高脂飲食對大鼠骨骼肌脂質(zhì)中間代謝產(chǎn)物的影響及機(jī)制

張雪梅任路平1宋光耀1甘可欣1王超2孔德賢聶倩

(河北省人民醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，河北石家莊050000)

摘要〔〕目的觀察高脂飲食對大鼠骨骼肌脂質(zhì)中間代謝產(chǎn)物的沉積及脂肪酸代謝中CD36及CPT1的影響。方法雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常對照組、高脂飲食組，分別喂養(yǎng)12 w，分別測定大鼠血糖(BG)及胰島素(INS)水平；透射電鏡觀察大鼠骨骼肌線粒體形態(tài)變化；GPO-PAP法檢測骨骼肌甘油三酯(TG)，ELISA試劑盒檢測骨骼肌甘油二酯(DAG)、神經(jīng)酰胺(CER)、長鏈脂酰輔酶A(LCCoAs)的變化；用RT-PCR和Western 印跡的方法分析大鼠骨骼肌CD36及CPT1的mRNA和蛋白的表達(dá)。結(jié)果與對照組相比，高脂組大鼠BG及INS水平均明顯升高，GIR明顯降低(P<0.01)；同時骨骼肌組織中TG、DAG、CER及LCCoAs含量明顯升高(P<0.01)。與對照組相比高脂組骨骼肌細(xì)胞內(nèi)可見大量大小不等的脂滴分布，線粒體腫脹，內(nèi)外膜部分融合，線粒體嵴變少變短，部分或全部消失，甚至出現(xiàn)空泡化。與對照組相比，高脂組CD36的mRNA及蛋白的表達(dá)明顯升高，CPT1的表達(dá)明顯降低(P<0.05)。結(jié)論高脂飲食可引起大鼠胰島素抵抗及骨骼肌組織中脂質(zhì)中間代謝產(chǎn)物的堆積，肌內(nèi)脂質(zhì)堆積與脂肪酸代謝中關(guān)鍵酶CD36、CPT1表達(dá)的變化有關(guān)。

關(guān)鍵詞〔〕胰島素抵抗；骨骼??；神經(jīng)酰胺；甘油二酯；長鏈脂酰輔酶A

中圖分類號〔〕R587〔

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(30971391)

通訊作者：宋光耀 (1958-)，男，博士，主任醫(yī)師，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事內(nèi)分泌系統(tǒng)及相關(guān)疾病研究。

1河北省人民醫(yī)院內(nèi)分泌科2河北省人民醫(yī)院臨研中心

第一作者：張雪梅 (1986- )，女，碩士，主要從事內(nèi)分泌系統(tǒng)及相關(guān)疾病研究。

近年來研究認(rèn)為，骨骼肌組織內(nèi)脂代謝中間產(chǎn)物如甘油二酯(DAG)、神經(jīng)酰胺(CER)、長鏈脂酰輔酶A(LCCoAS)的沉積增加是誘導(dǎo)骨骼肌胰島素抵抗(IR)的主要原因〔1〕。脂肪酸是人及哺乳動物的主要能源物質(zhì)，脂肪酸的攝入超出其氧化能力是骨骼肌內(nèi)脂肪堆積的主要原因〔2〕。脂肪酸轉(zhuǎn)位酶CD36是促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞攝取脂肪酸的重要膜蛋白〔3〕。進(jìn)入細(xì)胞中的脂肪酸必須進(jìn)入線粒體內(nèi)才能進(jìn)行代謝。而肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶CPT1在脂肪酸由胞液向線粒體基質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)中起關(guān)鍵作用〔4〕。本研究探討高脂飲食對脂代謝相關(guān)蛋白基因表達(dá)的影響。

1材料與方法

1.1模型建立6周齡雄性SD大鼠30只，體重100～120 g，按隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為對照組及高脂組各15只。對照組進(jìn)食普通飼料(配方：碳水化合物65.5%、蛋白質(zhì)24.2%、脂肪10.3%)，高脂組進(jìn)食高脂飼料(配方：碳水化合物20.1%、蛋白質(zhì)20.1%、脂肪59.8%)，分別喂養(yǎng)12 w后行相關(guān)指標(biāo)的測定，之后腹主動脈取血處死大鼠，留取骨骼肌組織。

