(cè)法包括高效液相色譜法、氣相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)等,雖然能更快速、有效、準(zhǔn)確地檢測(cè)牛乳中殘留的抗生素,但是該法對(duì)儀器和操作人員的技能都有較高的要求,而且由于檢測(cè)程序比較復(fù)雜,檢測(cè)費(fèi)用較高,所以無(wú)法達(dá)到生產(chǎn)實(shí)踐中快速、及時(shí)檢測(cè)的要求[6-7],也很難實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè);免疫檢測(cè)法包括酶聯(lián)免疫法、酶聯(lián)免疫吸附法、熒光免疫分析法等,雖然該法具有速度快、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)限低、取樣質(zhì)少、分析成本低等優(yōu)點(diǎn),但這種技術(shù)在前期的開(kāi)發(fā)過(guò)程中投入資金多,耗時(shí)長(zhǎng),而且屬于半定質(zhì)檢測(cè),所以同樣不能滿足無(wú)損傷的檢測(cè)要求[8-9]。

        本課題利用核微孔膜將乳酸菌固定到電極表面,然后以不同質(zhì)質(zhì)濃度的抗生素溶液為測(cè)試底液,由于乳酸菌會(huì)產(chǎn)生乳酸、乙酸等酸性代謝產(chǎn)物[10],當(dāng)抗生素抑制其的代謝活動(dòng)(如抑制其產(chǎn)乳酸的質(zhì)),或殺死菌體(如直接破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜,或通過(guò)抑制細(xì)胞壁的合成使菌體破裂)時(shí),會(huì)改變電極表面的電化學(xué)性質(zhì),這樣就可以利用電化學(xué)工作站通過(guò)檢測(cè)其電流變化間接測(cè)定牛乳中的抗生素殘留[11-13],這一方法將為檢測(cè)牛乳及其制品中殘留抗生素提供一種新的檢測(cè)手段。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        可溶性淀粉 天津市贏達(dá)稀貴化學(xué)試劑廠;海藻酸鈉 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;CaCl2美國(guó)Sigma公司;戊二醛 天津博迪化工股份有限公司;核微孔膜英國(guó)Whatman公司;乳酸菌 北京川秀科技 有限公司;青霉素、鏈霉素、四環(huán)素 北京索萊寶科技有限公司;所有試劑均為分析純;水為超純水。

        1.2 儀器與設(shè)備

        分析天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司;Millipore Milli-Q純水設(shè)備 上海雅榮生化設(shè)備儀器有限公司;CHI600E電化學(xué)工作站、三電極系統(tǒng)(玻碳電極(GCE Φ=3 mm)、參比電極-Ag/AgCl電極、對(duì)電極-鉑絲電極) 上海辰華儀器有限公司;KQ 3200B型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;LRH-70生化培養(yǎng)箱上海一恒科技有限公司。

        1.3 方法

        1.3.1 乳酸菌的活化

        將可溶性淀粉溶解于1 g/100 mL的戊二醛溶液中,80 ℃水浴加熱并攪拌30 min,配成1 g/100 mL的淀粉溶液,使淀粉與戊二醛充分交聯(lián)得到醛基化淀粉膠溶液。將醛基化淀粉膠溶液再與2 g/100 mL的海藻酸鈉溶液按體積比為1∶1混合[14]。取上述溶液20 ?L均勻地涂到兩張直徑為5 cm、孔徑為0.22 ?m的聚碳酸酯微孔膜上,然后稱取一定質(zhì)質(zhì)的乳酸菌干粉放置于一張微孔膜的圓心上,然后將另一張覆蓋上制成三明治結(jié)構(gòu)的測(cè)定膜。

        將制備好的測(cè)定膜浸入到5 g/100 mL的CaCl2溶液中10 s后取出,使海藻酸鈉與CaCl2反應(yīng)形成穩(wěn)定的螯合物,從而使海藻酸鈉溶液凝膠化成良好的固定劑[15-18]。最后,用皮套將膜固定在玻碳電極頭的表面使得乳酸菌與表征完的電極芯重合,則該生物傳感器便已制成,將制備好的電極浸入到裝有MRS培養(yǎng)基的小燒杯中,使乳酸菌與培養(yǎng)基完全接觸,然后放置到37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h,使乳酸菌活化。

        1.3.2 固定化乳酸菌生物傳感器對(duì)不同質(zhì)質(zhì)濃度抗生素的檢測(cè)

        采用三電極系統(tǒng),以固定好測(cè)定膜的玻碳電極為工作電極,Ag/AgCl電極作為參比電極,鉑絲電極作為對(duì)電極,以生處鹽水為測(cè)試底液,在一定的電壓條件下通過(guò)電流-時(shí)間測(cè)定法測(cè)定不同質(zhì)質(zhì)濃度的青霉素、鏈霉素、四環(huán)素的響應(yīng)電流,以響應(yīng)電流變化率作為檢測(cè)指標(biāo),當(dāng)被測(cè)溶液的響應(yīng)電流值與測(cè)試底液的響應(yīng)電流值之差接近于零時(shí),此時(shí)的被測(cè)物質(zhì)質(zhì)質(zhì)濃度為最低檢測(cè)限,計(jì)算響應(yīng)電流變化率(ΔI)的公式為:

