甄玉萍,裴世春*,王 巖,高建偉,李 妍
(齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,黑龍江 齊齊哈爾 161006)
玉米樣品前處理方法和掩蔽劑對ELISA檢測玉米赤霉烯酮的影響
甄玉萍,裴世春*,王 巖,高建偉,李 妍
(齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,黑龍江 齊齊哈爾 161006)
探討粉碎時間、提取劑、掩蔽劑質(zhì)量分數(shù)等因素對酶聯(lián)免疫吸附分析(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法檢測玉米赤霉烯酮的影響。結(jié)果表明,玉米樣品粉碎時間180 s以上、70%甲醇溶液為提取劑、添加0.025%魚皮膠的磷酸鹽緩沖液為掩蔽劑時,檢測結(jié)果最為穩(wěn)定。本實驗結(jié)果對高穩(wěn)定性玉米赤霉烯酮檢測ELISA試劑盒的開發(fā)具有參考價值。
真菌毒素;玉米赤霉烯酮;酶聯(lián)免疫吸附分析法;定量檢測
玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZON)是常見的真菌毒素之一,常污染玉米、小麥、水稻等谷物,并通過加工過程會轉(zhuǎn)移到食品和飼料中,最終通過食物鏈危害人類的健康[1-2]。因此,關(guān)于ZON的檢測、去除及危害評估等方面[3-9]一直備受研究者們的關(guān)注,其中基于抗原抗體特異性反應(yīng)的ZON檢測酶聯(lián)免疫吸附分析(enzymelinked immunosorbent assay,ELISA)法因其具有快速、簡便、高通量等特點[4],已經(jīng)廣泛應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品及相應(yīng)食品中ZON毒素的檢測[5-9],但是,ZON的快速ELISA檢測方法在實際樣品的定量分析過程中常發(fā)生測定值偏差較大的現(xiàn)象,產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因涉及到眾多因素,其中樣品前處理方法和樣品基質(zhì)對抗原抗體反應(yīng)的影響可以認為是原因之一。雖然在提高樣品前處理效果的方法中有應(yīng)用超聲波、微波、超臨界等各種補助措施[10-14],但這些有悖于ELISA檢測的快速簡便的初衷,因此,在確保ELISA檢測方法的簡便、快速等特點的基礎(chǔ)上如何通過改善樣品前處理[15-17]和消除樣品基質(zhì)[18]的影響等措施提高ELISA檢測穩(wěn)定性相關(guān)研究已經(jīng)被研究者所關(guān)注。
為此,本研究選取污染了ZON的玉米為實驗材料,以ZON污染度的ELISA測定值為指標,分析玉米樣品的粉碎程度、提取劑的選擇、提取劑的體積分數(shù)、樣品基質(zhì)等因素對ELISA檢測結(jié)果的影響,以期為有效提高ZON檢測ELISA方法的穩(wěn)定性提供實驗性基礎(chǔ)。
1.1 材料與試劑
玉米采自黑龍江省玉米種植區(qū);甲醇、乙醇、乙腈、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、碳酸鈉、碳酸氫鈉、氯化鈉、氯化鉀、硫酸(均為分析純) 天津市廣成化學(xué)試劑有限公司;魚皮膠(fish skin gelatin,F(xiàn)G)、四甲基聯(lián)苯胺(tetramethylbenzidine,TMB)、ZON標準品美國Sigma公司;ZON偶聯(lián)抗原(ZON-BSA) 北京中科匯文遺傳技術(shù)發(fā)展中心;山羊抗小鼠IgG /辣根酶標記北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;抗ZON抗體 實驗室自行制備[19-20]。
1.2 儀器與設(shè)備
