常鈺菲，侯虎，李八方

(中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，青島 山東，266003)

鱈魚，鱈屬魚類，是世界年捕撈量最大的深海魚。鱈魚中蛋白含量約16.5%，高于三文魚、鯧魚等魚類，具有很高的營養(yǎng)價(jià)值［1］。研究表明，水產(chǎn)蛋白酶解產(chǎn)物中廣泛存在著具有降血壓［2］、抗氧化［3-4］等特殊生理功能的多肽，還可用于牛磺酸、殼聚糖［5］等的制備，來源于海洋生物的活性肽，在功能食品的開發(fā)中極具潛力。

但是，水產(chǎn)品普遍具有令人生厭的不良風(fēng)味，尤以腥味為主;此外，在制備酶解液時(shí)，由于酶解過程較難控制，酶解產(chǎn)物通常具有苦腥味，嚴(yán)重制約水產(chǎn)蛋白酶解液在食品方面的應(yīng)用［6］。因此，脫腥成為水產(chǎn)品加工及應(yīng)用領(lǐng)域亟待解決的問題。

水產(chǎn)品脫腥方法主要分為物理脫腥、化學(xué)脫腥及生物脫腥三類，常見方法有活性炭吸附法、酸堿處理法及酵母發(fā)酵等［7］。活性炭吸附法在脫腥脫色方面有一定效果，但使蛋白質(zhì)損失較大;酸堿處理法會引入一定的試劑殘留;酵母等微生物發(fā)酵法，僅適于液態(tài)樣品［8］，且酵母粉的加入會引入異味。近年來，大孔樹脂因具有吸附性和篩選性，能有效吸附各類有機(jī)物質(zhì)，在不良風(fēng)味脫除方面的應(yīng)用逐漸興起［9-11］。

本實(shí)驗(yàn)以大孔樹脂吸附脫腥為研究對象，通過單因素實(shí)驗(yàn)，以大孔樹脂型號為變量進(jìn)行樹脂初篩，選出對鱈魚蛋白酶解產(chǎn)物脫腥的最佳樹脂類型;以溫度、樹脂添加量及pH為變量進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，得出該型大孔樹脂的最佳脫腥工藝，并通過驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)及SPME-GC-MS分析確證該工藝可行、有效，為鱈魚蛋白酶解液在腥味脫除、功能性食品開發(fā)等水產(chǎn)品加工應(yīng)用領(lǐng)域提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)及理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮鱈魚購自青島南山水產(chǎn)品市場。宰殺后的新鮮鱈魚，去除魚皮、內(nèi)臟及鰓部，取背部魚肉，制成肉糜，于-20℃冷凍保存。

枯草桿菌堿性蛋白酶(食品級)，由南寧龐博試劑有限公司提供;牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，由賽默飛科技有限公司提供;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

001×7型大孔樹脂，山東魯抗立科藥物化學(xué)有限公司;D151、D201、D311型大孔樹脂，安徽三星樹脂科技有限公司;DA201-C型大孔樹脂，江蘇蘇青水處理工程集團(tuán)有限公司;D4006、AB-8型大孔樹脂，南開大學(xué)化工廠。

1.2 儀器與設(shè)備

AL204電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司;DS-1高速組織搗碎機(jī)，上海標(biāo)本模型廠;PHS-3C雷磁pH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;SHA-B恒溫振蕩器，國華電器有限公司;722s可見分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司;65 μm PDMS/DVB萃取纖維及HP-INNOWax(30 m×0.25 mm×0.25 μm)氣相色譜柱，美國Supelco公司;GC-MS氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Agilent公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 鱈魚蛋白酶解液的制備

將鱈魚肉糜解凍，以20%為底物濃度加入至pH 10的緩沖液中，并加入0.15%枯草桿菌堿性蛋白酶，于55℃下攪拌酶解4 h，沸水浴中滅酶10 min，冷卻，于5 000 r/min離心20 min，取上清液待用。

1.3.2 大孔樹脂預(yù)處理［12］

將大孔樹脂用蒸餾水洗至出水無味，無細(xì)碎樹脂及雜質(zhì)。以0.5 BV無水乙醇浸泡24 h，蒸餾水反復(fù)洗凈至無氣味。以2 BV 4%HCl浸泡4 h，排去酸液，蒸餾水洗至中性;以2 BV 4%NaOH浸泡4 h，排去堿液，蒸餾水洗至中性。濕基保存，使用時(shí)抽濾脫水。

1.3.3 大孔樹脂靜態(tài)吸附單因素實(shí)驗(yàn)