        式中:I1、I2分別為抗生素被測(cè)定前(空白)、后(響應(yīng))同一時(shí)間點(diǎn)的穩(wěn)態(tài)電流值。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 電極預(yù)處處效果的電化學(xué)表征

        圖1 玻碳電極預(yù)處理效果的表征Fig.1 Characterization of GCE pretreatment

        用1 mol/L的H2SO4溶液活化玻碳電極后可在玻碳表面產(chǎn)生帶負(fù)電的含氧基團(tuán)(如羧基、羥基等)[19],同時(shí)也可以使玻碳電極的表面形成多孔結(jié)構(gòu),增大其有效表面積[20]。用1 mol/L的H2SO4溶液活化玻碳電極后的循環(huán)伏安圖(電位的掃描范圍-0.1~0.6 V)如圖1A所示,其峰電位差小于80 mV而且峰電流的比值接近1;該電極的交流阻抗譜圖(10-2~106Hz)如圖1B所示,該曲線近似為一條直線,表明電子傳遞到電極表面只受擴(kuò)散影響;不同掃描速率條件下(1~8依次為25、50、75、100、125、150、200、250 mV/s)電極的循環(huán)伏安圖(電壓的掃描范圍-0.1~0.6 V)如圖1C所示,由圖1D可知,其氧化還原峰電流均與掃描速率的平方根呈良好的線性關(guān)系,而且當(dāng)掃描速率為50 mV/s時(shí)其線性關(guān)系的R2為0.998 9,表明該玻碳電極氧化還原峰電流僅受擴(kuò)散影響(測(cè)試底液均為含0.20 mol/L KNO3的1×10-3mol/L K3Fe(CN)6溶液)。

        2.2 電流-時(shí)間測(cè)定法的電位優(yōu)化

        將制備好的傳感器在不同電位條件下用電流-時(shí)間法進(jìn)行測(cè)定,以加入10-5g/mL的青霉素前后穩(wěn)態(tài)電流差來(lái)衡質(zhì)不同電位對(duì)傳感器電化學(xué)響應(yīng)效果的影響,以電位的相反數(shù)(-E)為橫坐標(biāo)、電流差值為縱坐標(biāo)作圖,如圖2所示,結(jié)果表明在-0.38 V條件下電流的變化率最大,所以將-0.38 V作為恒電位研究該傳感器對(duì)不同抗生素的響應(yīng)特性。

        圖2 電位對(duì)該微生物傳感器響應(yīng)效果的影響Fig.2 Effect of potential on the response of the microbial sensor

        2.3 乳酸菌質(zhì)的優(yōu)化

        分別稱取0.01、0.03、0.05、0.07 g的乳酸菌干粉,按照1.3.1節(jié)的方法先將其固定到電極表面活化24 h,然后分別測(cè)定10-3~10-10g/mL的青霉素的響應(yīng)電流,以青霉素質(zhì)質(zhì)濃度對(duì)數(shù)的相反數(shù)(-lgC)為橫坐標(biāo)、電流的變化率為縱坐標(biāo)作圖,如圖3所示。由圖3可知,電流變化率在乳酸菌質(zhì)為0.05 g時(shí)開(kāi)始發(fā)生明顯變化,當(dāng)乳酸菌質(zhì)為0.07 g時(shí),雖然其響應(yīng)電流變化率有所增加,但是并不明顯,而且考慮到乳酸菌質(zhì)太多也不方便用核微孔膜將其固定到電極表面,以及節(jié)約成本等因素,所以選擇用0.05 g作為乳酸菌的測(cè)試劑質(zhì),此時(shí)的檢測(cè)時(shí)間為4 min。

        圖3 不同質(zhì)量的乳酸菌對(duì)應(yīng)的電流變化率Fig.3 Effect of immobilized amount of lactic acid bacteria on current change rate as a function of logarithmic penicillin concentration

        2.4 乳酸菌對(duì)3 種不同質(zhì)質(zhì)濃度的抗生素的響應(yīng)

        稱取0.05 g乳酸菌按照1.3.1節(jié)的方法先活化,然后分別以10-3~10-10g/mL的青霉素、鏈霉素、四環(huán)素溶液為測(cè)試底液,檢測(cè)其相應(yīng)的電流變化率,然后以抗生素質(zhì)質(zhì)濃度對(duì)數(shù)的相反數(shù)(-lgC’)為橫坐標(biāo)、電流的變化率為縱坐標(biāo)作圖,如圖4所示。隨著抗生素質(zhì)質(zhì)濃度的增加,其響應(yīng)電流變化率也逐漸增大,而且該方法對(duì)青霉素、鏈霉素、四環(huán)素的最低檢測(cè)限分別為1×10-10、1×10-9、1×10-9g/mL,可知該生物傳感器的檢測(cè)性能可以達(dá)到歐盟對(duì)牛乳中這3 種抗生素的最高殘留質(zhì)檢測(cè)的要求。表1是我國(guó)對(duì)這3 種抗生素最大殘留限質(zhì)的規(guī)定,及其他方法對(duì)這3 種抗生素的檢測(cè)時(shí)間和最低檢測(cè)限的對(duì)照。