VICTOR X4多功能酶標儀、Wahser400 96 孔洗板機 美國GE公司;S-4300掃描電鏡 日本日立公司;Acquity超高效液相色譜-質(zhì)譜(ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry,UPLC-MS)聯(lián)用儀(光電二極管陣列檢測器、Masslynx4.1工作站) 美國Waters公司;HH.CP-7培養(yǎng)箱 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;PEFERENCE超純水系統(tǒng) 美國密理博公司;FA1004N電子天平 上海菁海儀器有限公司;TG1650-WS臺式高速離心機 上海汗諾儀器有限公司;HY-200篩子 北京祥宇偉業(yè)設(shè)備有限公司;AISITE高速萬能粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 緩沖液的配制
0.05 mol/L的碳酸鹽緩沖液(carbonate buffer solution,CBS)的配制方法:取1.59 g碳酸鈉、2.93 g碳酸氫鈉,加到1 000 mL去離子水中,加酸或堿調(diào)節(jié)pH值至9.6,置于4 ℃保存,備用。
0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution,PBS)的配制方法:取0.27 g磷酸二氫鉀、1.42 g磷酸氫二鈉、8.0 g氯化鈉、0.2 g氯化鉀,加到1 000 mL去離子水中,加酸或堿調(diào)節(jié)pH值至7.4,置于4 ℃保存,備用。
1.3.2 ZON檢測間接競爭ELISA方法
采用CBS作為抗原ZON-BSA的包被稀釋液,將其質(zhì)量濃度稀釋為0.25 μg/mL包被96 孔酶標板,4 ℃條件下過夜。用質(zhì)量分數(shù)為5%的脫脂奶粉作為封閉液,37 ℃封閉1 h后洗板3 次,每孔加入50 μL標準品/樣品,再加抗ZON單克隆抗體50 μL/孔,37 ℃孵育1 h后洗板3 次,加入以辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG 100 μL/孔,37 ℃孵育1 h后洗板3 次,加入TMB顯色液100 μL/孔,顯色15 min后,加入稀硫酸50 μL/孔作為終止液,用VICTOR X4多功能酶標儀在450 nm波長處測定OD值并計算樣品中的毒素含量。
1.3.3 UPLC-MS法
UPLC條件:色譜柱為Waters Acquity UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm,1.7 μm);流動相A為體積分數(shù)0.1%甲酸溶液,流動相B為乙腈;梯度洗脫條件為0~2 min,20% B;2~9 min,20%~95% B;9~9.1 min,95%~100% B;9.1~11 min,100% B;11~11.1 min,100%~20% B,11.1~13 min,20% B;流速0.3 mL/min;進樣量10 μL;柱溫40 ℃;樣品室溫度4 ℃;柱后分離進入質(zhì)譜儀。
質(zhì)譜條件:電離方式為電噴霧電離源;檢測方式為負離子[M-H]-模式;錐孔電壓40 V;毛細管電壓3.0 kV;離子源溫度100 ℃;脫溶劑氣流速600 L/h;反吹氣流量 10 L/h;質(zhì)量掃描范圍m/z 50~1 200。
1.3.4 粉碎樣品
玉米采摘后晾干,取足量玉米用高速萬能粉碎機對其進行磨碎并計時,計時時間分別為15、30、60、120、180、240 s。
1.3.5 粉碎樣品顆粒分布的測定
按時間磨粉后取出粉碎樣品,依次過20、40、60、80、100、120、140、160 目的篩子,然后分別稱質(zhì)量,計算每兩個篩子之間的樣品質(zhì)量占總質(zhì)量的百分比。
1.3.6 ZON的提取
用四分法分別從各時間段粉碎樣品中取5 g樣品,分別用50 mL體積分數(shù)為30%、50%、70%、90%的甲醇、乙醇、乙腈劇烈振蕩5 min[21],然后4 000 r/min離心5 min,取上清液作為樣品提取液,待用。以上步驟重復(fù)3 次。
1.3.7 添加FG對ELISA檢測的影響
在0.05 mol/L的PBS溶液中,分別添加0%、0.001%、0.01%、0.1%、1%、10%的FG,用其作為掩蔽劑,將ZON標品的質(zhì)量濃度以10 倍梯度稀釋為100、10、1、0.1、0.01、0 ?g/L,采用ELISA法進行測定。