1.2觀察指標(biāo)及檢測方法

1.2.1高胰島素正葡萄糖鉗夾試驗(yàn)2組大鼠喂養(yǎng)12 w后，從每組隨機(jī)選取大鼠6只，清醒狀態(tài)下進(jìn)行正常葡萄糖高胰島素鉗夾實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)前清晨，給予大鼠 3%戊巴比妥鈉麻醉，右側(cè)頸動脈和頸靜脈插管，管腔內(nèi)注入肝素抗凝，末端由實(shí)芯不銹鋼針封閉，由皮下延伸到頸后并固定。經(jīng) 4～5 d的術(shù)后恢復(fù)，使動物在清醒、自由活動下進(jìn)行鉗夾試驗(yàn)。術(shù)中胰島素輸注速度為4 mU·kg-1·min-1，葡萄糖濃度為30%，具體步驟參見文獻(xiàn)〔5〕。計(jì)算GIR=穩(wěn)態(tài)時葡萄糖輸注速率×葡萄糖濃度×1 000/體重(kg)/60，作為評價大鼠胰島素敏感性的指標(biāo)。

1.2.2血清指標(biāo)的測定2組大鼠喂養(yǎng)12 w，空腹12 h后，腹主動脈取血5 ml，測定空腹血糖(BG，美國 Roche 公司血糖儀)、空腹胰島素 (INS，ELISA方法，試劑盒由BLUE GENE公司提供)。

1.2.3透射電鏡觀察肌細(xì)胞線粒體形態(tài)的變化順肌絲方向迅速剪取大鼠比目魚肌放入事先預(yù)冷的4%戊二醛中，做好標(biāo)記，迅速切成1 mm×1 mm×1 mm組織塊固定，經(jīng)1%鋨酸后固定，常規(guī)清洗、脫水、浸透，Epon812包埋，超薄切片，鉗鈾染色，日立H-7500型透射電子顯微鏡觀察、照相。

1.2.4骨骼肌組織脂質(zhì)沉積指標(biāo)的測定取骨骼肌組織30 mg經(jīng)氯仿/甲醇抽提甘油三酯(TG)后,加入0.6%NaCl分離水相和有機(jī)相，吸取有機(jī)相待干燥后溶于100%乙醇500 μl，應(yīng)用過氧化物耦聯(lián) (GPO-PAP)試劑盒測定TG含量 (Roche，USA)。骨骼肌組織中DAG、CER及LCCoAs由相應(yīng)的ELASIA試劑盒進(jìn)行測定(試劑盒由BLUE GENE公司提供)。

1.2.5骨骼肌組織CPT1及CD36 mRNA的檢測應(yīng)用實(shí)時熒光定量RT-PCR進(jìn)行檢測。采用總RNA抽提試劑(Trizol)提取組織總RNA,用EasyScript First-strand cDNA synthesis SuperMix試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司提供)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，ABI PRISM 7300實(shí)時熒光定量PCR儀(Applied Biosystems, USA)進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)檢測骨骼肌CPT1 mRNA及CD36 mRNA的含量。PCR體系20 μl，Syber Green Ⅰ GoTAq?qPCR MAster Mix(PromegA, USA)10 μl，引物2 μl，cDNA 8 μl。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，然后95 ℃變性15 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s,進(jìn)行40個循環(huán)。數(shù)據(jù)處理采用7300 Systerm SDS Software 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。引物序列，GAPDH正義：TGAACGGGAAGCTCACTG，反義GCTTCACCACCTTCTTGATG；CPT1正義：CCAGGCAAAGAGACAGACTTG；反義GCCAAACC TTAGAGAAGCGAC；CD36正義：AATGAGACTGGGACCATCG；反義CTCCAACACCAAGTAAGACCAT。

