李悅　馬麗娟　袁芳

[摘要] 目的 探討瑣瑣葡萄多糖（VTP）對Aβ25-35誘導的阿爾茨海默病（AD）模型大鼠學習記憶和海馬神經(jīng)元的影響。 方法 SPF級AD大鼠90只，隨機分為正常對照組、模型組、陽性對照組（多奈哌齊組，0.5 mg/kg）、VTP低、中、高劑量組（300、150、50 mg/kg）。采用雙側(cè)海馬CA1區(qū)注射Aβ25-35建立AD模型，隨后給予等體積的藥物和蒸餾水進行分組灌胃，持續(xù)15 d。利用Morris水迷宮觀察大鼠行為學；在光鏡和電鏡下觀察大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)變化；并用TUNEL染色檢測大鼠海馬神經(jīng)元細胞凋亡水平。 結(jié)果 與AD模型組比較，VTP低、中、高劑量組和多奈哌齊組能明顯改善大鼠學習記憶能力（P < 0.05），明顯改善海馬神經(jīng)元細胞形態(tài)，增加正常海馬神經(jīng)元數(shù)量（P < 0.05），降低海馬神經(jīng)元異常凋亡率（P < 0.05）。 結(jié)論 瑣瑣葡萄VTP通過減少Aβ誘導的海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細胞的損傷及凋亡，發(fā)揮改善AD學習記憶能力和保護海馬神經(jīng)元的作用。

[關鍵詞] 瑣瑣葡萄多糖；阿爾茨海默病；水迷宮；β-淀粉樣蛋白；TUNEL染色

[中圖分類號] R285 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2016）10（b）-0008-04

[Abstract] Objective To explore the effect of the polysaccharides from vitis vinifera L. （VTP） on hippocampal neurons and the ability of learning and memory in Alzheimers disease （AD） model rat. Methods Ninety male Sprague-Dawley rats were randomly divided into normal control group， model group， positive control group （Donepezil group， 0.5 mg/kg）， VTP low-dose， middles-dose and high-dose （300， 150， 50 mg/kg） group. Aβ 25-35 was injected into the bilateral hippocampal CA1 to induce AD models. The Morris water maze was used to investigate the ability of learning and memory. The Neurons morphological changes of hippocampal CA1 neurons was observed by light microscope and electron microscope. TUNEL staining was used to detect the apoptosis of hippocampal neurons. Results Compared with those of model group， the learning and memory abilities of VTP and Donepezil groups were significantly improved （P < 0.05）， the number of nerve norml cells was significantly increased and apoptosis cells was significantly decreased （P < 0.05）. Rats in the control group had no obvious morphological changes， and morphology of rat in the VTP and Donepezil groups was basical normal， however， the obvious deposition of cellular morphology was displayed in model group. Conclusion VTP can improve the ability of learning and memory， and protect the hippocampal neurons of AD model rat， through alleviating hippocampal CA1 neurons damage induce by amyloid beta .

[Key words] Polysaccharides from vitis vinifera L.； Alzheimers disease； Water maze； β-amyloid peptide； TUNEL staining

阿爾茨海默病（Alzheimers Disease，AD）是一種神經(jīng)退行性疾病，其特點是進行性的記憶障礙。β淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP）經(jīng)過連續(xù)酶促作用產(chǎn)生的β-淀粉樣蛋白（Aβ）在神經(jīng)元細胞外聚集成的老年斑是AD關鍵的病理特征[1]。近年來，通過天然植物尋找改善AD癥狀和發(fā)展的研究越來越多，如姜黃素[2-3]、綠茶多酚、銀杏葉提取物[4]、人參皂苷[5]均從減少Aβ聚集和細胞凋亡等方面取得了很好的治療效果。瑣瑣葡萄是新疆傳統(tǒng)維吾爾藥物之一，已被提取出多種活性物質(zhì)在抗氧化、抗衰老、抗病毒等方面有獨特功效[6-8]。本研究通過Aβ25-35建立AD模型大鼠，從行為學、形態(tài)學、海馬細胞凋亡等方面探討瑣瑣葡萄多糖（The polysaccharides from vitis vinifera L.，VTP）活性成分對AD學習記憶能力的改善作用和對腦組織海馬神經(jīng)元的保護作用。

