王潤(rùn)東，邵 偉

（1.湖北智慧果林業(yè)科技有限公司技術(shù)中心，湖北興山443700；2.三峽大學(xué)生物與制藥學(xué)院，湖北宜昌443001）

紅茶菌固定化發(fā)酵葛根茶飲料工藝研究

王潤(rùn)東1，邵 偉2*

（1.湖北智慧果林業(yè)科技有限公司技術(shù)中心，湖北興山443700；2.三峽大學(xué)生物與制藥學(xué)院，湖北宜昌443001）

以葛根纖維提取物為原料進(jìn)行紅茶菌發(fā)酵，并以發(fā)酵茶中的總酸含量、總糖利用率和對(duì)發(fā)酵液的感官評(píng)價(jià)分作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，探討了蔗糖添加量、接種量、揺瓶轉(zhuǎn)速和發(fā)酵時(shí)間等因素對(duì)固定化細(xì)胞技術(shù)發(fā)酵葛根茶飲料的影響，并通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化了發(fā)酵葛根茶飲料的最佳工藝條件。結(jié)果表明，蔗糖添加量為70 g/L，接種量為8%，揺瓶轉(zhuǎn)速為180 r/min，發(fā)酵時(shí)間為7 d，所制得的發(fā)酵葛根茶飲料色澤均勻，酸甜可口。

葛根；紅茶菌；固定化；發(fā)酵；飲料

葛根（Pueraria lobota）為藤本植物葛的塊根，莖被稀疏的棕色長(zhǎng)硬毛，是我國(guó)南方一些省區(qū)的一種藥食兩用植物，其味甘涼可口，常作煲湯之用。其主要成分是淀粉，此外還含有約12%的黃酮類化合物，包括大豆（黃豆）甙、大豆甙元、葛根素等10余種；并含有胡蘿卜甙、氨基酸、香豆素類等[1-5]。葛根在提取完淀粉后，其葛根纖維渣多半丟棄，造成環(huán)境的污染，而其中也含有大量的有益成分，若能加以利用則有益于葛根產(chǎn)業(yè)的良性發(fā)展。

近年來(lái)，紅茶菌飲料在世界各國(guó)都頗受歡迎，它主要由醋酸菌、乳酸菌等多種微生物共同對(duì)糖茶水進(jìn)行發(fā)酵而成[6-10]。目前，紅茶菌大都是采用靜置培養(yǎng)的方式，這種方式易受雜菌污染，培養(yǎng)條件要求較高，菌種不宜保藏等。固定化技術(shù)是將酶或細(xì)胞固定于一定范圍內(nèi)，使它們既保持原有的活性，又可以在連續(xù)反應(yīng)后回收并實(shí)現(xiàn)重復(fù)利用的一項(xiàng)技術(shù)[11]。同游離細(xì)胞相比，細(xì)胞經(jīng)固定化后在單位體積內(nèi)細(xì)胞濃度大幅度增加，提高發(fā)酵速率；其次，固定化細(xì)胞發(fā)酵性能穩(wěn)定；再者，細(xì)胞固定后可以重復(fù)利用，對(duì)于生產(chǎn)胞外產(chǎn)品的發(fā)酵簡(jiǎn)化了細(xì)胞分離的步驟，節(jié)約了發(fā)酵過(guò)程的生產(chǎn)成本[12]。

本研究將葛根纖維渣中的有益成分進(jìn)行抽提，以固定化細(xì)胞技術(shù)發(fā)酵葛根茶飲料，不僅可解決游離菌混合靜置發(fā)酵生產(chǎn)紅茶菌時(shí)存在的弊端，而且這種發(fā)酵方式有助于控制產(chǎn)品的質(zhì)量，對(duì)葛根發(fā)酵茶飲料的開發(fā)具有一定的指導(dǎo)意義，從而為發(fā)酵葛根茶飲料的工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葛根纖維渣：湖北智慧果林業(yè)科技發(fā)展有限公司；紅茶菌：由三峽大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室提供并保藏；白砂糖：市售。

