彭金龍，胡 健，張鳳杰，肖 蒙，葉小龍，倪 斌

（1.上海金楓酒業(yè)股份有限公司，上海201501；2.上海石庫(kù)門釀酒有限公司，上海201501；3.中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京100027）

黃酒中生物胺的檢測(cè)方法改進(jìn)

彭金龍1，2，胡 健1，2，張鳳杰3，肖 蒙1，2，葉小龍1，2，倪 斌1，2

（1.上海金楓酒業(yè)股份有限公司，上海201501；2.上海石庫(kù)門釀酒有限公司，上海201501；3.中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京100027）

本研究在國(guó)標(biāo)GB/T 5009.208—2008基礎(chǔ)上簡(jiǎn)化了樣品前處理?xiàng)l件和步驟，改進(jìn)了檢測(cè)黃酒中生物胺的方法。經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，8種生物胺得到了較好分離，標(biāo)準(zhǔn)品線性關(guān)系良好，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)值均＜2%，回收率均在92.0%～106.0%，方法具有良好的重復(fù)性和回收率。與國(guó)標(biāo)生物胺的檢測(cè)方法相比，本檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單、快速，并且檢測(cè)結(jié)果可靠。

黃酒；生物胺；高效液相色譜法；檢測(cè)

生物胺（biogenic amines，BA）是一類含氮的低分子質(zhì)量堿性有機(jī)化合物的總稱。生物胺存在于多種食品尤其是發(fā)酵食品中，如葡萄酒、啤酒、發(fā)酵香腸和黃酒等[1-2]。它是動(dòng)物、植物和多數(shù)微生物體內(nèi)活性細(xì)胞中必不可少的組成部分，但是，高濃度的生物胺不僅會(huì)嚴(yán)重影響食品的風(fēng)味甚至改變其成分，還會(huì)對(duì)人體有著嚴(yán)重的毒害作用，如引起諸如頭痛、惡心、人神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)損傷等，嚴(yán)重的可危及生命[3-4]?，F(xiàn)有研究表明，黃酒在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生生物胺，每個(gè)批次每個(gè)品種的黃酒中生物胺種類和含量有很大不同[5-6]，鑒于生物胺具有毒性，因此對(duì)于黃酒生產(chǎn)企業(yè)追蹤檢測(cè)每批次黃酒中生物胺的含量必不可少。

根據(jù)現(xiàn)有報(bào)道，生物胺含量的測(cè)定方法有很多，如高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）、離子色譜法（ion chromatography，IC）、氣相色譜法（gas chromatography，GC）、毛細(xì)管電泳法（capillary electrophoresis，CE）、薄層色譜法（thin layer chromatography，TLC）、生物傳感器法（biosensor method）、酶聯(lián)免疫法（enzyme linked immunosorbent assays，SLISA）等[7-9]。目前，食品中生物胺含量的測(cè)定國(guó)標(biāo)GB/T 5009.208—2008《食品中生物胺含量的測(cè)定》中采用HPLC法[10]。用國(guó)標(biāo)法測(cè)定黃酒中生物胺含量，由于國(guó)標(biāo)法是針對(duì)所有食品中生物胺測(cè)定而制定的，實(shí)際操作時(shí)發(fā)現(xiàn)，國(guó)標(biāo)法制備樣品操作復(fù)雜、步驟繁瑣、非常耗時(shí)，測(cè)定一個(gè)樣品需要一個(gè)工作日時(shí)間，用此方法對(duì)于一個(gè)每日都生產(chǎn)黃酒的企業(yè)追蹤檢測(cè)酒中生物胺含量非常不便。專門針對(duì)黃酒中生物胺的檢測(cè)方法，雖然現(xiàn)已有幾篇相關(guān)研究報(bào)道，但是都存在可以改進(jìn)的地方。謝銘[11]采用HPLC法檢測(cè)黃酒中生物胺含量，但是其衍生后萃取、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)等步驟費(fèi)時(shí)復(fù)雜，并且僅對(duì)4種生物胺進(jìn)行分析。陸永梅等[12]僅對(duì)5種生物胺進(jìn)行分析檢測(cè)。玉瀾等[13]所述方法離子液體萃取和樣品處理方法比較費(fèi)時(shí)。彭祺等采用液質(zhì)聯(lián)用法檢測(cè)生物胺，雖然不需要衍生步驟，但是樣品前處理更加費(fèi)時(shí)。華永有等[14-15]采用熒光法檢測(cè)生物胺，但是樣品處理與現(xiàn)行報(bào)道的國(guó)標(biāo)法相似。