1 對象與方法

1.1 實驗動物

SD大鼠90只（清潔級），雄性，體重（250±20）g，鼠齡7～8周，由新疆醫(yī)科大學動物中心提供（質(zhì)量合格證號：NO.650007000）。

1.2 試劑與儀器

VTP按照專利方法提取分離（專利號200710 201354）。Aβ25-35（Sigma公司，生理鹽水溶解后置于37℃孵化7 d）；鹽酸多奈哌齊片（衛(wèi)材藥業(yè)有限公司，批號：H20050978）；TUNEL試劑盒，（瑞士羅氏公司，批號：11684817910）。腦立體定位儀（德國TSE Systems，型號：540060）；Morris水迷宮視頻跟蹤分析系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）；三目顯微鏡（德國Leica公司，型號：DM3000B）；透射電子顯微鏡（日本JEOL公司，型號：JEM-1230）。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組及干預 實驗動物隨機分為6組：正常對照組、模型組、陽性對照組（多奈哌齊組）、VTP高、中、低劑量組，每組15只，在SPF實驗室正常飼養(yǎng)1周后建立模型。模型建立方法：3.0%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，定位海馬CA1區(qū)鉆孔，用微量進樣器將10 μL（每側(cè)5 μL，含10 μg）Aβ25-35溶液分別注入左右海馬（正常對照組給予生理鹽水），留針5 min。隨后分組灌胃給藥，每日1次（1.0 mL/100 g），連續(xù)15 d，為避免主觀影響采取雙盲方法。正常對照組和模型組大鼠給予蒸餾水灌胃；陽性對照組給予多奈哌齊溶液（多奈哌齊粉末溶于蒸餾水后充分震蕩搖勻，0.5 mg/kg）進行灌胃；VTP高、中、低劑量組分別灌胃300、150、50 mg/kg。

1.3.2 水迷宮實驗 動物于給藥第13天開始進行雙盲水迷宮訓練。定位航行實驗（前6 d）：平臺置于第3象限，大鼠從對象限入池，每次訓練90 s，利用大鼠水迷宮系統(tǒng)自動記錄所需的各項指標。第6天訓練成績作為測試結(jié)果?？臻g探索試驗（第7天）：撤去平臺，每只大鼠在原入池位置釋放，記錄其90 s內(nèi)在原平臺所在象限的游泳時間占總時間的百分比及其穿越有效區(qū)域位置（1.5倍原平臺所在區(qū)域位置）的次數(shù)。

1.3.3 石蠟切片制備及HE染色 每組隨機抽取12只大鼠麻醉后進行灌注取腦，腦組織固定于4%多聚甲醛。制備石蠟切片（每個腦組織切片6張），常規(guī)HE染色（每個腦組織3張），光學顯微鏡下觀察海馬神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，每組選取6張計數(shù)海馬CA1區(qū)正常神經(jīng)元數(shù)目。

1.3.4 電鏡標本制備及指標觀察 每組隨機抽取3只實驗大鼠斷頭取腦，分離出海馬組織，放置于電鏡固定液中固定。進行脫水、包埋、切片常規(guī)處理后用電子顯微鏡觀察海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)變化并采集圖像。

1.3.5 TUNEL細胞凋亡檢測 按照羅氏TUNEL試劑盒的檢測方法對大鼠腦組織石蠟切片標本（每個腦組織3張）進行細胞凋亡的檢測，并利用光學顯微鏡對海馬組織細胞形態(tài)進行觀察并采集圖像。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 VTP對AD大鼠水迷宮實驗的影響

在后3 d的訓練中，可明顯觀察到模型組大鼠相對于其余各組需要花更多的時間找到平臺（圖1A）。第6天測試成績（圖1B），與對照組比較，模型組大鼠潛伏期明顯增加（P < 0.05）；與模型組比較，多奈哌齊組和VTP低、中、高劑量組潛伏期顯著縮短（P < 0.05）。第7天空間探索實驗中原平臺所在象限停留時間百分比和穿越有效區(qū)域位置次數(shù)，模型組較正常對照組明顯減少（P < 0.05）；不同劑量VTP組和多奈哌齊組均較模型組有所增加（P < 0.05）。見表1。

2.2 VTP對大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)變化的影響

光鏡下可見（圖2，A～F），正常對照組海馬神經(jīng)細胞排列規(guī)整，胞核清晰。模型組可見大量排列不規(guī)則神經(jīng)元，層數(shù)減少，胞體縮小，多見多邊形或圓齒狀染色質(zhì)濃縮的胞核（箭頭所示），呈凋亡趨勢。多奈哌齊組和VTP高、中、低劑量組的海馬神經(jīng)元排列相較模型組規(guī)整，排列較緊密，核固縮濃染明顯減輕，可見個別病變形態(tài)海馬神經(jīng)元（箭頭所示）。正常對照組和模型組之間正常神經(jīng)元細胞數(shù)目的差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）；多奈哌齊組和VTP高、中、低劑量組的正常海馬神經(jīng)元數(shù)目較模型組多（P < 0.05）。

