蔣 麗，董 丹，邢亞閣，車振明*，羅建峰

（1.西華大學(xué)生物工程學(xué)院食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都610039；2.理縣塔斯酒莊有限公司，四川阿壩藏族羌族自治州623100）

5株酵母菌的系統(tǒng)發(fā)育樹分析以及發(fā)酵性能測(cè)定

蔣 麗1，董 丹1，邢亞閣1，車振明1*，羅建峰2

（1.西華大學(xué)生物工程學(xué)院食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都610039；2.理縣塔斯酒莊有限公司，四川阿壩藏族羌族自治州623100）

從四川藏區(qū)高原威代爾冰葡萄渣泥中分離純化出5株酵母，用18S rDNAD1/D2區(qū)域序列，通過序列比對(duì)及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析，通過WL培養(yǎng)基的培養(yǎng)觀察和普通光學(xué)顯微鏡觀察，并且進(jìn)一步對(duì)5種酵母菌的發(fā)酵性能進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明：JH、JH1、JH2、JH3和JH4分別鑒定為葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）、美極梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、解脂耶羅維亞酵母（Yarrowia lipolytica）和異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）。該5種酵母菌均有一定的發(fā)酵能力，并且發(fā)酵液總酚、還原糖、果糖以及總酸含量等均有不同變化。總體來說，JH2的發(fā)酵性能最好。

酵母菌；分離鑒定；發(fā)酵性能；系統(tǒng)發(fā)育樹

酵母菌是葡萄酒釀造的主要微生物，酵母菌是發(fā)酵過程的主導(dǎo)，不同的酵母可以賦予葡萄酒不同給感官風(fēng)味[1]。近年來人們開始重視眾多天然酵母在原產(chǎn)地葡萄酒生產(chǎn)中的重要貢獻(xiàn)，積極開發(fā)原生態(tài)天然菌群的耦合，實(shí)現(xiàn)多菌株組合發(fā)酵，充分凸現(xiàn)天然酵母的優(yōu)良特性，釀造味感豐富、香氣濃郁、風(fēng)格獨(dú)具的產(chǎn)地葡萄酒[2]。釀酒酵母屬的發(fā)酵特性因菌株的不同而存在明顯差異，菌株的不同導(dǎo)致利用的底物不同、生成的化學(xué)物質(zhì)不同，從而使發(fā)酵產(chǎn)物的風(fēng)味物質(zhì)存在差異，賦予產(chǎn)品獨(dú)特的風(fēng)味[3]。川西高原藏區(qū)阿壩州理縣以其特殊的氣候條件，開發(fā)研制了威代爾等系列冰葡萄酒，不僅酒體口感好，味道獨(dú)特，而且很受當(dāng)?shù)厝说南矚g[4]。在冰葡萄酒生產(chǎn)中，由于影響葡萄酒品質(zhì)的關(guān)鍵因素是其中的發(fā)酵微生物，而酵母菌作為主要的發(fā)酵微生物不僅對(duì)葡萄酒產(chǎn)量、質(zhì)量和發(fā)酵生產(chǎn)管理影響很大，而且對(duì)葡萄酒特色和風(fēng)格的形成也至關(guān)重要。所以為了找出更適合釀造冰葡萄酒的酵母菌，要求了解掌握酵母菌的一系列發(fā)酵性能。

隨著應(yīng)用于酵母菌分類的快速鑒定系統(tǒng)不斷面市，Biolog系統(tǒng)以其數(shù)據(jù)庫(kù)大、鑒定范圍廣，鑒定快速等優(yōu)點(diǎn)，目前已經(jīng)成為國(guó)際上酵母菌多相分類鑒定常用的技術(shù)手段[5-6]。已有文獻(xiàn)表明，Biolog系統(tǒng)對(duì)于釀酒酵母的鑒定具有好的效果，鑒定結(jié)果可達(dá)100%，在KUTTZMANC P等[7]提及到的所定的同種內(nèi)不同菌株間的差異不超過1%的標(biāo)準(zhǔn)。利用基因測(cè)序通過對(duì)威代爾葡萄汁發(fā)酵過程中的酵母菌JH、JH1、JH2、JH3和JH4菌種進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育樹分析，并進(jìn)一步研究了5株菌株的發(fā)酵性能，為川西藏區(qū)冰葡萄酒擴(kuò)大生產(chǎn)及品質(zhì)控制提供了一定的技術(shù)支持，對(duì)川西高原冰葡萄酒行業(yè)的發(fā)展具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