以經(jīng)脫腥處理后的鱈魚蛋白酶解液的腥味分值及多肽損失率為指標(biāo)，分別考察樹脂型號、溫度、樹脂添加量、pH對大孔樹脂脫腥效果的影響。

1.3.4 中心組合(Box-Behnken)試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析

應(yīng)用Design-Expert 7.0軟件，依據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，以酶解產(chǎn)物脫腥后的腥味分值和多肽損失率為響應(yīng)值，選取脫腥溫度(X1)、樹脂添加量(X2)、pH(X3)3個自變量，分別在3個水平上進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，建立自變量與響應(yīng)值之間的回歸關(guān)系，求得最優(yōu)值并進(jìn)行驗(yàn)證，從而對大孔樹脂的脫腥工藝進(jìn)行優(yōu)化。共計(jì)17組試驗(yàn)，因素水平編碼見表1。

表1 響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表Table 1 Factors and coded levels in response surface model

1.3.5 脫腥效果評價(jià)

以大孔樹脂脫腥后的鱈魚蛋白酶解液的腥味分值和多肽損失率為評價(jià)指標(biāo)。

腥味分值由感官評定得來。感官評定小組由10名(5男5女)感官評定員組成，分別對大孔樹脂處理后的樣品進(jìn)行感官評定。評定室溫為25℃左右，評定過程中不得相互交流，樣品的評定之間有一定的時(shí)間間隔。以酶解原液作為參照(分值為6)，根據(jù)表2所列評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行打分，取平均值表示該樣品的腥味程度。

表2 感官評分標(biāo)準(zhǔn)表Table 2 Sensory evaluation standard

多肽含量的測定:參照水解液中多肽含量的測定方法［13］，分別測定鱈魚蛋白酶解原液和經(jīng)AB-8大孔樹脂處理后的鱈魚蛋白酶解液中的多肽含量，多肽損失率計(jì)算:

式中，W0—鱈魚蛋白酶解產(chǎn)物中多肽含量;W1—大孔樹脂處理后的鱈魚蛋白酶解產(chǎn)物中的多肽含量。

1.3.6 SPME-GC-MS分離鑒定

將鱈魚蛋白酶解液及大孔樹脂最佳工藝處理后的酶解液分別通過固相微萃取法(SPME)進(jìn)行腥味物質(zhì)萃取，并通過GC-MS進(jìn)行分離及鑒定。

SPME:萃取纖維采用65 μm PDMS/DVB。

GC:色譜柱采用為 HP-INNOWax(30 m ×0.25 mm ×0.25 μm)，進(jìn)樣口溫度250℃;初始柱溫40℃，保持3 min，以8℃ /min的速度升溫至250℃，保持10 min;載氣為氦氣(He)，流量為 0.8 mL/min。不分流進(jìn)樣。

MS:電子轟擊(EI)離子源，離子源溫度250℃，電子能量70 eV，檢測器電壓為350 V，質(zhì)量掃描范圍m/z 35～500。

通過計(jì)算各物質(zhì)的Kovats指數(shù)，進(jìn)一步為物質(zhì)定性，并通過檢索Flavor數(shù)據(jù)庫(http://www.flavornet.org)、LRI＆ Odour數(shù)據(jù)庫(www.odour.org.uk)及文獻(xiàn)值［14］等，對物質(zhì)進(jìn)行風(fēng)味描述。

2 結(jié)果與討論

2.1 大孔樹脂脫腥單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 不同型號大孔樹脂脫腥效果比較

以大孔樹脂型號為變量進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，脫腥效果如圖1-a所示。由圖可知，就腥味分值而言，大孔吸附樹脂(DA201-C、D4006、AB-8)對腥味物質(zhì)的吸附能力高于離子交換樹脂(001×7、D151、D201、D311);就多肽吸附能力而言，陽離子交換樹脂(001×7、D151)的吸附能力高于陰離子交換樹脂(D201、D311)，大孔吸附樹脂中，DA201-C吸附較多的多肽，多肽損失率最高，而在D4006型和AB-8型2種吸附樹脂作用下，多肽損失率較低。因此，從腥味分值和多肽損失率兩個角度綜合考慮，AB-8型大孔吸附樹脂可吸附較多的腥味物質(zhì)但又不至于損失大量多肽，脫腥效果較好。因此，本實(shí)驗(yàn)選取AB-8型大孔吸附樹脂作為最佳樹脂類型，用于后續(xù)的單因素實(shí)驗(yàn)及響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.1.2 溫度對大孔樹脂脫腥效果的影響