海藻酸鈉、明膠均為化學(xué)純，其他試劑均為分析純：國(guó)藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司。

紅茶菌活化培養(yǎng)基的制備：蔗糖10 g，酵母膏10 g，碳酸鈣15 g，瓊脂粉15 g，蒸餾水1 000 m L，pH 6.8，121℃滅菌20 min，培養(yǎng)基冷卻至50℃左右，加入5%的無(wú)水乙醇。

發(fā)酵葛根茶飲料培養(yǎng)基的制備：將30g葛根纖維渣加入到1000m L沸水中，浸提60min，再將一定量的蔗糖（70g/L）加入到茶液中，混勻溶解，200目濾網(wǎng)過(guò)濾，得濾液，加水補(bǔ)足1 000m L，分裝至三角瓶中，裝液量為120 m L/250 m L，巴氏消毒（85℃、10 min），冷至室溫備用。

1.2 儀器與設(shè)備

ALC-210.4型電子天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；BXM-30R全自動(dòng)立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊醫(yī)療器械有限公司；L550低速離心機(jī)：長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；ZD85-1振蕩培養(yǎng)器：蘇州國(guó)華科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵葛根茶飲料加工工藝流程

1.3.2 操作要點(diǎn)

（1）固定化紅茶菌細(xì)胞的制備[13]

將5.5%的海藻酸鈉和1.5%的明膠充分溶解，滅菌后待其溫度降至室溫時(shí)，將培養(yǎng)好的紅茶菌懸液與等體積的固定化載體溶液充分混勻，混勻后的紅茶菌混合液用注射器滴入0.6%的氯化鈣溶液中，得到固定化紅茶菌細(xì)胞顆粒，固定1 h后用無(wú)菌水沖洗，重新加入0.6%的氯化鈣溶液，4℃平衡過(guò)夜，備用。

（2）發(fā)酵葛根茶飲料的制備

按8%接種量向裝液量為120 m L/250 m L的發(fā)酵葛根茶飲料培養(yǎng)基中接入固定化紅茶菌細(xì)胞顆粒，30℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)7 d，發(fā)酵結(jié)束后，用200目濾網(wǎng)過(guò)濾發(fā)酵液，濾液裝瓶后進(jìn)行巴氏消毒（85℃、10 min），冷卻后即為成品。

1.3.3 發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

以總酸含量、總糖利用率及感官評(píng)分為考察指標(biāo)，分別考察蔗糖添加量（50 g/L、60 g/L、70 g/L、80 g/L、90 g/L、100 g/L），接種量（2.5%、5.0%、7.5%、10.0%、12.5%、15.0%），搖瓶轉(zhuǎn)速（100 r/m in、120 r/min、140 r/min、160 r/min、180 r/m in、200 r/m in、220 r/m in），發(fā)酵時(shí)間（1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、7 h、8 h）等因素對(duì)發(fā)酵葛根茶飲料品質(zhì)的影響。

1.3.4 固定化發(fā)酵工藝條件優(yōu)化正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行正交試驗(yàn)，選擇蔗糖添加量（A）、接種量（B）、揺瓶轉(zhuǎn)速（C）和發(fā)酵時(shí)間（D）等4個(gè)因素，每個(gè)因素選取3個(gè)水平，以感官評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，按L9（34）正交表設(shè)計(jì)試驗(yàn)，因素與水平見(jiàn)表1。

表1 發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation technology optimization

1.3.5 測(cè)定方法

在葛根茶飲料發(fā)酵過(guò)程中，每隔一天分別測(cè)定發(fā)酵液的總酸含量、總糖利用率，并對(duì)成品進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，以此分析各因素對(duì)葛根茶發(fā)酵飲料品質(zhì)的影響。