龍泉巨峰葡萄：西華大學(xué)紅光鎮(zhèn)。

1.1.1 菌種來源

從四川藏區(qū)高原威代爾冰葡萄渣泥中分離出5株酵母菌，分別編號(hào)為JH、JH1、JH2、JH3和JH4。

1.1.2 試劑

氫氧化鈉、基準(zhǔn)鄰苯二甲酸氫鉀、葡萄糖、果糖等其他試劑均為分析純：成都科龍化工廠。

1.1.3 培養(yǎng)基

WL營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：酵母浸粉0.5%，胰蛋白胨0.5%，葡萄糖5%，瓊脂2%。磷酸二氫鉀0.055%，氯化鉀0.042 5%，氯化鈣0.012 5%，氯化鐵0.000 25%，硫酸鎂0.012 5%，硫酸錳0.000 25%，溴甲酚綠0.002 2%，將上述成分配好后加熱溶解，pH 6.5，121℃滅菌20 min。

酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：酵母浸粉1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，瓊脂2%，pH自然，121℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

高壓滅菌鍋DHP-9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海益恒實(shí)驗(yàn)儀器公司；721分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；SHB-B型恒溫振蕩箱：金壇市富華儀器有限公司；pHS-25精密pH計(jì)：上海精科雷磁儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 酵母菌的形態(tài)學(xué)觀察

菌落形態(tài)特征：將篩選菌株接種與YPD液體培養(yǎng)基和WL固體平板上，29℃培養(yǎng)3 d，分別觀察固體菌落和液體菌落形態(tài)特征，液體菌落形態(tài)觀察以不加菌液為參比對(duì)象。

細(xì)胞形態(tài)特征：用接種環(huán)挑取少許WL平板上培養(yǎng)48 h的菌株，滴加1滴1%美蘭染色液染色后，在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)特征。

1.3.2 酵母菌的發(fā)酵性能實(shí)驗(yàn)

采用新鮮成熟的龍泉巨峰葡萄，運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室后破碎，調(diào)節(jié)pH值為3.6，二氧化硫含量為60 mg/kg，將5株酵母菌活化后，按0.6%的接種量分別接種與裝有500 m L新鮮葡萄漿發(fā)酵罐中，15℃恒溫發(fā)酵。測(cè)定指標(biāo)有總酸、還原糖、果糖、總酚含量，同時(shí)以不添加任何酵母菌的葡萄汁作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 總酚含量的測(cè)定[8]

正常發(fā)酵生產(chǎn)的葡萄酒中富含多酚類化合物。試樣中的多酚化合物在堿性條件下，與福林酚試劑形成藍(lán)色物質(zhì)，在波長(zhǎng)765 nm處測(cè)定吸光度值，可通過測(cè)定其吸光度值計(jì)算總酚的含量。

1.3.4 還原糖含量的測(cè)定

采用國(guó)標(biāo)GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中直接滴定法。

1.3.5 總酸含量的測(cè)定

采用國(guó)標(biāo)GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中電位滴定法，利用酸堿中和原理，用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液直接滴定樣品中的有機(jī)酸，以pH=8.2為電位滴定終點(diǎn)，根據(jù)消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積，計(jì)算試樣中的總酸含量。

1.3.6 果糖含量的測(cè)定

采用分光光度法測(cè)定發(fā)酵液中果糖的含量[9]。

1.3.7 ITS序列擴(kuò)增、測(cè)序以及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

對(duì)分離出的5株酵母菌進(jìn)行總脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）的提取、基因間隔序列（internal transcript space，ITS）序列擴(kuò)增以及測(cè)序[10-12]，然后用核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)GenBank中進(jìn)行同源序列搜索，用Blast軟件進(jìn)行同源性比較，采用MEGA5.2軟件進(jìn)行ITS同源性分析，繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

對(duì)于酵母菌株JH、JH1、JH2、JH3和JH4分別下載酵母屬13、11、15、17和15個(gè)相關(guān)菌種模式株的18S rDNA D1/D2區(qū)序列采用同樣方法進(jìn)行序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹分析。