由圖1-b可知，在15～55℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，經(jīng)AB-8型大孔樹脂吸附處理后的酶解液的多肽損失率呈上升趨勢，而腥味分值呈降低趨勢，且兩者的變化幅度均隨溫度升高而逐漸減弱。這表明，在一定范圍內(nèi)，升高溫度，可促使AB-8型大孔樹脂更多地吸附多肽，致使多肽損失率上升;相應(yīng)地，升高溫度也可促進(jìn)AB-8型大孔樹脂對不良風(fēng)味物質(zhì)的吸附，此外，溫度的升高有利于腥味物質(zhì)的揮發(fā)，2種作用可共同導(dǎo)致腥味分值的降低。從腥味分值和多肽損失率兩個角度綜合考慮，當(dāng)溫度介于25～45℃之間時(shí)，脫腥效果較好。因此，本實(shí)驗(yàn)選取25、35及45℃，作為后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)中溫度的3個水平。

2.1.3 樹脂添加量對大孔樹脂脫腥效果的影響

由圖1-c可知，在2.0%～20.0%范圍內(nèi)，當(dāng)樹脂添加量增加時(shí)，酶解液的多肽損失率呈上升趨勢，腥味分值大幅下降，而當(dāng)樹脂添加量由10.0%增至20.0%時(shí)，腥味分值增幅很小，分值介于1.5～2.0之間，即表現(xiàn)為“腥味較弱”。這表明，在一定范圍內(nèi)，增加樹脂量可加大AB-8型大孔樹脂對鱈魚蛋白酶解液中多肽的吸附，致使多肽損失率升高;相應(yīng)地，樹脂量的增加也可促進(jìn)對腥味物質(zhì)的吸附，但當(dāng)樹脂添加到一定量時(shí)，繼續(xù)加大樹脂量，對腥味物質(zhì)的吸附因趨于飽和而無明顯變化。從腥味分值和多肽損失率兩個角度綜合考慮，當(dāng)樹脂添加量介于5% ～15%之間時(shí)，脫腥效果較好。因此，本實(shí)驗(yàn)選取5%、10%及15%，作為后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)中樹脂添加量的3個水平。

2.1.4 pH對大孔樹脂脫腥效果的影響

由圖1-d可知，當(dāng)pH值由4升至9時(shí)，酶解液的多肽損失率均在15%上下浮動，無明顯變化;而在pH值由4升至7時(shí)，腥味分值大幅降低，酶解液由“腥味偏重”變?yōu)椤靶任遁^弱”或“略有腥味”，當(dāng)pH值繼續(xù)升高時(shí)，腥味分值略微上升。這表明，pH值的高低對多肽吸附率影響甚微;對腥味而言，中性環(huán)境更利于AB-8型大孔樹脂對鱈魚蛋白酶解液中腥味物質(zhì)的吸附。從腥味分值和多肽損失率兩個角度綜合考慮，當(dāng)pH值介于6～8之間時(shí)，脫腥效果較好。因此，本實(shí)驗(yàn)選取6、7、8作為后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)中pH的3個水平。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化大孔樹脂脫腥工藝

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

采用Design-Expert 7.0軟件對響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并對各因素進(jìn)行二項(xiàng)式擬合，并應(yīng)用該軟件繪制各指標(biāo)與其他2個自變量的三維曲面圖。響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見表3，方差分析見表4。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分別對腥味分值Y及多肽損失率W進(jìn)行二次多項(xiàng)式擬合，得到回歸模型如下:

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Experimental results of response surface model

由表4可以看出，本實(shí)驗(yàn)所選用的二次多項(xiàng)模型顯著(P＜0.05)，失擬項(xiàng)不顯著(P值分別為0.053 1、0.080 5，均大于0.05)，這說明此回歸模型理想，用方程Y和W擬合3個因素與腥味分值及多肽損失率之間的關(guān)系是可行的。對于腥味分值，其決定系數(shù)R2為0.973 5，校正決定系數(shù)Radj2為0.933 5，說明該模型能解釋93.35%的響應(yīng)值。對于多肽損失率，其決定系數(shù)R2為0.993 0，校正決定系數(shù)Radj2為0.984 0，說明該模型能解釋98.40%響應(yīng)值。

表4 腥味分值(Y)、多肽損失率(W)回歸模型方差分析Table 4 ANOVA on regression model of fishy odor value and polypeptide loss ratio