1.3.8 FG掩蔽效果的測定
在1.3.7節(jié)測定結(jié)果的基礎(chǔ)上,確定可用FG的范圍,配制成稀釋液作為掩蔽劑,將1.3.6節(jié)所提取的樣品提取液平均分為2 份,一份添加體積均等的30 ?g/L的ZON標準品,一份添加體積均等的0.05 mol/L的PBS溶液,然后均采用1∶9的比例對提取液用配制好的梯度稀釋液進行稀釋。采用酶聯(lián)免疫法進行測定,添加毒素一組測定值為Cn(n≥1),未添加毒素一組測定值為Cn*(n≥1),用Cn-Cn*,所得數(shù)值與30 ?g/L標準添加值進行比較。
1.3.9 回收率實驗
在以上實驗的基礎(chǔ)上挑選幾組粉碎時間,將每組粉碎時間下的樣品均平均分為4 份,在前3 份樣品中分別添加量為500、50、5 ?g/L的ZON標準品,最后一份不加毒素做空白對照,采用以上經(jīng)過多次實驗得出的最佳提取條件進行提取,按照以上實驗所得的最適ELISA方法和UPLC-MS法進行測定,分別計算其回收率,比較2 種檢測方法的相關(guān)性。
2.1 粉碎時間與顆粒分布
玉米中ZON污染度的ELISA檢測過程主要包括玉米樣品粉碎、ZON毒素提取、提取液稀釋、抗原抗體特異性反應(yīng)等程序,其中玉米顆粒樣品的粉碎是所有ZON檢測方法中必須進行的一個過程,國內(nèi)針對ZON的檢測GB/T 23504—2009《食品中玉米赤霉烯酮的測定:免疫親和層析凈化高效液相色譜法》[22]規(guī)定,硬質(zhì)的糧食是用高速萬能粉碎機磨細后過1 mm的孔徑篩,但具體磨細到什么程度沒有界定,因此很難保障不同檢測者處理樣品時的一致性,進而有可能產(chǎn)生測定值的實驗誤差。
圖1 不同粉碎時間對樣品粒徑質(zhì)量分數(shù)的影響Fig.1 Effect of grinding time on the mass fraction of samples with different particle sizes
為了考察分析玉米粉碎程度對顆粒分布的影響,首先對粉碎時間與顆粒分布的相關(guān)性進行了測定,即利用高速萬能粉碎機按不同時間粉碎玉米后過不同目數(shù)的篩子,分別稱量后計算顆粒質(zhì)量分配比例,其結(jié)果如圖1所示,當粉碎時間從15 s延長到240 s時,小于100 目的大顆粒比例分別為61.21%、 41.06%、26.69%、13.04%、6.10%、4.95%,由此可知,隨著粉碎時間的延長,大顆粒玉米粉所占比例逐漸減小。當粉碎時間超過120 s時,表現(xiàn)為細顆粒開始明顯增加,但還有部分100~120 目的顆粒,而在粉碎180 s以后,顆粒分布發(fā)生顯著變化,過160 目及更細的顆粒比例超過了其他顆粒的質(zhì)量。由此實驗數(shù)據(jù)可知,隨著磨碎時間的不斷延長,不同顆粒大小的玉米粉分布具有顯著的變化,考慮到玉米不同大小顆粒的比例分布會產(chǎn)生比表面積的差異,進而有可能對玉米樣品中提取ZON的效果產(chǎn)生影響,因此有必要在實驗基礎(chǔ)上分析ELISA檢測ZON過程中樣品粉碎時間對ZON檢測結(jié)果的影響,進而為國內(nèi)ZON檢測GB/T 23504—2009中硬質(zhì)玉米樣品的粉碎方法的完善提供科學(xué)的實驗依據(jù)。
為了更好地觀察各時間段粉碎玉米顆粒的狀態(tài),將粉碎樣品在10 Pa真空度、15 mA離子電流條件下鍍金160 s,用掃描電鏡在20 kV加速電壓條件下進行觀察,其結(jié)果如圖2所示。當粉碎時間少于120 s時有大量的大顆粒玉米,當粉碎時間在180 s以后大顆粒玉米顯著減少,小顆粒玉米粉增多且分布較為均勻。結(jié)合圖1的顆粒分布測定結(jié)果可知,玉米的粉碎時間在180 s時,過100目以上的顆粒質(zhì)量合計超過93.90%,其中過160目以上的顆粒占總質(zhì)量的27.70%;玉米的粉碎時間在240 s時,過100 目以上的顆粒質(zhì)量合計達到95.05%,其中過160 目的顆粒占總質(zhì)量的35.82%。玉米的粉碎時間在180 s以上時雖然超過160 目以上的顆粒分布隨著粉碎時間的延長而增加,但是超過100 目以上的顆粒質(zhì)量總和沒有顯著變化,趨于穩(wěn)定狀態(tài)。