采用18S rDNA序列分析法對(duì)分離出的菌株進(jìn)行分子鑒定。采用玻璃珠法[14]提取基因組總DNA：聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）體系為30 μL重蒸水，5 μL 10×PCR擴(kuò)增緩沖液（Mg2+Free），6 μL MgCl2（25 mmol/L），4μL三磷酸脫氧核苷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）（2.5mmol/L），正向引物NS1（5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′）和反向引物NS8（5′-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3′）各1 μL，1 μL Tap聚合酶（2.5 U/μL），2 μL總DNA模板。

PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸2 min，經(jīng)30個(gè)循環(huán)后最終72℃保持10 m in，然后等溫度降至4℃停止運(yùn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌的形態(tài)學(xué)觀察

2.1.1 菌落形態(tài)特征

各菌株在WL培養(yǎng)基上涂布培養(yǎng)3 d后，JH、JH1、JH2、JH3和JH4菌株的單菌落形態(tài)特征結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，單菌落的形態(tài)特征各不相同。JH菌落呈深綠色，平坦，表面光滑，不透明，奶油狀，邊緣光滑。JH1菌落呈棕色，平坦，表面光滑，不透明，奶油狀，邊緣光滑。JH2菌落呈奶油色帶淡綠色，球形突起，表面光滑，不透明，奶油狀，邊緣光滑。JH3菌落呈淡藍(lán)色，球形突起，表面光滑，不透明，奶油狀，邊緣光滑。JH4菌落呈乳白色，球形突起，表面光滑，不透明，奶油狀，邊緣光滑。

圖1 JH、JH1、JH2、JH3和JH4菌株固體培養(yǎng)菌落特征Fig.1 Colonial characteristics of cultured JH,JH1,JH2,JH3 and JH4 on solid agar medium

2.1.2 細(xì)胞形態(tài)特征

JH、JH1、JH2、JH3和JH4菌株的細(xì)胞形態(tài)特征見圖2。

圖2 JH、JH1、JH2、JH3和JH4菌株單體出芽生殖形態(tài)Fig.2 Morphology of individual spores germ ination o f JH,JH1, JH2,JH3 and JH4

由圖2可知，5種酵母菌細(xì)胞都呈卵圓形或球形，菌株的生長(zhǎng)方式為出芽生殖。

2.2 PCR擴(kuò)增目的基因的結(jié)果

標(biāo)準(zhǔn)品基因和目的基因擴(kuò)增電泳結(jié)果見圖3。由圖3電泳結(jié)果可知，對(duì)樣本的18S rDNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所擴(kuò)增片段的大小約為1.8 kb，和真核生物的18S rRNA/DNA基因片段大小一致，因此達(dá)到了對(duì)酵母的18S rDNA基因的PCR擴(kuò)增目的。通過基因測(cè)序，采用BLAST和ClustalX程序與GenBank中以收錄的酵母18S rDNA D1/D2區(qū)序列比對(duì)，鑒定出JH、JH1、JH2、JH3、JH4五種菌株分別為有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）、美極梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、解脂耶羅維亞酵母（Yarrowia lipolytica）和異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）。

圖3 目的基因擴(kuò)增電泳圖(瓊脂糖1%)Fig.3 PCR amplification electrophoretogram of target gene (agarose 1%)

2.3 實(shí)驗(yàn)菌株JH的序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

ITS區(qū)域核酸序列的相似性已經(jīng)成為確定酵母菌分類地位的重要分子生物學(xué)依據(jù)[14]，根據(jù)菌株JH、JH1、JH2、JH3、JH4的ITS測(cè)序結(jié)果進(jìn)行Blast分析，以18S rDNA序列同源性為基礎(chǔ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖4。

圖4 菌株JH(a)、JH1(b)、JH2(c)、JH3(d)和JH4(e)18S rDNA D1/D2基因序列NJ系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Neighbor-joining phylogenetic tree constructed from 18S rDNA gene D1/D2 sequence of JH(a),JH1(b), JH2(c),JH3(d)and JH4(e)

由圖4可知，菌株JH、JH1、JH2、JH3、JH4與GenBank中其他一些參考酵母菌株的親緣關(guān)系。其中菌株JH與葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）有較高相似性，相似度達(dá)99%以上，與其親緣關(guān)系最近，故鑒定菌株菌株JH為萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）。其中菌株JH1與美極梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）有較高相似性，相似度達(dá)99%以上，與其親緣關(guān)系最近，故鑒定菌株菌株JH1為美極梅奇酵母（Metschikowia pulcherrima）。菌株JH2與釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）有較高相似性，相似度100%，與其親緣關(guān)系最近，故鑒定菌株菌株JH2為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。菌株JH3與解脂耶羅維亞酵母（Yarrowia lipolytica）有較高相似性，相似度100%，與其親緣關(guān)系最近，故鑒定菌株菌株JH3為解脂耶羅維亞酵母（Yarrawia lipolytica）。其中菌株JH4與異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）有較高相似性，相似度100%，與其親緣關(guān)系最近，故鑒定菌株菌株JH4為異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）。

