快速老化小鼠P8海馬神經元突觸結構與功能可塑性

封敏張曉抒1張英俊2熊殷藝3魯娟3盧圣鋒4余曙光3

(湖南醫(yī)藥學院針灸推拿教研室，湖南懷化418000)

摘要〔〕目的從海馬神經元突觸結構與功能可塑性角度探討阿爾茨海默病(AD)認知功能缺損的可能原因。方法以10月齡快速老化小鼠(SAMP)8為AD模型，同月齡抗快速老化小鼠(SAMR)1為正常對照，采用Morris水迷宮實驗評價動物學習記憶能力，透射電鏡觀察海馬CA1區(qū)神經元突觸超微結構，在體長時程增強(LTP)記錄觀察海馬前穿通纖維-齒狀回(PP-DG)通路神經元突觸傳遞效能。結果與SAMR1比較，SAMP8逃避潛伏期延長(P=0.000)，穿越有效區(qū)次數減少(P=0.046)；海馬CA1區(qū)神經元突觸后致密帶變薄(P=0.000)，突觸間隙增寬(P=0.024)，突觸界面曲率下降(P=0.000)；海馬PP-DG通路LTP誘發(fā)率(P=0.362)、群峰電位(P=0.900)及潛伏期(P=0.394)差異無統(tǒng)計學意義。結論海馬CA1區(qū)突觸超微結構受損可能是導致SAMP8學習記憶能力下降的原因，CA1區(qū)與DG區(qū)在AD病理上可能扮演不同角色。

關鍵詞〔〕阿爾茨海默病；快速老化小鼠P8；突觸可塑性；長時程增強

中圖分類號〔〕R741.02〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：國家自然科學基金資助項目(81072866，81202743)；湖南省科技廳科研項目(2014FJ3018)；湖南省中醫(yī)藥管理局科研項目(201479)

通訊作者：余曙光(1965-)，男，研究員，博士生導師，主要從事針灸作用機制研究。

1華僑大學校醫(yī)院2湖南醫(yī)藥學院醫(yī)學影像系

3成都中醫(yī)藥大學針灸推拿學院4南京中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院

第一作者：封敏(1982-)，女，博士，講師，主治醫(yī)師，主要從事針灸促神經康復機制研究。

Synaptic structure and function in the hippocampus of senescence accelerated mouse prone 8

FENG Min,ZHANG Xiao-Shu,ZHANG Ying-Jun,etal.

Department of Acupuncture and Moxibustion,Hunan University of Medicine,Huaihua 410008,Hunan,China

Abstract【】ObjectiveTo explore the pathogenesis of Alzheimer's disease (AD) in aspect of synaptic structure and function in hippocampus.Methods10-month old male SAMP8 and SAMR1 were taken as AD and control groups respectively.Morris water maze was performed to observe learning and memory abilities.Transmission electron microscope was used to observe the synaptic ultrastructure in CA1 subregion of hippocampus.In vivo,electrophysiology recording were used to detect the synaptic efficacy of perforantpath-dentategyms (PP-DG) pathway.ResultsCompared to those of control group,escaping latency was prolonged(P=0.000) and target annulus crossings was decreased(P=0.046) in model group.The thickness of post synaptic density was decreased(P=0.000)，the width of synaptic cleft was increased(P=0.024)and the curvature of the synaptic interface was decreased(P=0.000)in hippocampal CA1 subregion of model group.There were no significant differences in the induction of long-term potentiation(P=0.362),the population spike(PS) amplitudes(P=0.900) and the reduction in the latency of the PS(P=0.394) in PP-DG pathway between two groups.ConclusionsThe impairment of synaptic structure in hippocampal CA1 subregion maybe one of the probable pathogenesis underlying AD.The CA1 and DG subregions of the hippocampus might play different roles in AD pathology.