圖2 不同粉碎時間對玉米顆粒分布的影響Fig.2 Effect of grinding time on the particle size distribution of corn powder
2.2 添加FG對ELISA檢測的影響研究
用ELISA方法檢測玉米中的ZON毒素,一般程序是將玉米粉碎后用有機溶劑對毒素進行提取,然后對提取液進行稀釋后直接進行測定,這一過程中提取液及樣品基質(zhì)成分會影響ELISA的測定結(jié)果,因為在利用有機溶劑提取后的溶液中,會含有許多大分子蛋白、脂肪、色素等,這些成分甚至樣品溶液的pH值等都會非特異的影響抗體對抗原的親和作用,這種影響會降低抗體與抗原的結(jié)合能力,進而降低免疫檢測方法的靈敏度和可靠性。
消除基質(zhì)影響是免疫檢測方法應(yīng)用到實際樣品檢測中的重要保證,在傳統(tǒng)方法中,多采用稀釋法,降低這些基質(zhì)成分的質(zhì)量濃度來保證檢測方法的可靠性,但是,僅僅依靠單純的稀釋待檢測樣品的濃度并不能從根本上解決這些基質(zhì)成分的干擾,為此,于春娣等[23]試圖采用不同的掩蔽劑消除樣品提取液中基質(zhì)對檢測的影響,發(fā)現(xiàn)利用0.5%的FG-PBS在檢測西維因時克服基質(zhì)影響方面效果較好,但是,此種方法是否也同樣適用于ZON的檢測中的基質(zhì)影響消除,未有定論。
本實驗采用在PBS溶液中添加不同質(zhì)量分數(shù)魚皮膠的方法,用添有不同質(zhì)量分數(shù)魚皮膠的PBS溶液稀釋ZON標準品,經(jīng)過與抗原的競爭和抗體的特異性的結(jié)合,最后測得吸光度,分別建立標準曲線。其結(jié)果如圖3所示,將魚皮膠添加量定在0~10%,當魚皮膠添加到10%時,高質(zhì)量濃度魚皮膠本身就會對ELISA產(chǎn)生影響,而且隨著ZON含量的降低,魚皮膠對抗原抗體的競爭性反應(yīng)影響增大。用添加魚皮膠為0%的PBS溶液作為空白對照,添加的魚皮膠在1~10%時,對低于1 ?g/L的ZON測定值具有顯著性影響,而當魚皮膠添加至0.1%以下時,對利用ELISA方法測定ZON含量結(jié)果的影響明顯減小,因此在利用ELISA檢測ZON過程中,對魚皮膠的使用不應(yīng)該超過0.1%。
圖3 添加不同質(zhì)量分數(shù)的魚皮膠作為標品稀釋液建立標準曲線Fig.3 Standard curves established using 10-fold serial dilutions of fish skin gelatin in PBS buffer
2.3 FG的掩蔽效果與添加質(zhì)量分數(shù)的研究
為了驗證魚皮膠是否能作為玉米提取液的掩蔽劑以及在稀釋液中添加多少質(zhì)量分數(shù)的魚皮膠可以達到掩蔽的效果,按1.3.8節(jié)所述實驗進行測定與計算,其結(jié)果如圖4所示。當添加魚皮膠的質(zhì)量分數(shù)為0.1%、0.025%、0.006 3%、0.001 6%、0.000 39%的PBS溶液作為稀釋液時,測定結(jié)果分別為25.80、26.18、27.50、28.18、30.23、32.46 ?g/L,隨著添加魚皮膠質(zhì)量分數(shù)的增大,掩蔽劑的效果逐漸增強,但是在添加到0.1%時測定結(jié)果超過了標準添加值,表現(xiàn)為魚皮膠本身對ELISA測定結(jié)果產(chǎn)生了一定的影響,而當添加魚皮膠的量為0.025%時,與標準添加值30 ?g/L無顯著性差異,說明該添加量既對ELISA測定沒有影響,又可以消除基質(zhì)的干擾,有效提高了檢測精密度,當添加魚皮膠的量為0.006 3%時,與標準添加值差異顯著性較添加量為0.025%時略微增大,因此可知當添加魚皮膠的質(zhì)量分數(shù)為0.025%時,可顯著消除樣品基質(zhì)對ELISA測定的影響。本實驗結(jié)果與于春娣等[23]所做有一定的差異性,前人在建立基質(zhì)中的西維因標準曲線時,采用的西維因含量是0.1~1 000 ?g/L,添加FG-PBS的量為0.5%,本研究在建立ZON的標準曲線時,因ZON在谷物中的含量大多較低,國標[24]中對其限量有嚴格的要求,所以將其測定范圍定在0~100 ?g/L之間,在此測定范圍內(nèi)得出添加FG-PBS的量為0.025%為最佳。因此,本實驗中ELISA標準曲線制作過程中的標準毒素稀釋液和樣品提取液的稀釋液均使用質(zhì)量分數(shù)為0.025%的FG-PBS溶液。