圖5 葡萄酒發(fā)酵期間總酚含量的變化Fig.5 Change of total phenols content during wine fermentation

2.4 總酚含量測(cè)定結(jié)果

由圖5可知，這五種發(fā)酵液中的總酚含量都隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)，速度較快，這有可能是因?yàn)榘l(fā)酵過程中酵母釋放次級(jí)代謝產(chǎn)物如丙酮酸、乙醛等到發(fā)酵液中，與多酚類的物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)生成一些大分子衍生物；此外，微生物產(chǎn)生的酶也會(huì)使其發(fā)生降解，導(dǎo)致水溶性不斷下降而沉淀下來[15]。添加JH1酵母的發(fā)酵液中的總酚含量下降得最快，從最初含量462.86 mg/L下降至112.86 mg/L，然而對(duì)于未添加酵母的發(fā)酵液中總酚含量變化趨勢(shì)是先快后慢，尤其是在前6 d，從496.79 mg/L下降至327.14 mg/L，在后期，總酚含量下降趨于平緩，是所有發(fā)酵液中減慢速度最緩慢。結(jié)果表明，在發(fā)酵后期，發(fā)酵液中總酚含量比較：添加JH1酵母的發(fā)酵液＜添加JH3酵母的發(fā)酵液＜添加JH4酵母的發(fā)酵液＜添加JH酵母的發(fā)酵液＜添加JH2酵母的發(fā)酵液＜未添加任何酵母的發(fā)酵液。

2.5 果糖含量測(cè)定結(jié)果

圖6 葡萄酒發(fā)酵期間果糖含量的變化Fig.6 Change of fructose content during wine fermentation

由圖6可知，在發(fā)酵葡萄汁初期，果糖最的含量達(dá)到1 751 μg/L，6種發(fā)酵液的果糖含量隨著發(fā)酵天數(shù)的增加逐漸減少，在發(fā)酵初期（0～6 d），果糖含量減慢的速度最快，在6～17 d內(nèi)，6種發(fā)酵液果糖含量下降緩慢，在發(fā)酵后期（17～23 d），其果糖含量基本保持平穩(wěn)，變化不大。從酵母菌發(fā)酵性能的差異性來分析，在發(fā)酵6d內(nèi)，添加JH和JH2酵母菌的發(fā)酵液在發(fā)酵中期果糖量最大，說明對(duì)果糖的利用率比較高，JH和JH2的果糖含量分別從1 685 μg/L下降至528.2 μg/L、416.11 μg/L，都比不添加酵母菌的發(fā)酵液減慢得快；但添加JH1酵母菌的發(fā)酵液消耗果糖量都比未添加酵母菌的發(fā)酵液小。從6 d到發(fā)酵結(jié)束，未添加JH酵母的發(fā)酵液消耗的果糖量比其他5種方式消耗的果糖量多，然而，添加酵母菌JH1、JH2、JH3和JH4酵母菌的發(fā)酵液中消耗果糖含量比未添加酵母菌消耗的果糖量少，這是可能添加的酵母菌有可能會(huì)抑制其他酵母菌的生長(zhǎng)，使果糖的利用率降低。但在發(fā)酵后期，所有發(fā)酵液中的果糖含量降低速率基本一致即趨于平緩，這可能因?yàn)樵诎l(fā)酵后期酒精含量增加，抑制酵母菌的生長(zhǎng)；或是在發(fā)酵后期酵母菌數(shù)量減少也會(huì)使糖的利用率降低。