鑒于此，本研究在《食品中生物胺含量的測(cè)定》國(guó)標(biāo)法基礎(chǔ)上修改部分處理方法，建立一種黃酒中8種常見(jiàn)生物胺的檢測(cè)方法。主要修改如下：首先將國(guó)標(biāo)法中樣品前處理中的凈化和萃取步驟刪除，改為將黃酒稀釋的方式，簡(jiǎn)化了前處理步驟；其次，待樣品衍生步驟完成之后，本研究刪除了國(guó)標(biāo)方法中氮?dú)獯蹈珊洼腿〉牟襟E（不影響后續(xù)色譜分析），節(jié)省了部分操作時(shí)間；同時(shí)，對(duì)衍生時(shí)試劑添加量進(jìn)行了調(diào)整，使反應(yīng)體系在最佳pH和濃度下進(jìn)行，并對(duì)后續(xù)色譜分離條件進(jìn)行了修改，旨在前人研究和國(guó)標(biāo)法的基礎(chǔ)上簡(jiǎn)化前處理?xiàng)l件和步驟，建立一種簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確、安全的黃酒中主要的8種生物胺的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃酒：上海金楓酒業(yè)股份有限公司；純凈水：杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司。

色胺（try）、β-苯乙胺（phe）、腐胺（put）、尸胺（cad）、組胺（his）、酪胺（tyr）、亞精胺（spd）、精胺（spm）標(biāo)樣（色譜純）、丹磺酰氯（色譜純）、1,7二氨基庚烷（色譜純）、乙腈（色譜純）：美國(guó)Sigma公司。無(wú)水碳酸鈉、氫氧化鈉、碳酸氫鈉、鹽酸、谷氨酸鈉（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters 2695高效液相色譜儀（配紫外檢測(cè)器）：美國(guó)Waters公司；XW-80A旋渦混合器：上海青浦滬西儀器廠；DKZ系列電熱恒溫：上海一恒科技有限公司；BS210S分析天平：北京賽多利斯天平有限公司；0.45 μm針頭微孔濾膜過(guò)濾器：上海安譜科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：安捷倫C18柱（5 μm，150 mm×4.6 mm）；柱溫：30℃；流速：1.0 m L/min；進(jìn)樣10.0 μL；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm；流動(dòng)相A乙腈溶液，B超純水；采用梯度洗脫，洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 HPLC梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program of HPLC

1.3.2 樣品的衍生

1 m L預(yù)處理好的樣品，加入50 μL 1,7-二氨基庚烷（0.1 g/L，0.1 mol/L HCl溶液配制）內(nèi)標(biāo)工作液，然后加入0.5 m L的飽和NaHCO3溶液進(jìn)行緩沖，再加入1 m L的衍生試劑丹磺酰氯溶液（10 g/L，丙酮溶液配制），混勻后，避光置于60℃的水浴中保溫30 m in，中間取出振蕩一次。衍生完后，加入100 μL谷氨酸鈉（50 g/L，飽和碳酸氫鈉溶液配制）溶液中斷反應(yīng)，并置于60℃水浴鍋中繼續(xù)保溫15 min去除多余的丹磺酰氯。最后用乙腈調(diào)整至5 m L，再將其用0.45 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾，待測(cè)。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

準(zhǔn)確稱取各種生物胺標(biāo)準(zhǔn)品，用0.1 mol/L HCl溶液配制成質(zhì)量濃度為1 000 mg/L（以生物胺單體計(jì)）的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，4℃冰箱保存。使用前，分別吸取各生物胺單組分標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1 m L，置于10 m L容量瓶中，用0.1 mol/L HCl溶液定容，配制成100mg/L的8種生物胺混合標(biāo)準(zhǔn)品工作液，4℃保存待用。