1.2.6Western 印跡檢測骨骼肌組織CPT1、CD3650 mg骨骼肌組織放入冰水浴中1.5 ml EP管內(nèi)，每管加入0.5 ml裂解液〔100 mmol/L Tris-HCl, pH8.0, 1 mmol/L乙二醇乙二醚二胺四乙酸(EGTA),1 mmol/L乙二胺四乙酸 (EDTA),1 mmol/L苯甲基磺酰氯 (PMSF),1 mg/L亮抑酶肽,1 mg/L抑肽酶,50 mg/L胰蛋白酶〕，勻漿后分離上清,用考馬斯亮藍(lán)試劑盒進(jìn)行蛋白定量。取50 μg蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳,濕法電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上, 5%脫脂奶粉室溫封閉4 h后,分別加入CPT1 、CD36和GAPDH多克隆抗體(Santa Cruz, Europe提供), 4℃ 過夜,充分洗膜后加入HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h, 最后用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法 (ECL)檢測,膜與化學(xué)發(fā)光底物孵育,經(jīng) X膠片曝光顯影。用IMAGEJ軟件分析 ,以目的蛋白的灰度值除以內(nèi)參GADPH的灰度值以校正誤差 ,所得結(jié)果代表某樣品的目的蛋白相對含量。每組隨機(jī)選 6例樣本進(jìn)行蛋白表達(dá)分析 ,測定骨骼肌CPT1及CD36的蛋白表達(dá)量。

2結(jié)果

2.112 w后2組大鼠生化指標(biāo)比較高脂組血糖及胰島素水平較對照組明顯升高(P<0.01)，葡萄糖輸注率(GIR)明顯低于對照組(P<0.01)。見表1。

組別BG(mmol/L)INS(mU/L)GIR(mg·kg-1·min-1)對照組5.6±0.5285±3.229.8±2.3高脂組7.5±0.41)41.6±3.61)17.2±2.41)

與對照組比較：1)P<0.01；下表同

2.2骨骼肌組織脂質(zhì)沉積情況與對照組相比，大鼠骨骼肌組織中TG、DAG、CER及LCCoAs含量均明顯增加(P<0.01)。見表2。

組別TG(μmol/g)DAG(nmol/g)CER(nmol/g)LCCoAs(nmol/g)對照組9.5±0.8210.5±3066.2±11.22.1±0.3高脂組27.8±1.71)568.0±45.31)132.3±8.31)6.2±0.71)

2.3骨骼肌細(xì)胞線粒體形態(tài)改變與對照組相比高脂組骨骼肌細(xì)胞內(nèi)可見大量大小不等的脂滴分布，線粒體腫脹，內(nèi)外膜部分融合，線粒體嵴變少變短，部分或全部消失，甚至出現(xiàn)空泡化(圖1)。

A：對照組，B：高脂組，M：線粒體，L：脂滴 圖1　骨骼肌線粒體電鏡結(jié)果(×15 000)

2.4骨骼肌組織CPT1及CD36的表達(dá)高脂喂養(yǎng)8 w后與正常對照組(0.832±0.102、0.448±0.069)相比，高脂組骨骼肌組織中CD36(1.173±0.162，0.763±0.070)在mRNA，蛋白水平的表達(dá)均明顯升高(P<0.01)，CPT1在mRNA(對照組vs高脂組：1.002±0.120 vs 0.285±0.058)及蛋白(對照組vs高脂組：0.989±0.076 vs 0.569±0.069)水平的表達(dá)均明顯降低(P<0.05)。

3討論

高脂飲食喂養(yǎng)可以導(dǎo)致大鼠血糖及胰島素水平明顯升高，葡萄糖輸注率明顯下降，誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生胰島素抵抗。同時伴隨著骨骼肌組織線粒體形態(tài)的變化及骨骼肌組織中脂質(zhì)及其中間代謝產(chǎn)物的累積。而在脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝過程中的關(guān)鍵酶CD36的表達(dá)明顯升高，CPT1的表達(dá)明顯下降。

近年來，有學(xué)者提出2型糖尿病中糖代謝紊亂的根源為脂代謝的異常，脂毒性與胰島素抵抗有明確的相關(guān)性，以往研究認(rèn)為大量脂肪在肌肉、肝臟和β細(xì)胞等組織的積聚為2型糖尿病發(fā)病的重要因素。骨骼肌是機(jī)體利用葡萄糖的主要場所。在胰島素的刺激下，骨骼肌吸收了機(jī)體葡萄糖總攝取量的 75%以上。因此骨骼肌對葡萄糖的攝取、利用障礙是機(jī)體發(fā)生胰島素抵抗的重要發(fā)病機(jī)制。近期研究表明，活性的脂代謝中間產(chǎn)物如：LCCoAs、DAG、CER等的含量與肌細(xì)胞對胰島素的敏感性成負(fù)相關(guān)，是誘導(dǎo)骨骼肌 IR 的主要原因〔1〕。