圖7 葡萄酒發(fā)酵期間總酸含量的變化Fig.7 Change of total acid content during wine fermentation

2.6 總酸含量測(cè)定結(jié)果

葡萄酒中的酸類物質(zhì)可以平衡酒體。適量的酸含量能在口感上平衡酒體里的酒精和甜度，讓葡萄酒甜而不膩，增強(qiáng)葡萄鮮果的水果風(fēng)味，增加味覺的舒適性[16]不同葡萄汁發(fā)酵過程中，不同酵母菌在相同溫度下總酸含量變化如圖7所示。由圖7可知，在0～6 d內(nèi)，添加JH、JH1、JH3和JH4菌的發(fā)酵液中的總酸含量在降低，而JH2和為添加酵母菌的發(fā)酵液總酸含量在0～5 d降低；隨著時(shí)間的增加，6種發(fā)酵液的總酸含量都平緩增加。根據(jù)池成[17]報(bào)道醋酸菌會(huì)導(dǎo)致葡萄酒中醋酸等揮發(fā)酸含量顯著升高，使葡萄酒產(chǎn)生特殊的令人不愉快的酸苦味，所以在葡萄酒釀造中合理控制發(fā)酵過程中總酸的產(chǎn)生是釀造葡萄酒的重要工藝流程之一。當(dāng)發(fā)酵到最后各發(fā)酵液中總酸含量的比較：JH1＞JH2＞JH＞JH4＞原液＞JH3，說明JH菌產(chǎn)生的總酸最多，其次是JH2、JH、JH4和未添加酵母菌，產(chǎn)生總酸最少是添加JH3菌的酵母菌。

2.7 還原糖含量測(cè)定結(jié)果

圖8 葡萄酒發(fā)酵期間還原糖含量的變化Fig.8 Change of reducing sugar content during wine fermentation

由圖8可知，6種發(fā)酵液的糖度隨著發(fā)酵天數(shù)的增加逐漸減少，在發(fā)酵初期（0～9 d），還原糖減慢的速度較緩慢，在9～12 d內(nèi)，6種發(fā)酵液還原糖含量急劇下降，在發(fā)酵后期，其還原糖含量平穩(wěn)下降，變化不大。從酵母菌發(fā)酵性能的差異性來分析，添加JH和JH3酵母菌的發(fā)酵液在發(fā)酵中期消耗糖量最大，JH和JH3的還原糖含量分別從120.87 g/L、115.29 g/L變成47.56 g/L、42.22 g/L，都比不添加酵母菌的發(fā)酵液減慢得快；但添加JH1、JH2和JH4酵母菌的發(fā)酵液在發(fā)酵中期消耗糖量都比未添加酵母菌的發(fā)酵液?。挥绕涫翘砑覬H1酵母菌的發(fā)酵液還原糖降低的含量最小。這是可能添加的酵母菌有可能會(huì)抑制其他酵母菌的生長(zhǎng)，使糖的利用率降低。在發(fā)酵后期，所有發(fā)酵液中的還原糖含量降低速率基本一致即趨于平緩。這是可能因?yàn)樵诎l(fā)酵后期酒精含量增加，會(huì)抑制酵母菌的生長(zhǎng)；或是在發(fā)酵后期酵母菌數(shù)量減少也會(huì)使糖的利用率降低。

3 結(jié)論

本研究從四川藏區(qū)高原威代爾冰葡萄果實(shí)中分離純化并鑒定出的菌株。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，該菌株與GenBank中相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)菌株的18S rDNA D1/D2區(qū)序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹顯示，這五種菌株分別與Hanseniaspora uvarum、Metschnikowia pulcherrima、Saccharomyces cerevisiae、Yarrowia lipolytica和Wickerhamomyces anomalus處在同一分枝。根據(jù)酵母菌株同一個(gè)種的不同菌株18S rDNA D1/D2區(qū)核酸替換率不超過1%，因此將該五種菌株分別鑒定為葡萄汁有孢漢遜酵母、美極梅奇酵母、釀酒酵母、解脂耶羅維亞酵母和異常威克漢姆酵母。

通過對(duì)這五種酵母菌發(fā)酵性能實(shí)驗(yàn)分析，該5種酵母菌均有一定的發(fā)酵能力，發(fā)酵液中總酚含量、還原糖含量、果糖含量以及總酸含量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而改變，并且添加葡萄汁有孢漢遜酵母的發(fā)酵液消耗的果糖多，消耗果糖最少的是添加解脂耶羅維亞酵母的發(fā)酵液；發(fā)酵液中總酸含量變化最大的是添加美極梅奇酵母，變化最小的是添加解脂耶羅維亞酵母；發(fā)酵液中添加解脂耶羅維亞酵母消耗的還原糖最多；添加JH1酵母的發(fā)酵液中的總酚含量下降最慢，不添加酵母的發(fā)酵液總酚含量下降最快?？傮w來說，菌株JH2發(fā)酵性能最好。

