韓翠萍，湯慧娟，趙 月，王宗瑩，程建軍，田 波，李 楊，謝鳳英

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱 150030）

響應(yīng)面優(yōu)化傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬風(fēng)味物質(zhì)萃取條件的研究*

韓翠萍，湯慧娟，趙 月，王宗瑩，程建軍，田 波，李 楊，謝鳳英

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱 150030）

本研究采用頂空固相微萃取方法（HS-SPME）優(yōu)化黑龍江傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬風(fēng)味物質(zhì)萃取條件，結(jié)合響應(yīng)面試驗并考慮到實際操作條件，得出了最佳萃取條件為：萃取溫度62℃，萃取時間41 min，解析時間2 min。風(fēng)味物質(zhì)檢測鑒定采用頂空固相微萃取和氣質(zhì)聯(lián)用法，對發(fā)酵一個月的傳統(tǒng)豆醬樣品進(jìn)行鑒定，共鑒定出34種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分，主要包括烷烯烴類、酯類和芳香類，這些物質(zhì)對黑龍江省傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬風(fēng)味貢獻(xiàn)最大，可能為黑龍江省傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬的特征風(fēng)味物質(zhì)。

傳統(tǒng)豆醬；風(fēng)味物質(zhì)；頂空固相微萃取；氣質(zhì)聯(lián)用；響應(yīng)面法

黑龍江傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬是由環(huán)境中的微生物自然發(fā)酵釀造而成，其風(fēng)味物質(zhì)成分非常的復(fù)雜。目前，比較常用的風(fēng)味物質(zhì)提取方法主要為同時蒸餾萃取法（Simultaneous Distillation and Extraction，SDE），頂空法（Head Space）及固相微萃取法（Solid Phase Microextraction， SPME）等[1]。其中固相微萃取方法不使用有機(jī)溶劑，是采樣，萃取，濃縮，進(jìn)樣一體化，并能與氣相色譜聯(lián)和使用，具有非常獨(dú)特的優(yōu)勢。本研究以黑龍江省傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬作為研究對象，采用頂空固相微萃取結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化風(fēng)味物質(zhì)萃取條件，結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS），對風(fēng)味物質(zhì)成分進(jìn)行鑒定。對分析黑龍江傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬中風(fēng)味物質(zhì)的成分和組成具有重大意義[2]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料：豆醬為試驗自制，制作方法參考湯慧娟等的方法[3]。

儀器：DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，河南省予華儀器有限公司；固相微萃?。⊿PME）裝置，美國Supelco公司；7890N/ 5975MSD風(fēng)味檢測氣質(zhì)聯(lián)用儀，美國Agilent公司；GC-2014AFSPL氣相色譜儀，日本島津公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 單因素試驗對萃取風(fēng)味物質(zhì)條件的優(yōu)化 通過對風(fēng)味物質(zhì)萃取時間（10、20、30、40 min）、萃取溫度（40、50、60、70℃）、固相微萃取纖維頭（PDMS、PDMSDVB、PDMSCARBDVB）、解析時間（1、2、3、4 min）進(jìn)行單因素試驗研究，確定萃取最佳試驗參數(shù)。

1.2.2 HS-SPME萃取揮發(fā)性的風(fēng)味化合物 取50 mL醬醅加入到樣品瓶中，放入60℃的水浴中平衡30 min后，將已老化好的萃取針頭小心插入樣品瓶中，再用手柄將里面的石英纖維頭推出來暴露在樣品瓶的頂空氣體中，60℃恒溫萃取40 min，再用手柄將纖維頭推回到針頭內(nèi)，再將萃取針頭拔下，插入到GC-MS進(jìn)樣器中進(jìn)行解析。

1.2.3 GC-MS分離分析 色譜條件：DB-5，0.25mm ×60 m ×0.25 um；進(jìn)樣口溫度為250℃；載氣He，流速1.0 mL/min，不分流；程序升溫：起始溫度80℃，保持5 min，然后再以5℃/min升溫速度直接升溫至250℃，再保持10 min。質(zhì)譜條件：電離方式EI，發(fā)射電流 350 μ A，電子能量 70 eV，離子源溫度200℃，質(zhì)量范圍33～450 amu，接口溫度250℃。