【Key words】Alzheimer's Disease;SAMP8;Synaptic plasticity；Long-term potentiation

海馬是學習與記憶的關鍵腦區(qū)，也是阿爾茨海默病(AD)易感區(qū)域，海馬神經元突觸可塑性異常被認為是導致AD認知障礙的重要因素〔1〕。增齡性快速老化特征，學習記憶能力減退及AD特征性病理改變使快速老化小鼠(SAMP)8成為較理想的動物模型，近年來被逐漸應用于AD研究〔2〕。但目前對SAMP8海馬神經元突觸效能的了解尚少。本研究擬從突觸結構和功能兩方面觀察SAMP8海馬神經元突觸可塑性變化及其與學習記憶的關系，探討AD認知功能缺損的可能原因，同時補充SAMP8的病理變化情況。

1材料與方法

1.1實驗動物與分組雄性10月齡SAMP8 13只，體重26～32 g。雄性10月齡抗快速老化小鼠(SAM)R115只，體重28～33 g。由天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院老年腦病研究室動物中心提供，清潔級，合格證號：SCXK(津)2008-0001。適應性喂養(yǎng)1 w，單籠飼養(yǎng)，自由進食，飲滅菌水，節(jié)律光照(LD=12/12)，動物房溫度、濕度分別為26℃、70%左右。每周更換一次墊料及飲水瓶。實驗中對動物的處置嚴格遵照科技部發(fā)布的《關于善待實驗動物的指導性意見》規(guī)定。

1.2主要實驗儀器Morris水迷宮視頻追蹤系統(tǒng)(成都泰盟)，透射電子顯微鏡H-600IV(日本日立)，刺激器MSE-3(日本Nihon kohden)，隔離器SS-102J(日本Nihon kohden)，腦立體定位儀SR-6N(日本Narishie Ins)，顱骨鉆(日本Minimo)，數模轉換器Digidata1322A(美國Axon Ins)，微電極放大器(美國Axon Ins)，WinLTP軟件(英國布里托爾大學)。

1.3Morris水迷宮實驗〔3〕直徑80 cm的圓形水池，分為N、E、S、W 4個方向，圓形平臺直徑10 cm，水溫(19±1)℃，水中放入脫脂奶粉，使之渾濁。依次進行可視平臺實驗(VPT)2 d，定位航行實驗(PNT)5 d及空間探索實驗(SPT)1 d。記錄PNT中小鼠找到水下平臺所需的逃避潛伏期時間和SPT中小鼠穿越原平臺位置有效區(qū)的次數，分別評估小鼠海馬依賴的空間參考學習與記憶能力。

1.4透射電鏡檢測采用隨機數字表法選取兩組小鼠各3只。依次進行腹腔注射麻醉(1%戊巴比妥鈉0.4 ml/100 g)，開胸，灌注(4%多聚甲醛+2%戊二醛混合固定液)，斷頭剝離腦組織，分離海馬。依照小鼠大腦腦立體定位圖譜取海馬水平部背內側CA1區(qū)組織一塊約1 mm3。電鏡制樣后，每只小鼠用透射電鏡觀察1張銅網，隨機拍攝5張照片，底片放大2.5萬倍印相。本研究遵循的興奮性突觸確認標準參照文獻〔4〕。采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)，對突觸界面超微結構進行測量：(1)突觸后致密帶(PSD)厚度、突觸間隙寬度的測量：參照體視學方法，測量正方測試格的測試線與PSD或突觸間隙相交所截截線的截距，計算其平均值L，根據體視學計算公式，PSD的平均厚度或突觸間隙寬度= L/2 。(2)突觸界面曲率(R)以突觸界面弧長a與弦長b之比表示，即R=a/b〔5〕。

1.5在體長時程增強(LTP)記錄小鼠進行腹腔注射麻醉(20%烏拉坦，0.01 ml/g)后，將頭部水平固定于腦立體定位儀上，剪開頭皮暴露顱骨，鉆孔，將刺激電極插入至前穿通纖維(PP)，記錄電極插至齒狀回(DG)顆粒細胞層，參比電極夾于頭皮。