此研究對(duì)篩選川西冰葡萄酒產(chǎn)區(qū)特色酵母菌，并構(gòu)建出冰葡萄酒發(fā)酵微生物資源庫(kù)具有一定意義，并且為川西藏區(qū)冰葡萄酒標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)提供技術(shù)支持。

[1]鄭元元，姚志偉，張亞黎.新疆冰葡萄酒產(chǎn)業(yè)發(fā)展對(duì)策研究[J].中國(guó)釀造，2013，32（2）：164-166.

[2]程雷.葡萄自然發(fā)酵過程中酵母的分離鑒定及優(yōu)良葡萄酒酵母篩選[D].哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué)碩士論文，2010.

[3]王國(guó)平.寧夏御馬葡萄酒廠野生酵母菌株的分離鑒定及分子鑒定[J].中國(guó)釀造，2009，28（8）：38-41.

[4]崔艷.菌種選育技術(shù)在葡萄酒釀造中的運(yùn)用與發(fā)展[J].食品研究與開發(fā)，2011，32（9）：171-175.

[5]張麗珠，邢亞閣，許青蓮，等.川藏高原威代爾冰葡萄中酵母菌的分離、篩選及其耐受性研究[J].中國(guó)釀造，2013，32（10）：94-97.

[6]許青蓮，邢亞閣，車振明，等.川西高原冰酒發(fā)酵中Pichia anomala的鑒定與耐受性研究[J].中國(guó)釀造，2013，32（8）：39-41.

[7]KURTZMAN C P,ROBNETT C J.Identification and phylogeny of ascomycetous yeasts from analysis of nuclear large subunit(26S)ribosomal DNA partial sequences[J].Anton Leeuw,1998,73(4):331-371.

[8]高暢，程大海，高欣，等.藍(lán)莓果渣提取物總酚含量及抗氧化活性研究[J].植物研究，2010，30（2）：253-256.

[9]張曉卿，謝濤，李媚，等.采用分光光度法測(cè)定發(fā)酵液中果糖的含量[J].光譜實(shí)驗(yàn)室，2004，21（5）：12-13.

[10]劉宏媛，李光輝，羅惠波，等.大曲中酵母菌的分離及Biolog微生物系統(tǒng)分析鑒定[J].食品與發(fā)酵科技，2011（1）：7-9，28.

[11]ABLIZ P,FUKUSHIMA K,TAKIZAWA K,et al.Identification of pathogenic dematiaceous fungi and related taxa based on large subunit ribosomal DNA D1/D2 domain sequence analysis[J].FEMS Immunol M ed M ic,2004,40(1):41-49.

[12]KURTZMA C P,FELL J W.The yeasts,a taxonomic study(4th edition) [M].Amsterdam:Elsevier Science Ltd.,1998.

[13]蔣麗，刑亞閣，車振明，等.川藏高原冰葡萄酒中五種酵母菌的鑒定及耐受性研究[J].中國(guó)釀造，2014，33（10）：36-39.

[14]YANG S H,WANG P H.Three species of yeasts news to Taiwan[J].Taiwania,2003,48(2):99-105.

[15]張曉松，孫艷梅，胡振生.都柿果酒在釀制過程中總酚和花色苷含量和抗氧化活性[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，14（3）：120-124.

[16]潘雪燕.廣西山葡萄酒生產(chǎn)過程中有機(jī)酸的變化及其控制[D].南寧：廣西大學(xué)碩士學(xué)位論文，2011.

[17]池成，胡文忠，張平，等.冰葡萄酒發(fā)酵過程中成分變化的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（2）：807-809.