1.3.4 樣品預(yù)處理

將黃酒酒樣5 m L（黃酒發(fā)酵醪液需過(guò)濾）與5 m L 0.1 mol/L HCl混合均勻，取1 m L混合好的樣品液按照以上方法衍生待測(cè)（稀釋倍數(shù)為2倍）。

1.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作和檢出限

100 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)品工作液，用0.1 mol/L HCl分別稀釋至0.1 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L、5.0 mg/L、10.0 mg/L、20.0 mg/L、40.0 mg/L，然后按照上述方法衍生，待測(cè)。按照各標(biāo)準(zhǔn)品峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值對(duì)相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程及相關(guān)系數(shù)。

對(duì)質(zhì)量濃度為0.1 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)品衍生物用乙腈適當(dāng)稀釋，以信噪比（S/N）＞3作為檢出限的判斷標(biāo)準(zhǔn)。1.3.6精密度和加標(biāo)回收率試驗(yàn)

取某一種黃酒樣品，先用本研究所述的方法測(cè)定其生物胺的含量，再取5 m L此黃酒樣品置于10 m L容量瓶中，再加入8種生物胺標(biāo)準(zhǔn)混合溶液0.05 m L（單體質(zhì)量濃度為100 mg/L），相當(dāng)于添加5 mg/L的含量，用0.1 mol/L HCl溶液定容至刻度，進(jìn)行5次重復(fù)回收試驗(yàn)，扣除樣品中空白試驗(yàn)生物胺的含量，求得其添加回收率，并計(jì)算添加相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），即重復(fù)性。

1.3.7 樣品生物胺的檢測(cè)

將黃酒樣品按照國(guó)標(biāo)GB/T 5009.208—2008《食品中生物胺含量的測(cè)定》中所述方法測(cè)定其生物胺含量，平行測(cè)定3次，并與本研究所述方法的測(cè)定結(jié)果相對(duì)比。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS Statistics 17.0和Excel 2010等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，檢測(cè)結(jié)果采取均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式。本文檢測(cè)結(jié)果表中，同一列數(shù)據(jù)上不同字母上標(biāo)標(biāo)記表示在P＜0.05水平上進(jìn)行方差檢驗(yàn)，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程和檢出限

按1.3.3中所述方法配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，再按照1.3.2所述方法衍生，通過(guò)HPLC分析，生物胺分離高效液相色譜如圖1所示，以生物胺質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積為（Y）為縱坐標(biāo)，求得標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程和相關(guān)系數(shù)如表2所示。

圖1 生物胺標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of biogenic amine standards

表2 生物胺標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍和檢出限Table 2 Regression equations,correlation coefficients,linearity range and detection limits o f biogenic amine

由圖1可知，8種生物胺得到較好分離，并且其與內(nèi)標(biāo)峰無(wú)重疊。由表2可知，8種生物胺的峰面積與其相應(yīng)質(zhì)量濃度呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均＞0.998 0，其中色胺和苯乙胺的相關(guān)系數(shù)R達(dá)到0.999 9，線性范圍為0.1～40.0 mg/L，結(jié)果表明，可以滿足樣品測(cè)定的要求。

以信噪比（S/N）＞3作為檢出限的判斷標(biāo)準(zhǔn)，尸胺的檢出限為0.01mg/L，色胺、亞精胺、精胺的檢出限為0.03mg/L，苯乙胺的檢出限為0.04 mg/L，組胺的檢出限為0.05 mg/L，腐胺和酪胺的檢出限為0.06 mg/L。結(jié)果表明，該方法的靈敏度高，可以滿足測(cè)定樣品的要求。

2.2 精密度和加標(biāo)回收率試驗(yàn)

8種生物胺的添加回收率的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，8種生物胺的回收率分別為色胺96.0%、苯乙胺98.0%、腐胺102.0%、尸胺104.0%、組胺98.0%、酪胺100.0%、亞精胺92.0%、精胺106.0%，可見(jiàn)該方法的準(zhǔn)確度高。對(duì)添加標(biāo)準(zhǔn)樣品后的黃酒樣品連續(xù)進(jìn)樣5次的試驗(yàn)中，色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺、精胺測(cè)定結(jié)果的RSD值為0.14%～1.64%，8種生物胺的RSD值均＜2%，故測(cè)量方法的重復(fù)性好，精密度符合樣品檢測(cè)的要求。