2.3 VTP對海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的影響

透射電鏡下（如圖3，A～F），正常對照組神經(jīng)細胞核膜光滑，染色質(zhì)細小均勻，胞漿內(nèi)細胞器結(jié)構(gòu)完整未見異常。模型組神經(jīng)元出現(xiàn)凋亡，周圍出現(xiàn)水腫，核膜破裂、皺褶，核染色質(zhì)凝聚、邊聚。多奈哌齊組和VTP各劑量組神經(jīng)元形態(tài)較好，核膜較完整，只有少量皺縮，細胞核輕度固縮，核內(nèi)染色質(zhì)分布均勻，胞質(zhì)內(nèi)細胞器尚屬正常。

2.4 VTP對各組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響

光鏡下TUNEL染色結(jié)果（圖4，A～F），深棕褐色細胞為凋亡細胞，模型組較對照組凋亡細胞表達明顯增多，多奈哌齊組和VTP低、中、高劑量組呈現(xiàn)零星散在分布的棕褐色細胞。模型組HE染色正常細胞個數(shù)少于正常對照組、多奈哌齊組及VTP各劑量組（P < 0.05）；模型組凋亡率較正常對照組增高（P < 0.05），多奈哌齊組及VTP各劑量組的細胞凋亡率較模型組顯著減少（P < 0.05）。

3 討論

聚集的Aβ對海馬神經(jīng)細胞體內(nèi)外的神經(jīng)毒性作用是AD發(fā)病的一個中心事件[9-10]，被認為是AD各種病理改變的共同通路，是AD形成和發(fā)展的關鍵因素[11-14]。本研究從此方面入手，利用Aβ1-42的核心毒性片段Aβ25-35[15]，建立出擬AD的動物模型。有相似的模型實驗顯示[16]，大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元受損最明顯，因此本實驗的造模和結(jié)果觀察重點放在大鼠海馬CA1區(qū)。近年來的研究表明，人參、枸杞、黃芪、靈芝等多糖對神經(jīng)細胞有保護作用[17-19]。為了發(fā)揮維藥瑣瑣葡萄多糖在醫(yī)藥保健方面的功能，本研究針對多糖的神經(jīng)保護作用進行動物實驗。

本研究結(jié)果顯示，模型組AD大鼠學習、記憶能力減退，海馬神經(jīng)元損傷嚴重，細胞調(diào)亡率顯著增加，顯示造模成功。與模型組比較，大鼠經(jīng)過15 d的VTP或多奈哌齊治療后進行水迷宮實驗，在定位航行和空間探索實驗中均發(fā)現(xiàn)空間學習記憶能力有明顯的改善。腦組織海馬神經(jīng)元對空間記憶能力具有很重要的作用[20]，海馬神經(jīng)元的損傷可能是導致大鼠水迷宮實驗逃逸潛伏期延長的原因。最新的研究表明，瑣瑣葡萄多糖對Aβ25-35誘導的PC12細胞凋亡具有抑制作用[21]，本實驗在VTP和多奈哌齊治療后，核固縮和凋亡神經(jīng)細胞較模型組也明顯減少，說明VTP能降低Aβ對AD大鼠的毒性作用。

綜上所述，海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)學改變及凋亡可能是導致AD大鼠學習記憶障礙的重要原因之一。VTP對Aβ誘導的海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細胞的損傷及凋亡具有明顯的改善作用，是可以作為AD治療的新藥的探討方向。對于VTP活性成分改善神經(jīng)元損傷的途徑及機制，需在后續(xù)的實驗中進行深入的探討。

[參考文獻]

[1] Mandel SA，Amit T，Kalfon L，et al. Cell signaling pathways and iron chelation in the neurorestorative activity of green tea polyphenols：special reference to epigallocatechin gallate （EGCG） [J]. J Alzheimers Dis，2008，15（2）：211-222.

[2] Nisbet RM，Nigro J，Breheney K，et al. Central amyloid-β-specific single chain variable fragment ameliorates Aβ aggregation and neurotoxicity [J]. Protein Eng Des Sel，2013， 26（10）：571-580.