（1）總酸的測(cè)定

采用國(guó)標(biāo)GB/T 12456—2008《食品中總酸的測(cè)定》中酸堿滴定法。

（2）總糖利用率的測(cè)定

采用3,5-二硝基水楊酸比色法測(cè)定蔗糖含量[14]。總糖利用率計(jì)算公式如下：

（3）發(fā)酵葛根茶飲料感官評(píng)價(jià)[15]

組織10人為感官評(píng)價(jià)小組，根據(jù)表2的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)不同產(chǎn)品的色澤、風(fēng)味進(jìn)行鑒定并打分，滿分為4分，以感官評(píng)分平均值作為最終的感官評(píng)價(jià)結(jié)果。

表2 發(fā)酵葛根茶飲料感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standards of fermentation kudzu root beverage

2 結(jié)果與分析

2.1 蔗糖添加量對(duì)發(fā)酵葛根茶飲料的影響

由圖1可知，隨著蔗糖添加量的增加，發(fā)酵液的總糖利用率呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，當(dāng)蔗糖添加量為80 g/L時(shí)，發(fā)酵液的總糖利用率最大，而隨著蔗糖添加量的增加，發(fā)酵液中的總酸含量總體呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，由此可見(jiàn)蔗糖添加量越大，對(duì)紅茶菌的抑制作用越強(qiáng)，總酸含量越低。因此，初步確定發(fā)酵葛根茶飲料培養(yǎng)基中蔗糖添加量為60～90 g/L。

圖1 蔗糖添加量對(duì)總酸含量和總糖利用率的影響Fig.1 Effect of sucrose addition on total acid content and total sugar utilization

表3 蔗糖添加量對(duì)感官評(píng)分的影響Table 3 Effect of sucrose addition on sensory evaluation score

由表3可知，隨著蔗糖添加量的增加，感官評(píng)分呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，這是因?yàn)檎崽翘砑恿窟^(guò)低或過(guò)高，會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵液偏酸或偏甜，而當(dāng)蔗糖添加量為70～80 g/L時(shí)，發(fā)酵液酸甜可口，感官評(píng)價(jià)分值最高。

2.2 接種量對(duì)發(fā)酵葛根茶飲料的影響

圖2 接種量對(duì)總酸含量和總糖利用率的影響Fig.2 Effect of inoculum on total acid content and total sugar utilization

由圖2可知，隨著接種量的增加，發(fā)酵液的總酸含量和總糖利用率均不斷增加，但接種量在10%～15%時(shí)發(fā)酵液的總酸含量差別不大，這是由于接種量過(guò)大時(shí)，醋酸菌會(huì)大量消耗發(fā)酵液中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)用于其自身的生長(zhǎng)、繁殖，并代謝大量的廢物。同時(shí)，接種量＞10%時(shí)，發(fā)酵液中總酸含量過(guò)大，影響發(fā)酵液品質(zhì)，而接種量為2.5%時(shí)，發(fā)酵不徹底，發(fā)酵液的總酸含量?jī)H為5.43 g/L，這說(shuō)明接種量過(guò)高或過(guò)低，都不利于葛根茶飲料的發(fā)酵。因此，初步確定接種量為6%～10%。

表4 接種量對(duì)感官評(píng)分的影響Table 4 Effect of inoculum on sensory evaluation score

由表4可知，隨著接種量的增加，感官評(píng)價(jià)分值呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，當(dāng)接種量為8%時(shí)，感官評(píng)分最高，這說(shuō)明8%的接種量有益于發(fā)酵葛根茶飲料的品質(zhì)。

圖3 搖瓶轉(zhuǎn)速對(duì)總酸含量和總糖利用率的影響Fig.3 Effect of shaking speed on total acid content and total sugar utilization