1.2.4 響應(yīng)面試驗對萃取風(fēng)味物質(zhì)條件的優(yōu)化 采用可旋轉(zhuǎn)中心組合設(shè)計方法進(jìn)行試驗設(shè)計，以萃取時間、萃取溫度和解析時間為自變量，以總峰面積為響應(yīng)值，設(shè)計3因素3水平的響應(yīng)面試驗。

1.2.5 揮發(fā)性風(fēng)味化合物的鑒定 實驗數(shù)據(jù)處理由Xcalibur軟件系統(tǒng)完成，未知化合物通過計算機(jī)檢索的同時與NIST譜庫和Wiley譜庫相匹配，當(dāng)且僅當(dāng)正反匹配度都大于800（最大值為1 000）的時候，鑒定結(jié)果才可報道。化合物的相對含量確定是通過面積歸一化法。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 不同萃取時間對風(fēng)味的影響 萃取時間主要是指達(dá)到平衡時所需要的時間，即從萃取纖維頭與待測物質(zhì)接觸到萃取平衡時所需要的時間。由圖1可以看出，隨著萃取時間的延長，萃取所得風(fēng)味物質(zhì)的總峰面積越高，萃取出的揮發(fā)性物質(zhì)的種類越多，但萃取時間也不宜過長，因大多風(fēng)味物質(zhì)都是揮發(fā)性物質(zhì)，由于分子熱運(yùn)動，分子可能從吸附圖層揮發(fā)出去[4]。從總峰面積和萃取峰數(shù)量考慮，得出萃取時間在40 min時，萃取所得風(fēng)味物質(zhì)種類和數(shù)量最多，能完全展現(xiàn)風(fēng)味物質(zhì)。

圖1 不同萃取時間對風(fēng)味的影響

2.1.2 不同萃取溫度對風(fēng)味的影響 由圖2可以看出，當(dāng)萃取溫度為40～60℃時，隨著萃取溫度的升高，萃取所得風(fēng)味物質(zhì)的總峰面積越高，當(dāng)萃取溫度達(dá)60℃時，萃取峰總面積最高，萃取峰數(shù)量也達(dá)到最大，為36個；之后溫度過高，萃取效果開始下滑，可能是溫度過高加劇了分子熱運(yùn)動，熱解或聚合部分的揮發(fā)性物質(zhì)，從而使揮發(fā)性分子解脫吸附層[5-6]。因此在萃取過程中應(yīng)時刻注意溫度變化[7-8]，故確定最佳萃取溫度為60℃。

2.1.3 不同解析時間對風(fēng)味的影響 由圖3可以看出，隨著解析時間的延長，總峰面積和萃取峰數(shù)量都呈先增加后下降的趨勢?？赡苁且驗樵诟邷貭顟B(tài)下增加了固相微萃取纖維頭涂層的極性，隨之增強(qiáng)了對揮發(fā)性成分的吸附，進(jìn)樣口壓力過高，揮發(fā)性成分進(jìn)入到氣相色譜的可能性就降低了[9]。但從總體上看，解析時間對風(fēng)味物質(zhì)的總峰面積影響不大，總峰面積都在8 000 000以上。但為得到更多的風(fēng)味物質(zhì)，故選擇總峰面積最高的解析時間2 min。

圖2 不同萃取溫度對風(fēng)味的影響

圖3 不同解析時間對風(fēng)味的影響

2.1.4 不同固相微萃取纖維頭對風(fēng)味的影響 影響萃取效果的關(guān)鍵因素是萃取纖維頭涂層的種類和厚度，根據(jù)涂層“相似相溶原理”，極性涂層吸附極性化合物有較好的效果，非極性涂層吸附非極性化合物有較好的效果[10]。由圖4可以看出，不同的固相微萃取纖維頭萃取出來的風(fēng)味物質(zhì)不同，所得的總峰面積不同和萃取峰數(shù)量也就不同。綜合考慮，為得到更多的風(fēng)味物質(zhì)，故選擇總峰面積最高和萃取峰數(shù)量最多的固相微萃取纖維頭PDMS/ CARB/DVB。