群峰電位(PS)記錄：將刺激器參數調至波寬100 μs，電流0.3 mA，誘發(fā)PS，調節(jié)刺激電極與記錄電極獲得最佳PS后穩(wěn)定60 min，繼而調整刺激強度使PS為最大值的1/3～1/2，記錄30 min作為基線。此后給予強直刺激(TS)(頻率150 Hz，波寬150 μs，每串由5個脈沖方波組成，共8串，串間隔10 s)誘發(fā)LTP，重復3次TS。記錄TS后60 min內的PS。信號通過微電極放大器(低通濾波1 kHz，增益10)、數模轉換器，應用WinLTP進行采樣分析。

觀測指標：LTP誘發(fā)率，LTP誘發(fā)后PS及潛伏期改變幅值。以基線期PS和潛伏期的均數為基礎值(100%)，TS后每個單脈沖檢驗刺激(參數同基線期)所誘發(fā)的PS及潛伏期與之相比為PS及潛伏期改變幅值。LTP成功誘導標準：TS后PS平均幅值≥基礎PS值120%，并持續(xù)30 min以上。

2結果

2.1學習記憶能力在Morris水迷宮實驗的VPT中未觀察到小鼠游泳姿態(tài)異?；驘o法找到平臺的情況，說明所有小鼠無運動或感覺缺陷，具備完成水迷宮實驗的能力。在PNT中，與SAMR1比較，SAMP8逃避潛伏期延長(P<0.05)(表1)，說明SAMP8海馬依賴的空間參考學習能力減退；在SPT中，穿越有效區(qū)次數減少(P<0.05)(表1)，說明SAMP8記憶能力減退。

表1　兩組小鼠Morris水迷宮實驗結果比較( ± s)

與SAMP8組比較：1)P<0.05；下表同

2.2海馬神經元突觸超微結構與SAMR1比較，SAMP8海馬CA1區(qū)興奮性突觸PSD變薄(P<0.05)、突觸間隙增寬(P<0.05)、突觸界面曲率下降(P<0.05)(圖1，表2)，說明SAMP8突觸界面超微結構受損。

A：SAMR1;B為SAMP8； 為突觸后致密帶，→為突觸間隙 圖1　兩組小鼠海馬CA1區(qū)神經元突觸(電鏡，×25 000)

組別突觸數(個)PSD(x±s,nm)R(x±s)突觸間隙寬度〔M(Qn),nm〕SAMR1組SAMP8組708548.40±11.331)39.83±9.301.17±0.071)1.12±0.0517.02(3.68)1)18.86(6.36)t/P值-5.19/0.000-5.181/0.000-2.25/0.024

2.3海馬神經元突觸效能與SAMR1組(50%)比較，SAMP8組海馬PP-DG通路LTP誘發(fā)率(50%)、PS及潛伏期幅值變化無顯著差異(表3)，說明與同月齡SAMR1相比，10月齡SAMP8海馬PP-DG通路突觸效能無明顯改變。

表3　兩組小鼠海馬LTP參數PS及潛伏期幅值變化比較

3討論

SAM是日本學者在繁殖自然AKR/J變異小鼠時篩選出來進行近交延代繁殖而成，常用于老化疾病研究，同源SAMR1被用做正常對照。其中SAMP8以學習記憶能力減退為主要特征。研究表明，8～10月齡SAMP8學習記憶功能明顯低下，不僅具有全身老化特征，還存在Aβ、APP沉積、tau蛋白異常磷酸化、膽堿能神經功能下降等AD病理性改變〔6,7〕。因此，本研究選用10月齡SAMP8作為AD動物模型。