胰島素刺激組織攝取利用葡萄糖是通過胰島素受體-胰島素受體底物1-磷脂酰激醇-3激酶-蛋白激酶(PK)B等一系列信號傳導(dǎo)過程完成的，最終使葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(GLUT)4轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜，大量GLUT4的膜轉(zhuǎn)移可加速葡萄糖攝入到細(xì)胞內(nèi)。胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中任一步驟的異常都可能最終阻礙骨骼肌轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖，從而引起IR〔6〕。LCCoAs是細(xì)胞內(nèi)脂肪酸存在的活性形式，它可轉(zhuǎn)化成DAG及神經(jīng)酰胺，DAG可以通過激活PKC抑制胰島素受體和胰島素受體底物酪氨酸激酶的活性進(jìn)而干擾胰島素信號傳導(dǎo)系統(tǒng)，導(dǎo)致IR形成〔7〕。而CER主要通過抑制胰島素受體底物-1信號傳導(dǎo)通路的下游PKB/AKT的磷酸化來發(fā)揮作用〔8〕。近期研究顯示，CER抑制劑或者催化CER代謝為葡萄糖神經(jīng)酰胺的物質(zhì)能夠改善IR〔9〕。對Zucker糖尿病肥胖大鼠進(jìn)行二甲雙胍和運(yùn)動鍛煉的干預(yù)時發(fā)現(xiàn)，胰島素敏感性改善的同時伴隨著肌肉組織中DAG和CER含量的減少〔3〕。

脂肪酸的攝入超出其氧化能力通常被認(rèn)為是骨骼肌內(nèi)脂肪堆積的主要原因。高脂飲食喂養(yǎng)可以導(dǎo)致大鼠血液中脂肪酸含量增加，短鏈及中鏈脂肪酸可直接通過被動轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞膜，長鏈脂肪酸(LCFA)的攝入需要膜上蛋白質(zhì)的介導(dǎo)。脂肪酸轉(zhuǎn)位酶CD36是促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞攝取長鏈脂肪酸的重要膜蛋白。長鏈脂肪酸在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚孕问絃CCoAs后在關(guān)鍵酶肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶(CPT)-1的作用下進(jìn)入線粒體最終被骨骼肌氧化利用。

而線粒體是三大營養(yǎng)物質(zhì)代謝的最終場所，線粒體功能的損害被認(rèn)為是胰島素抵抗發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵因子。除了功能的改變外，線粒體形態(tài)在胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下也發(fā)生了改變。人類 2型糖尿病患者或者肥胖個體骨骼肌線粒體體型較小 ,而且呈現(xiàn)較大空泡〔10〕。WBN /Kob糖尿病大鼠表現(xiàn)為線粒體腫脹、線粒體嵴空化〔11〕。

在本次研究中，我們觀察到高脂喂養(yǎng)12 w后，MFN2表達(dá)量明顯下降的同時伴隨著CPT1表達(dá)的下降，從而造成已轉(zhuǎn)移進(jìn)入骨骼肌細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)及其中間代謝產(chǎn)物不能被進(jìn)一步轉(zhuǎn)移進(jìn)入線粒體進(jìn)行β氧化，進(jìn)而積聚在胞液中，損害了胰島素信號通路的一個或多個環(huán)節(jié)，干擾了葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)，造成血糖升高，胰島素抵抗。同時我們發(fā)現(xiàn)高脂飲食誘導(dǎo)大鼠發(fā)生胰島素抵抗的同時伴隨著線粒體超微結(jié)構(gòu)的損傷，線粒體形態(tài)的變化與功能的改變密切相關(guān)。線粒體的損傷會進(jìn)一步加重骨骼肌組織脂質(zhì)代謝的紊亂，脂質(zhì)及其中間代謝產(chǎn)物在骨骼肌組織中堆積又加重胰島素抵抗，形成惡性循環(huán)。

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〔2012-11-17修回〕

(編輯曲莉)