2.3 搖瓶轉(zhuǎn)速對(duì)發(fā)酵葛根茶飲料的影響

由圖3可見(jiàn)，隨著搖瓶轉(zhuǎn)速的增加，發(fā)酵液的總酸含量和總糖利用率均不斷提高，這是由于轉(zhuǎn)速的提高有利于氧在發(fā)酵液中的溶解，使發(fā)酵液中的糖分更易于轉(zhuǎn)化為醋酸，但轉(zhuǎn)速達(dá)到200 r/min后，其對(duì)溶氧的貢獻(xiàn)達(dá)到了極限，出現(xiàn)了發(fā)酵液中總酸含量和總糖利用率增加緩慢的現(xiàn)象，這說(shuō)明一定的搖瓶轉(zhuǎn)速對(duì)葛根茶飲料的發(fā)酵是有益的。因此，初步確定搖瓶轉(zhuǎn)速為140～200 r/min。

表5 搖瓶轉(zhuǎn)速對(duì)感官評(píng)分的影響Table 5 Effect of shaking speed on sensory evaluation score

由表5可知，隨著搖瓶轉(zhuǎn)速的增加，感官評(píng)價(jià)分值呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，當(dāng)搖瓶轉(zhuǎn)速為180 r/min時(shí)，感官評(píng)價(jià)分最高，這說(shuō)明采用180 r/min的搖瓶轉(zhuǎn)速制得的發(fā)酵葛根茶飲料品質(zhì)較好。

2.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵葛根茶飲料的影響

由圖4可知，隨著發(fā)酵進(jìn)行，發(fā)酵液中總酸含量和總糖利用率隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)均呈同步增長(zhǎng)趨勢(shì)，這是因?yàn)榘l(fā)酵葛根茶飲料中的紅茶菌生長(zhǎng)繁殖不僅需要消耗糖類物質(zhì)，而且乙酸、乙醇等產(chǎn)物的生成也需要通過(guò)糖類物質(zhì)的轉(zhuǎn)化。到發(fā)酵的第7天時(shí)，發(fā)酵液中總酸含量為14.2g/L。因此，初步確定搖瓶發(fā)酵時(shí)間為6～8 d。

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)總酸含量和總糖利用率的影響Fig.4 Effect of fermentation time on total acid content and total sugar utilization

表6 發(fā)酵時(shí)間對(duì)感官評(píng)分的影響Tab le 6 Effect of fermentation time on sensory evaluation score

由表6可知，發(fā)酵時(shí)間過(guò)短或過(guò)長(zhǎng)時(shí)，感官評(píng)分偏低，發(fā)酵液品質(zhì)不佳，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為7 d時(shí)，感官評(píng)價(jià)分值最高，發(fā)酵液品質(zhì)較好。

2.5 葛根茶飲料發(fā)酵工藝條件優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見(jiàn)表7。

表7 發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 7 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation technology optimization

從表7可知，所選的4個(gè)因素對(duì)葛根茶飲料發(fā)酵的影響依次為發(fā)酵時(shí)間＞接種量＞搖瓶轉(zhuǎn)速＞蔗糖添加量。通過(guò)極差分析可知，最佳工藝條件為A1B2C3D2，即蔗糖添加量為70 g/L，接種量為8%，搖瓶轉(zhuǎn)速180 r/min，發(fā)酵時(shí)間為7 d。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，發(fā)酵葛根茶飲料的感官評(píng)分為3.5分，產(chǎn)品色澤均勻，酸甜可口，具有葛根發(fā)酵茶發(fā)酵液特有的風(fēng)味。

3 結(jié)論

以葛根纖維提取物為原料，利用固定化細(xì)胞技術(shù)實(shí)現(xiàn)了葛根茶飲料的固定化發(fā)酵，結(jié)果表明，通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)得出固定化發(fā)酵葛根茶飲料的最佳工藝條件為蔗糖添加量70 g/L，接種量8%，搖瓶轉(zhuǎn)速180 r/m in，發(fā)酵時(shí)間為7 d。在此條件制備的發(fā)酵葛根茶飲料色澤均勻，酸甜可口。

[1]黃筑艷，趙延濤，李焱.葛根藥理及臨床研究進(jìn)展[J].光明中醫(yī)，2007，22（6）：63-67.