圖4 添加不同質(zhì)量分數(shù)的FG對消除樣品基質(zhì)的影響Fig.4 Effect of fish skin gelatin concentration on the elimination of sample matrix
2.4 粉碎時間及提取溶劑對ELISA測定的影響
在2.1、2.2節(jié)和2.3節(jié)分析的基礎(chǔ)上,為了進一步考察顆粒分布及提取溶劑對ELISA檢測玉米中ZON含量的影響,選擇用不同體積分數(shù)的甲醇、乙醇、乙腈對不同粉碎時間的玉米樣品進行毒素提取,并利用ELISA進行定量測定,其結(jié)果如表1所示。
表1 粉碎時間及提取溶劑對ELISA測定天然玉米樣品中ZON含量的影響Table 1 Effect of grinding time and extraction solvents on the content of ZON determined by ELISA?g/L
在2.1節(jié)中已得知隨著粉碎時間的延長,過100 目篩子以上的顆粒累積總和由38.79%增加至95.05%,等到120 s之后,粉碎顆粒大于100 目的累積總和均在86.96%以上。為了進一步驗證玉米粉碎程度對ELISA檢測玉米中ZON的影響,在圖1粉碎分布實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上,對不同粉碎時間的樣品進行了ELISA檢測分析。
從表1可以看出,ELISA檢測ZON的測定值隨著玉米粉碎時間的延長,測定值在不斷的增加,從180 s時開始ZON的測定值和240 s時的測定值差異不顯著,結(jié)合圖1顆粒分布可知,玉米粉碎180 s后,100目以上顆粒分布趨于穩(wěn)定,因此,100目以上顆粒百分比可以作為一項ELISA檢測玉米中ZON毒素的一個處理指標。
提取溶劑的選擇也可從表1看出,根據(jù)數(shù)值進行比較,提取劑效果最好的是甲醇,其次是乙腈,乙醇也可進行毒素提取,但其提取效果不如前兩者。從溶劑的體積分數(shù)來看,70%的甲醇溶液為效果最佳,當粉碎時間達到180 s以后,50%的甲醇與70%的甲醇提取效果差異性并不十分顯著,但是在120 s以前有差異,說明當甲醇體積分數(shù)為50%時可能會對不同粉碎時間的樣品產(chǎn)生誤差。當甲醇體積分數(shù)過高達到90%時,提取毒素效果反而減弱,其減弱的機理有待于進一步研究。張藝兵等[25]在利用ELISA方法檢測ZON時,也采用了70%的甲醇溶液作為提取劑,劉濤[21]在谷物中ZON毒素ELISA的研究中,同樣使用了甲醇作為提取劑,本實驗結(jié)果也進一步證明了體積分數(shù)為70%的甲醇作為提取劑效果最佳。
為了驗證用ELISA檢測樣品中ZON含量結(jié)果的準確性,將粉碎時間為180 s,用70%甲醇作為提取劑的提取液采用UPLC-MS和Masslynx4.1工作站進行定性定量測定與分析,其結(jié)果如圖5、6所示。圖5為添加1 000 ?g/L的ZON毒素標準品圖譜,可以看出ZON的流出時間為5.66 min,對應(yīng)的其定性分子[M-H]-為m/z 317.15[26]。圖6為天然含有ZON的玉米樣品測定圖譜,同樣在5.66 min時出峰,且具有相同的分子離子峰([M-H]-,m/z 317.15),與ZON的標準品圖譜一致。將該標準毒素進行梯度稀釋后分別用UPLC-MS進行檢測,測得數(shù)值繪制標準曲線,將天然含有ZON的玉米樣品帶入標準曲線中進行計算,最終求得樣品中ZON的污染量為750.84 ?g/L,該數(shù)值與用ELISA測得的數(shù)值無顯著性差異,證明了以上結(jié)果的準確性。
圖5 ZON標準品離子流(A)及質(zhì)譜圖(B)Fig.5 Ion current chromatogram and mass spectrum of ZON standard