[3] Seo JS，Kim TK，Leem YH，et al. SK-PC-B70M confers anti-oxidant activity and reduces Abeta levels in the brain of Tg2576 mice [J]. Brain Res，2009，1261：100-108.

[4] Luo Y，Smith JV，Paramasivam V，et al. Inhibition of amyloid-beta aggregation and caspase-3 activation by the Ginkgo biloba extract EGb761 [J]. Proc Natl Acad Sci U S A，2002，99（19）：12197-12202.

[5] Chen F，Eckman EA，Eckman CB. Reductions in levels of the Alzheimers amyloid beta peptide after oral administration of ginsenosides [J]. FASEB J，2006，20（8）：1269-1271.

[6] 劉濤，馬龍，趙軍，等.瑣瑣葡萄多糖的提取及抗氧化能力研究[J].新疆醫(yī)科大學學報，2007，30（11）：1230-1232.

[7] 俞丹，趙軍，劉濤，等.瑣瑣葡萄多糖對小鼠免疫功能的影響[J].食品科學，2010，31（9）：229-233.

[8] 劉濤，趙軍，李海波，等.瑣瑣葡萄多糖體外抗乙型肝炎病毒作用的實驗研究[J].中國藥理學通報，2011，27（1）：147-148.

[9] Pike CJ，Walencewicz AJ，Glabe CG，et al. In vitro aging of beta-amyloid protein causes peptide aggregation and neurotoxicity [J]. Brain Res，1991，563（1-2）：311-314.

[10] Butterfield DA，Castegna A，Lauderback CM，et al. Evidence that amyloid beta-peptide-induced lipid peroxidation and its sequelae in Alzheimers disease brain contribute to neuronal death [J]. Neurobiol Aging，2002，23（5）：655-664.

[11] Fang D，Wang Y，Zhang Z，et al. Increased neuronal PreP activity reduces Aβ accumulation，attenuates neuroinflammation and improves mitochondrial and synaptic function in Alzheimer diseases mouse model [J]. Hum Mol Genet，2015，24（18）：5198-5210.

[12] Christensen DZ，Huettenrauch M，Mitkovski M，et al. Axonal degeneration in an Alzheimer mouse model is PS1 gene dose dependent and linked to intraneuronal Aβ accumulation [J]. Front Aging Neurosci，2014，6：139.

[13] Izco M，Martínez P，Corrales A，et al. Changes in the brain and plasma Aβ peptide levels with age and its relationship with cognitive impairment in the APPswe/PS1dE9 mouse model of Alzheimers disease [J]. Neuroscience，2014，263：269-279.

[14] Zhu L，Zhong M，Zhao J，et al. Reduction of synaptojanin 1 accelerates Aβ clearance and attenuates cognitive deterioration in an Alzheimer mouse model [J]. J Biol Chem，2013，288（44）：32050-32063.

[15] Whitehead SN，Hachinski VC，Cechetto DF. Interaction between a rat model of cerebral ischemia and beta-amyloid toxicity：inflammatory responses [J]. Stroke，2005，36（1）：107-112.

[16] DAgostino G，Russo R，Avagliano C，et al. Palmitoylethanolamide protects against the amyloid-β25-35-induced learning and memory impairment in mice，an experimental model of Alzheimer disease [J]. Neuropsychopharmacology，2012，37（7）：1784-1792.

[17] 李源，劉穎，袁海峰，等.人參皂苷Rg1對阿爾茨海默病模型大鼠腦片磷酸化Tau蛋白及膽堿乙?；D(zhuǎn)移酶表達的影響[J].中國老年學雜志，2015，35（6）：1640-1641.

[18] 李宜培，王雪銀，陳潔，等.靈芝多糖肽對阿爾茨海默病大鼠β淀粉樣蛋白含量和tau蛋白過度磷酸化的影響[J].中華實用診斷與治療雜志，2015，29（9）：862-865.

[19] 費洪新，高音，孫麗慧，等.黃芪多糖對阿爾茨海默病小鼠海馬組織的影響[J].中國老年學雜志，2015，35（16）：4426-4429.

[20] Matsuzaki M，Honkura N，Ellis-Davies GC，et al. Structural basis of long-term potentiation in single dendritic spines [J]. Nature，2004，429（6993）：761-766.

[21] 袁芳，徐琦，盛磊，等.瑣瑣葡萄多糖對β淀粉樣蛋白誘導PC12細胞凋亡的影響[J].中國老年學雜志，2015，35（19）：5372-5373.

（收稿日期：2016-07-10 本文編輯：任 念）