表3 8種生物胺的精密度及回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of precision and recovery rate tests for eight kinds of biogenic amine

2.3 樣品的檢測(cè)試驗(yàn)

對(duì)某一黃酒樣品，將國(guó)標(biāo)法測(cè)定的生物胺結(jié)果與本研究所述方法測(cè)定生物胺的結(jié)果相比較，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 國(guó)標(biāo)法與本方法測(cè)定黃酒樣品中生物胺的含量Table 4 Determination of biogenic amine content in Chinese rice wine by National Standard method and the improved method mg/L

由表4可知，通過(guò)兩種方法所測(cè)得的此黃酒樣品只含有6種生物胺，分別是腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺、精胺。對(duì)比兩種方法檢測(cè)的生物胺含量，通過(guò)ANOVA檢驗(yàn)可知，兩種方法測(cè)定樣品中的生物胺含量，所測(cè)結(jié)果差異不顯著，并且所有結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)差均在0.5以內(nèi)，說(shuō)明此色譜工作性能穩(wěn)定。

3 結(jié)論

采用國(guó)標(biāo)法GB/T 5009.208—2008《食品中生物胺含量的測(cè)定》檢測(cè)黃酒中生物胺，黃酒樣品需要進(jìn)行凈化、萃取，并且衍生完后還需去雜質(zhì)等步驟，這需要耗費(fèi)大量時(shí)間以及需要用到有毒試劑，這不利于黃酒企業(yè)生產(chǎn)實(shí)時(shí)追蹤檢測(cè)產(chǎn)品中的生物胺。本研究在前人研究基礎(chǔ)上，以丹磺酰氯為衍生試劑，1,7-二氨基庚烷為內(nèi)標(biāo)，采用HPLC法，通過(guò)稀釋簡(jiǎn)化樣品前處理?xiàng)l件和步驟，改進(jìn)了檢測(cè)黃酒中生物胺的方法。

通過(guò)本研究所述方法分析主要的8種生物胺，結(jié)果表明，8種生物胺可得到較好分離，各生物胺標(biāo)準(zhǔn)品的衍生物線性關(guān)系良好（R＞0.998 0），各生物胺回收率在92.0%～106.0%，本方法具有良好的準(zhǔn)確度、重復(fù)性和精密度。對(duì)于檢測(cè)黃酒樣品中的生物胺，與國(guó)標(biāo)GB/T 5009.208—2008《食品中生物胺含量的測(cè)定》中所述的生物胺檢測(cè)方法相比，本檢測(cè)方法操作更簡(jiǎn)單、快速，并且檢測(cè)結(jié)果可靠。

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Improvement of biogenic amine detection method in Chinese rice wine

PENG Jinlong1,2,HU Jian1,2,ZHANG Fengjie3,XIAO Meng1,2,YE Xiaolong1,2,NI Bin1,2
(1.Shanghai Jinfeng Wine Co.,Ltd.,Shanghai 201501,China;2.Shanghai Shikumen Wine Co.,Ltd.,Shanghai 201501,China; 3.China National Research Institute of Food and Fermentation Industries,Beijing 100027,China)

In this study,the detection method of biogenic amines in Chinese rice wine was improved by simplifying the pre-processing conditions and steps of sample on the basis of the National Standard 5009.208—2008.By the verification of methodology,eight biogenic amines got a better separation,the standard showed good linear relationship,the relative standard deviation was less than 2%,the recovery was 92.0%-106.0%.This improved method had good linearity,repeatability and recovery rate.Compared with the detection method of biogenic amines in the National Standard,this detection method was simpler,faster,and the detection results were more accurate.

Chinese rice wine;biogenic amine;HPLC;detection

O657.7

A

0254-5071（2015）03-0141-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.03.034

2015-02-03

國(guó)家科技支撐項(xiàng)目（2012BAK17B11）

彭金龍（1987-），男，助理工程師，碩士，研究方向?yàn)槭称窓z測(cè)與產(chǎn)品開(kāi)發(fā)。