《中國(guó)釀造》雜志征稿啟事

《中國(guó)釀造》創(chuàng)刊于1982年，是由中國(guó)商業(yè)聯(lián)合會(huì)主管，中國(guó)調(diào)味品協(xié)會(huì)及北京食品科學(xué)研究院主辦的綜合性科技期刊。并歷次被評(píng)為全國(guó)中文核心期刊、中國(guó)科技核心期刊、《中國(guó)知網(wǎng)》重點(diǎn)收錄期刊、《萬方數(shù)據(jù)庫(kù)》全文收錄期刊、《中文科技期刊數(shù)據(jù)庫(kù)》來源期刊、中國(guó)學(xué)術(shù)期刊網(wǎng)絡(luò)出版總庫(kù)收錄期刊、美國(guó)《烏利希期刊指南》（UPD）收錄期刊、英國(guó)《食品科學(xué)文摘》（FSTA）收錄期刊、英國(guó)《國(guó)際農(nóng)業(yè)與生物科學(xué)研究中心》（CABI）收錄期刊、美國(guó)《化學(xué)文摘》（CA）收錄期刊，也是學(xué)位與研究生教育的中文重要期刊。

本刊主要面向全國(guó)各大高等院校、科研院所、各級(jí)黨政機(jī)關(guān)、相關(guān)企事業(yè)單位的廣大專家學(xué)者、工程技術(shù)人員、本科生、碩士博士研究生、管理人員等。

《中國(guó)釀造》主要欄目有：研究報(bào)告、專論綜述、創(chuàng)新與借鑒、經(jīng)驗(yàn)交流、分析與檢測(cè)、產(chǎn)品開發(fā)、釀造文化、海外文摘等。

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（1）新工藝、新技術(shù)、新設(shè)備在釀造行業(yè)的應(yīng)用；（2）調(diào)味品的研發(fā)創(chuàng)新與推廣應(yīng)用；（3）調(diào)味品產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)管理及產(chǎn)品質(zhì)量安全評(píng)價(jià)；（4）食品添加劑在釀造行業(yè)的應(yīng)用；（5）現(xiàn)代高新檢測(cè)技術(shù)在釀造行業(yè)的應(yīng)用；（6）釀酒產(chǎn)品開發(fā)、生產(chǎn)管理及產(chǎn)品質(zhì)量安全的控制；（7）發(fā)酵法制備酒精、氨基酸、高級(jí)醇及有機(jī)酸等工藝研究；（8）微生物發(fā)酵工藝及培養(yǎng)基發(fā)酵條件優(yōu)化；（9）發(fā)酵工程菌種的篩育與人工誘變、雜交選育及基因工程改造研究；（10）生物質(zhì)能源的開發(fā)利用及規(guī)模化制備；（11）傳統(tǒng)發(fā)酵食品生產(chǎn)工藝改進(jìn)、微生物菌種改良、發(fā)酵機(jī)理及規(guī)?；a(chǎn)研究；（12）食品及發(fā)酵工業(yè)廢水、廢渣處理及綜合利用；（13）益生菌及功能型發(fā)酵乳制品研究與開發(fā)；（14）行業(yè)實(shí)用技術(shù)、政策、法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)及行業(yè)動(dòng)態(tài)和最新舉措等。

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Phylogenetic analysis and fermentation properties of five yeast strains

JIANG Li1,DONG Dan1,X ING Yage1,CHE Zhenming1*,LUO Jianfeng2
(1.Key Laboratory of Food Biotechnology,College of Bioengineering,Xihua University,Chengdu 610039,China; 2.Lixian Tasijiuzhuang Co.,Ltd.,Ngawa Prefecture 623100,China)

Five strains of yeast were isolated from the Sichuan Tibetan Plateau Vidal Ice grape slag mud and identified using 18S rDNAD1/D2,after sequences analysis and phylogenetic tree construction and analysis.The yeasts were cultured by WL medium and observed by ordinary optical microscope,and further fermenting property of five strains of yeast were determined.Results showed that JH,JH1,JH2,JH3 and JH4 were identified as Hanseniaspora uvarum,Metschnikowia pulcherrima,Saccharomyces cerevisia,Yarrowia lipolytica,Wickerhamomyces anomalus,respectively.The five kinds of yeasts had certain fermenting property.The changes of total phenol,reducing sugar,fructose and total acidin fermentation broth were different.In conclusion,JH2 had the optimal fermenting property.

yeasts;isolation and identification;fermenting property;phylogenetic analysis

TS261.1

A

0254-5071（2015）03-0048-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.03.011

2015-01-19

省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2011SZ0284，2012SZ0117，13KCBZ0066）；2012年西華大學(xué)食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放研究基金資助項(xiàng)目（SZjj2012-005）；2013年西華大學(xué)研究生創(chuàng)新基金項(xiàng)目（ycjj201346）

蔣麗（1989-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。

*通訊作者：車振明（1960-），男，教授，本科，研究方向?yàn)槭称钒l(fā)酵技術(shù)。