圖6 玉米樣品離子流圖(A)及質(zhì)譜圖(B)Fig.6 Ion current chromatogram and mass spectrumof corn sample
2.5 添加回收實驗結(jié)果
為了驗證表1采用ELISA方法所得的測定值的精確性和準確性,選取120、180、240 s粉碎時間的粉碎樣品,在粉碎樣品中添加不同水平的ZON標準品,用ELISA和UPLC同時進行檢測,分別計算其回收率,其結(jié)果如表2所示。由表2可知,ELISA測定值與UPLC檢測值基本一致,兩種檢測方法的回收率均在87%以上,因此,ELISA方法可應(yīng)用于樣品中ZON的檢測。
表2 ZON添加回收實驗結(jié)果Table 2 Recoveries of ZON from spiked corn
綜合上述實驗結(jié)果可知,當粉碎時間180 s以上,提取劑為甲醇,體積分數(shù)為70%,樣品稀釋液使用含有FG的質(zhì)量分數(shù)為0.025%的PBS溶液時,玉米中ZON毒素的ELISA檢測結(jié)果最為穩(wěn)定。本研究進一步明確了玉米粉碎程度、提取劑、掩蔽劑等因子對ELISA檢測ZON含量的影響,優(yōu)化了檢測效果,本實驗為高穩(wěn)定性檢測ZON ELISA試劑盒的開發(fā)提供了基礎(chǔ)性數(shù)據(jù),同時也為優(yōu)化其他真菌毒素的ELISA檢測方法的研究提供了新思路。
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Effect of Pretreatment Methods and Masking Agents for on the Detection of Zearalenone in Corn by ELISA
ZHEN Yuping, PEI Shichun*, WANG Yan, GAO Jianwei, LI Yan
(College of Food and Biological Engineering, Qiqihar University, Qiqihar 161006, China)
In the present study, the effects of grinding time, extraction solvents and different amounts of masking agents on the detection of zearalenone were explored. The most stable results were obtained when corn samples were ground for more than 180 s, and then extracted with 70% methanol using phosphate buffer solution with 0.025% fish skin gelatin as the masking agent. The findings of this study can provide a reference for the development of highly stable ELISA kit for the detection of zearalenone in corn.
mycotoxin; zearalenone; enzyme-linked immunosorbent assay; quantitative detection
R446.61
A
1002-6630(2015)16-0255-06
10.7506/spkx1002-6630-201516049
2015-04-28
齊齊哈爾大學(xué)研究生創(chuàng)新科研項目(YJSCX2014-015X);國家科技基礎(chǔ)性工作專項(2013FY113400);黑龍江省教育廳科學(xué)計劃項目(12541871)
甄玉萍(1990—),女,碩士研究生,研究方向為食品營養(yǎng)與安全。E-mail:15146694340@139.com
*通信作者:裴世春(1966—),男,教授,博士,研究方向為食品營養(yǎng)與安全。E-mail:1079481030@qq.com