方差分析結(jié)果表明，X1、X2、X3、X12、X22和X32對腥味分值Y影響顯著，即溫度、樹脂添加量、pH三個因素均對腥味值有顯著影響;X1、X2、X3、X12、X1X3對多肽損失率影響顯著，即溫度、樹脂添加量、pH三個因素均對肽損失率有顯著影響，交互項(xiàng)溫度/pH對肽損失率也有顯著影響。

2.2.2 各因素對響應(yīng)值的影響

各因素對響應(yīng)值的影響如圖2(a～c)所示，在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，腥味分值隨著溫度、樹脂添加量、pH的增加出現(xiàn)下降，但繼續(xù)增大3者用量反而導(dǎo)致腥味分值的增加，這說明腥味分值Y具有低點(diǎn)。如圖2(d～f)所示，在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，多肽損失率W隨著溫度、樹脂添加量、pH的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，說明這3個因素均有最佳值。

圖2 各因素交互效應(yīng)三維曲面圖Fig.2 3D surface images of interaction effects

2.2.3 大孔樹脂靜態(tài)吸附脫腥最優(yōu)工藝驗(yàn)證

通過Design-Expert 7.0軟件，按照優(yōu)化目標(biāo)，將腥味分值Y設(shè)置為最小“minimize”，將多肽損失率W設(shè)置為最小“minimize”，得到最優(yōu)工藝為溫度25℃、樹脂添加量13.23%、pH 8.0，此工藝下腥味分值Y預(yù)測為1.9，多肽損失率W預(yù)測為17.62%。按照該最佳工藝條件重復(fù)試驗(yàn)3次，得到平均腥味分值Y為2.0，多肽損失率W為17.89%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與軟件預(yù)測值接近，說明該工藝穩(wěn)定、可靠。

2.3 SPME-GC-MS驗(yàn)證脫腥前后腥味物質(zhì)的變化

對鱈魚蛋白酶解產(chǎn)物及AB-8型大孔樹脂在最佳工藝下脫腥后的酶解產(chǎn)物分別進(jìn)行SPME-GC-MS分離鑒定，得到的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)總離子流色譜圖如圖3所示，所示揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)鑒定結(jié)果見表5。

圖3 脫腥前后總離子流色譜圖對比Fig.3 Total ions chromatogram of hydrolysate before and after deodorization

由圖3可知，在該GC-MS條件下得到的總離子流色譜圖的分離度較好。由表5可知，經(jīng)AB-8型大孔樹脂最佳工藝處理后，鱈魚蛋白酶解產(chǎn)物中的8種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)被脫除，且其他物質(zhì)的豐度均有一定程度降低。被脫除的風(fēng)味化合物中，1-戊烯-3-醇、己醛、2-己烯醛及異戊酸冰片酯等是水產(chǎn)品中常見的腥味來源［15］:1-戊烯-3-醇主要賦予鱈魚蛋白酶解液以蘑菇、肉味和溫和油脂風(fēng)味，具有低閾值和高風(fēng)味活性的特點(diǎn)，被證明對北極蝦［16］等水產(chǎn)品的風(fēng)味構(gòu)成亦有較大貢獻(xiàn);己醛、己酸甲酯等，主要賦予鱈魚蛋白酶解產(chǎn)物以青草味、清香味;異戊酸冰片酯(bornyl isovalerate)是鱈魚蛋白酶解液土腥味的主要來源［17］。因此，SPMEGC-MS結(jié)果表明，經(jīng)AB-8大孔樹脂最佳工藝處理后的鱈魚蛋白酶解產(chǎn)物，其腥味有所減弱，該方法可有效脫除鱈魚蛋白酶解產(chǎn)物中的腥味物質(zhì)。

表5 GC-MS及Kovats指數(shù)鑒定結(jié)果Table 5 Identification results of GC-MS and Kovats indices

3 結(jié)論

(1)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AB-8型大孔吸附樹脂脫腥效果最佳;其他條件相同，當(dāng)溫度介于25～45℃時(shí)，當(dāng)樹脂添加量介于5% ～15%時(shí)，當(dāng)pH在6～8范圍內(nèi)時(shí)，脫腥效果較好。

(2)AB-8型大孔樹脂對鱈魚蛋白酶解液的最佳脫腥工藝為:溫度25℃、樹脂添加量13.23%、pH 8.0。此工藝下脫腥得到的酶解液腥味分值為2.0，多肽損失率為17.89%，與軟件預(yù)測值接近。

(3)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)及SPME-GC-MS分析表明，該脫腥工藝有效、可靠，可作為AB-8型大孔樹脂對鱈魚蛋白酶解液的最佳脫腥工藝。

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