[2]程江華，王灼琛，董萬(wàn)領(lǐng)，等.葛根植物飲料中試生產(chǎn)過(guò)程中總黃酮含量變化研究[J].中國(guó)釀造，2013，32（7）：98-100.

[3]彭游，胡小銘.葛根黃酮提取與保健功能研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技，2011，32（12）：581-589.

[4]王端，周鴻翔，田婭玲，等.微波輔助提取葛根黃酮的工藝研究[J].中國(guó)釀造，2013，33（3）：81-86.

[5]鄭建仙.功能性食品[M].北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，1992.

[6]宋清鵬，胡卓炎，劉丹.紅茶菌飲料的研究進(jìn)展[J].包裝與食品機(jī)械，2013，31（3）：44-48.

[7]李培睿，張曉偉.紅茶菌研究進(jìn)展[J].許昌學(xué)院學(xué)報(bào)，2014，33（5）：79-81.

[8]王冬梅，姬鄂豫，郭書賢.系列紅茶菌飲料抗氧化活性的研究[J].食品工業(yè)，2013，34（8）：34-36.

[9]孫協(xié)軍，宋立.紅茶菌發(fā)酵工藝優(yōu)化及菌液主要成分變化分析[J].食品與發(fā)酵科技，2013，49（5）：87-90.

[10]趙文紅，肖燕清，白衛(wèi)東，等.紅茶菌飲料的研制[J].中國(guó)釀造，2009，28（4）：182-186.

[11]何玥，林慶勝，郝衛(wèi)寧，等.生物固定化技術(shù)及其應(yīng)用研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通報(bào)，2009（S1）：88-93.

[12]KOURKOUTAS Y,BEKATOROU A,BANAT IM,et al.Immobilization technologies and support materials suitable in alcohol beverages production:a review[J].Food Microbiol,2004,21(4):377-397.

[13]任二芳，麻少瑩，黃夏，等.海藻酸鈉-明膠協(xié)同固定化紅茶菌制備工藝的優(yōu)化[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2013，44（7）：1178-1183.

[14]華南理工大學(xué)等.食品分析[M].北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，1994.

[15]任二芳.固定化共生發(fā)酵紅茶菌飲料的研究[D].南寧：廣西大學(xué)碩士論文，2013.

Preparation process of kudzu root beverage by immobilized kombucha fermentation

WANG Rundong1,SHAO Wei2*
(1.Technology Center of Hubei Wisdom Fruit Forestry Science and Technology Co.,Ltd.,Xingshan 443700,China; 2.College of Biological and Pharmaceutical Sciences,China Three Gorges University,Yichang 443001,China)

Using kudzu root fibers extract as raw materials to conduct fermentation,and the total acid content,total sugar utilization and sensory evaluation on fermentation liquor as evaluation index,the effects of sucrose concentration,inoculum,shaken bottle speed and fermentation time on kudzu root beverage by immobilized cell fermentation was discussed.The processing conditions of kudzu root beverage were optimized by orthogonal experiment as follows:sucrose concentration 70 g/L,inoculum 8%,shaken bottle speed 180 r/min,and fermentation time 7 d.The product had uniform color and distinctive flavor.

kudzu root;kombucha;immobilization;fermentation;beverage

TS261.7

A

0254-5071（2015）03-0158-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.03.038

2015-02-09

三峽大學(xué)生物與制藥學(xué)院2013年資助項(xiàng)目（2014HY 005）

王潤(rùn)東（1987-），男，助理工程師，本科，主要從事食品開發(fā)與研究工作。

*通訊作者：邵偉（1966-），男，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，碩士，主要從事微生物學(xué)教學(xué)及研究工作。