圖4 不同解析時間對風(fēng)味的影響

2.2 響應(yīng)面分析及試驗結(jié)果

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，以萃取時間、萃取溫度、解析時間為自變量，總峰面積為因變量，根據(jù)可旋轉(zhuǎn)中心組合設(shè)計方法，進(jìn)行3因素3水平試驗優(yōu)化萃取條件。試驗因素水平設(shè)計及試驗結(jié)果見表1。

由表2可以看出，B、C的影響極顯著，A的影響顯著。AB、BC的交互作用不顯著，AC的交互作用顯著。所有的因素中，影響較大的是一次項和平方項，影響較小的是交互項。P值＜0.05，說明這個模型的因素都具有顯著的意義，不同處理間的差異顯著；R2為0.9593，表明因變量的取值有 95.93%來自于自變量，即萃取溫度、萃取時間與解析時間。上述結(jié)果表明該模型能反映因變量的變化，擬合程度好[11]。得到回歸方程：

主要因素間的交互作用如下圖5所示。

所得的回歸方程能較好的預(yù)測豆醬風(fēng)味物質(zhì)萃取隨各參數(shù)的變化規(guī)律，可以利用該回歸方程確定最佳萃取條件。由 Design Expert 8.0軟件分析得到的最大因變量對應(yīng)的固相微萃取最佳條件如下：萃取溫度61.40℃，萃取時間40.99 min，解析時間 2 min，理論最大峰面積為9.05709E+006。為檢驗響應(yīng)面法的可行性，采用得到的最佳萃取條件進(jìn)行萃取的驗證實驗?？紤]到實際操作，對萃取條件進(jìn)行調(diào)整，得出最佳萃取條件為：萃取溫度62℃，萃取時間 41 min，解析時間 2 min。經(jīng) 3次平行實驗得到的實際平均峰面積為8.45932E+006，與理論值相差6.60%。表明該模型有較高的適用性，該響應(yīng)面方法對傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬揮發(fā)性物質(zhì)萃取條件進(jìn)行回歸分析和參數(shù)優(yōu)化也有較好的適用性[12]。

2.3 黑龍江省傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬風(fēng)味物質(zhì)檢測

根據(jù)上述實驗得到的最佳條件，應(yīng)用PDMS/CARB/DVB固相微萃取頭，萃取溫度62℃，萃取時間41 min，解析時間2 min，檢測黑龍江省傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬發(fā)酵1個月的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分及相對含量見表3。

由表3可得，經(jīng)SPME吸附，GC-MS分析，共得到34個有效峰，與譜圖庫比對得到34種揮發(fā)性成分，包括烷烯烴類11種，酮類2種，醚類4種，醛類2種，芳香類化合物6種，酯類8種，雜環(huán)類化合物1種。由此可知，烷烯烴類、酯類和芳香類對黑龍江省傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬風(fēng)味貢獻(xiàn)最大，都具有果香、甜香和脂肪香的氣味，讓人產(chǎn)生食欲。

3結(jié)論

通過響應(yīng)面試驗所得的回歸方程能較好的預(yù)測豆醬風(fēng)味物質(zhì)萃取隨各參數(shù)的變化規(guī)律，可以利用該回歸方程確定最佳提取條件?？紤]到實際操作，對萃取條件進(jìn)行調(diào)整，得出最佳萃取條件為：萃取溫度62℃，萃取時間41 min，解析時間2 min。

表1 響應(yīng)面試驗設(shè)計

表2 回歸方程方差分析

圖5AC因素間的交互作用圖

表3 傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬發(fā)酵1個月的風(fēng)味物質(zhì)

采用頂空固相微萃取與氣質(zhì)聯(lián)用法，在發(fā)酵一個月的傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬樣品中共鑒定出34種揮發(fā)性風(fēng)味成分，這些成分包括酯類、醛類、酮類、醚類、烷烯烴類、酚類和雜環(huán)化合物等幾類物質(zhì)，可得出其主要風(fēng)味物質(zhì)為：11-二十三烯，苯甲醛，苯乙醛，2-壬酮，十甲基環(huán)五硅氧烷，4-甲氧基苯乙烯，萘，吲哚，2-甲基萘，3,4-二甲氧基苯乙烯，鄰苯二甲酸二丁酯，油酸甲酯，10,13-十八碳二烯酸甲酯，(Z,Z)-9,12-十八烷二烯酸乙酯，這些可能為黑龍江省傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬的特征風(fēng)味物質(zhì)。

［1］王夫杰,魯緋.我國醬油研究現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢[J].中國釀造,2010(12):3-7.