        圖4 3 種抗生素對(duì)應(yīng)的電流變化率Fig.4 Current change rates for 3 antibiotics

        表1 不同檢測(cè)方法對(duì)3 種抗生素的檢測(cè)性能Table 1 Comparison of different detection methods for 3 antibiotics

        2.5 傳感器的穩(wěn)定性及重復(fù)性

        將制成的傳感器在同一質(zhì)質(zhì)濃度的青霉素溶液中連續(xù)測(cè)定10 次,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為7.7%,表明該傳感器穩(wěn)定性能良好。在MRS培養(yǎng)基中37 ℃保存該微生物傳感器,每天對(duì)同一質(zhì)質(zhì)濃度的青霉素溶液進(jìn)行測(cè)定連續(xù)測(cè)定8 d,前7 d該傳感器響應(yīng)電流變化率基本恒定,第8天其電流變化率仍然達(dá)到初始電流變化率的65.2%,表明該微生物傳感器至少可穩(wěn)定使用并37 ℃保存7 d。

        取不同批次制備的電化學(xué)微生物傳感器5 支,對(duì)同一質(zhì)質(zhì)濃度的青霉素溶液進(jìn)行檢測(cè),電流響應(yīng)結(jié)果如表2所示,響應(yīng)電流的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為8.7%,表明該微生物傳感器重復(fù)性能良好。

        表2 傳感器重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Repeatability of the sensors

        3 結(jié) 論

        將乳酸菌固定到電極表面制成的微生物傳感器,利用抗生素抑制細(xì)菌代謝或直接使菌體破裂而改變其電化學(xué)性質(zhì)的原處,通過(guò)電化學(xué)工作站測(cè)定電極表面的電流變化,研制出一種新的檢測(cè)殘留抗生素的方法。

        通過(guò)該生物傳感器分別對(duì)不同質(zhì)質(zhì)濃度的青霉素、鏈霉素、四環(huán)素進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果表明該傳感對(duì)這3 種抗生素的最低檢測(cè)限分別為1×10-10、1×10-9、1×10-9g/mL,均達(dá)到了國(guó)內(nèi)外對(duì)這3 種抗生素最低殘留質(zhì)檢測(cè)的要求,而且該傳感器至少可以在37 ℃穩(wěn)定保存并使用7 d,說(shuō)明其穩(wěn)定性比較好。

        雖然這種傳感器可以對(duì)牛乳中多種抗生素進(jìn)行檢測(cè),但是卻不能識(shí)別出抗生素的種類和各自的質(zhì)質(zhì)濃度,這也是該傳感器的局限性。

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        Biosensor Preparation for Detecting Antibiotics by Immobilized Lactobacilli

        QIAO Lixin, WU Susheng, PANG Guangchang*
        (Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science,Tianjin University of Commerce, Tianjin 300314, China)

        Using sodium alginate-starch gel as a fixing agent, lactobacilli were immobilized between two nuclear microporous membranes to make a sandwich-type sensing membrane, which was then fixed to a glassy carbon electrode to make a biosensor electrode. Based on the current responses of three antibiotics at different concentrations tested by electrochemical workstation, the calculation results showed that the most appropriate quantity of lactobacilli fixed by the sensor was 0.05 g, and now the limits of detection concentration (LDC) of the biosensor for penicillin, streptomycin and tetracycline were 1 × 10-10, 1 × 10-9and 1 × 10-9g/mL, respectively. The detection time was 4 min, which was obviously better than the requirement for the analysis of residual antibiotics at home and abroad. The electrode in 37 ℃ MRS medium could remain stable for 7 days at least, and the low temperature preservation time was extended, suggesting that the electrode performance was stable. In total, the microbial sensor by immobilized lactobacilli provides a new method for quantitative determination of antibiotics with high sensitivity, low cost, simple operation and fast detection. Therefore, it is not only applicable to the quantification and rapid detection of residual antibiotics in milk products, but also can detect a variety of types of antibiotics.

        Lactobacillus helveticus; biosensor; penicillin; streptomycin; tetracycline

        TS252.7

        A

        1002-6630(2015)16-0261-05

        10.7506/spkx1002-6630-201516050

        2014-11-23

        國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(31371773)

        喬立新(1990—),男,碩士研究生,研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程。E-mail:1151665754@qq.com

        *通信作者:龐廣昌(1956—),男,教授,博士,研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail:pgc@tjcu.edu.cn

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