突觸可塑性在很大程度上反映整個神經回路的修飾，是近年神經科學領域的研究熱點。長時程的突觸可塑性被公認為是學習與記憶的生理基礎，突觸異常也被認為是導致AD記憶障礙的原因〔1〕。本研究結果表明，與同月齡SAMR1相比，10月齡SAMP8海馬CA1區(qū)突觸超微結構受損，學習記憶能力下降，這與其他研究小組及本課題組前期研究結果一致〔8〕。突觸結構可塑性與功能可塑性互為基礎、相互影響，突觸結構受損會引發(fā)突觸傳遞效率的下降。然而，筆者通過在體電生理記錄卻觀察到，與突觸超微結構損傷不同，SAMP8 PP-DG通路突觸傳遞效能并無明顯變化，甚至在LTP的誘發(fā)上還有易化趨勢。對于不一致的結果，筆者分析存在以下可能：(1)海馬的亞區(qū)差異。海馬包括CA1～4、DG和下托等亞區(qū)，亞區(qū)具有各自獨特的細胞構筑，亞區(qū)間通過"三突觸回路"形成海馬內部神經環(huán)路：第1級突觸為PP-DG，第2級為DG苔狀纖維-CA3區(qū)椎體細胞，第3級為CA3區(qū)Schaffer側支-CA1區(qū)椎體細胞。普遍的觀點認為海馬各亞區(qū)具有不同的理化特性〔9〕，參與學習記憶功能的程度并非完全相同，且存在AD易感性差異。AD的病理生理過程在臨床診斷為癡呆多年前就開始了〔1〕，AD可累及整個海馬，而受累時間最早、程度最重的為CA1區(qū)，因此有觀點認為，CA1區(qū)萎縮是AD臨床前階段的重要生物標志〔10〕。一項離體腦片電生理研究觀察到8-9月齡SAMP8 CA1區(qū)PS增幅明顯降低〔11〕，這與筆者的CA1區(qū)電鏡結果相符。而本研究在體記錄的為海馬第1級突觸——PP-DG，其突觸后反應來自DG區(qū)，這可能是導致電生理結果與行為學、突觸結構結果不相匹配的重要原因。研究表明，以CA1為主的背側海馬與學習記憶密切相關〔12〕，而以DG為主的腹側海馬則與情緒應激更為相關〔13〕，是情緒記憶的關鍵區(qū)域之一〔14〕。文獻報道，75%AD患者前驅癥狀中具有情緒障礙，包括抑郁、焦慮、易怒、具攻擊性等〔15〕。筆者也觀察到SAMP8易被激惹、具備較強攻擊性，這是否與DG區(qū)神經元突觸的異常活動有關〔16〕？筆者前期研究發(fā)現，SAMP8海馬AMPA受體GluR2亞基含量下降，可能造成細胞內Ca2+超載，使突觸反應病理性增強，介導興奮性神經毒性〔8〕。本次電生理實驗觀察到SAMP8 PP-DG通路LTP誘發(fā)有易化趨勢，雖然差異不具有統(tǒng)計學意義，但由于樣本量較小，暫不能排除抽樣誤差導致總體差異被掩蓋的可能，更明確的結論有待進一步研究。此外，由于海馬三級突觸之間并非簡單的線性關系〔9〕，作為三突觸回路中的第一級，PP-DG的電生理記錄也可能無法反映下游CA1區(qū)突觸效能情況。從這個角度來看，實驗結果間并不矛盾。(2)炎性因子影響。與同月齡SAMR1相比，12月齡SAMP8在體海馬PP-DG通路LTP無明顯變化。在體實驗時海馬局部組織細胞因子的水平可能是造成LTP結果與行為學結果不符的原因。SAMR1較強的免疫功能可能導致腦組織在LTP實驗時急性炎癥反應增強，釋放較多炎性因子對LTP產生抑制作用〔17〕。

本實驗結果提示，CA1區(qū)突觸超微結構受損可能是導致SAMP8學習記憶能力下降的原因，海馬CA1區(qū)與DG區(qū)在功能上各有側重，分別與學習記憶和情緒應激相關，二區(qū)在AD病理上也可能扮演不同角色，但迄今為止對每一區(qū)域功能的細節(jié)還不甚了解。較新的觀點認為，海馬亞區(qū)在AD的發(fā)病和診斷中具有重要意義〔10,16,18〕，值得進一步關注，而AD海馬CA1區(qū)突觸超微結構受損的機制也是深入研究的方向。

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〔2014-12-29修回〕

(編輯曲莉)