［2］苗志偉,官偉,劉玉平.醬中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技,2012(8):390-394,397.

［3］湯慧娟,韓翠萍,劉洋,等.傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬的養(yǎng)分變化分析[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2013,39(4): 64-67.

［4］Eunice C.Y.,Li-Chan.Development of solid-phase microextraction methodology for analysis of headspace volatile compounds in simulated beef flavour Soo-Yeun Moon[J].Food Chemis try,2004,88:141-149.

［5］Jianxin Zhao,Xiaojun Dai,Xiaoming Liu,et al.Comparison of aroma compounds in naturally fermented and inoculated Chinese soybean pastes by GC-MS and GC-Olfactometry analysis[J].Food Control,2011, 22(6):1008-1013.

［6］Jose'David Carrillo,et al.Determination of volatile oak compounds in wine by headspace solid-phase microextraction and gas chromatog raphy'mass spectro metry[J].Journal of Chromatography A,2006,1102: 25-36.

［7］F.Rodrigues,M.Caldeira,J.S.Ca'mara..Development of a dynamic headspace solid phase microextraction procedure coupled to GC-qMSD for evaluation the chemical profile in alcoholic beverages[J]. Analytica Chimica Acta,2008,609:82-104.

［8］J.S.Camara,et al.Comparative study of the whisky aroma profile based on headspace solid-phase microextraction using different fibre coatings[J].Journal of Chromatography A,2007,1150:198-207.

［9］張玉玉,黃明泉,田紅玉,等.“六必居”面醬揮發(fā)性成分SDE法提取及GC-MS分析[J].中國食品學(xué)報,2010,10(2):154-159.

［10］薛璐,張琦,胡志和.頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法測定內(nèi)蒙酥油風(fēng)味物質(zhì)[J].食品工業(yè)科技,2013,34(8):61-64.

［11］夏靜芬,邴哲希,梅春玲.響應(yīng)面法優(yōu)化固相微萃取飲用水中的DBP[J].環(huán)境科學(xué)與技術(shù),2011,34(11):142-146.

［12］牛麗影,郁萌,吳繼紅,等.固相微萃取條件對橙汁主要揮發(fā)性成分GC-FID測定的影響[J].食品科學(xué),2013(22):224-233.

Optimizing HS-SPME Extraction for Flavor Compounds of Traditional Fermented Soybean Paste by Response Surface Methodology

HanCuiping,TangHuijuan,ZhaoYue,WangZongying,ChengJianjun,TianBo,LiYang, XieFengying
（College of Food Science,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China）

The optimum extraction conditions for flavor compounds of traditional fermented soybean paste were established by head-space solid phase micro extraction（HS-SPME）in combination with response surface methodology at actual accepted conditions.The optimum extraction conditions were temperature of 62℃,extraction duration of 41.0 min and parsing duration of 2 min.Thirty-four volatile flavor ingredients including alkyl olefins,esters,aldehydes,ketones,and fragrant aromatic compounds were identified by HS-SPME to a one-month traditional fermented soybean paste samples.These ingredients contributed a lot to the flavor of traditional fermented soybean paste,and probably be the special flavor substances for the traditional fermented soybean paste in Heilongjiang province.

Traditional fermented soybean paste;Flavor compounds;HS-SPME;GC-MS;Response surface methodology

TS214.2

A

1674-3547(2015)06-0014-07

2015－09－29

韓翠萍，女，博士，教授，研究方向為糧食、油脂及植物蛋白工程

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項目面上項目（12521018）