陳 菡

(安徽省食品藥品審評認(rèn)證中心，安徽合肥 230051)

硫軟膏為醫(yī)院常用的自配外用制劑，用于疥瘡、痤瘡、脂溢性皮炎、酒渣鼻、單純糠疹和慢性濕疹、神經(jīng)性皮炎、銀屑病、頭癬、體癬、手足癬。硫軟膏在中國藥典、美國藥典、英國藥典、歐洲藥典里均尚未給出具體的微生物檢查方法，但是由于硫軟膏用于皮膚上，其帶有的微生物可以通過受損的皮膚進(jìn)行感染，故要求微生物控制在一定的范圍內(nèi)［1－3］。本文按照2010年版的《中國藥典》附錄提供的方法，對10%硫軟膏進(jìn)行微生物限度檢查進(jìn)行方法驗證，以尋求最佳的檢查方法，為制劑的質(zhì)量提供依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 藥品和培養(yǎng)基 硫軟膏(10%)(合肥市皮膚病防治研究所，批號:111012)溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基(批號:100128)、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基(批號:0909152)、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(批號:101122)、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 (批號:101126)、膽鹽乳糖培養(yǎng)基(批號:110406)、改良馬丁培養(yǎng)基(批號:1103232)、pH7.0氯化鈉—蛋白胨緩沖液(批號:1007072)、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基(批號:101027)、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基(批號:100129)。以上培養(yǎng)基均購自中國藥品生物制品檢定所。

1.2 菌株 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(CMCC(B)26 003)、大腸埃希菌(Escherichia coli)(CMCC(B)44 102)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)(CMCC(B)10 104)、黑曲霉(Aspergillus niger)(CMCC(F)98 003)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)(CMCC(B)63 501)、白色念珠菌(Candida albicans)(CMCC(F)98 001)的二代凍存管購自合肥市藥品檢驗所。

1.3 儀器 PYX-DHS-40×50型隔水式電熱恒溫細(xì)菌培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)、ML160型霉菌培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)、立式滅菌器(上海申安醫(yī)療器械產(chǎn))。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液的制備

2.1.1 金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌 接種新鮮培養(yǎng)物于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)18～24 h，用0.9%無菌氯化鈉溶液制成50 ～100 cfu·mL－1菌懸液。

2.1.2 白色念珠菌 接種新鮮培養(yǎng)物于改良馬丁培養(yǎng)基中培養(yǎng)24～48 h，用0.9%無菌氯化鈉溶液制成50 ～100 cfu·mL－1菌懸液。

2.1.3 黑曲霉 接種新鮮培養(yǎng)物于改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)5～7 d，向其中加入含0.05%吐溫80的0.9%無菌氯化鈉溶液3～5 mL，將孢子洗脫，吸取孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用含0.05%(mL·mL－1)吐溫80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成每50 ～100 cfu·mL－1孢子懸液。

2.2 供試液的制備 將供試品10 g加入含20 mL無菌十四烷酸異丙酯(由國藥集團化學(xué)試劑有限公司提供，批號:F20110325)和無菌玻璃珠容器中，充分振搖溶解，加入100 mL的45℃的pH7.0無菌氯化鈉—蛋白胨緩沖液，振搖5～10 min，萃取，水層作為1∶10供試液。

2.3 細(xì)菌、霉菌和酵母菌計數(shù)方法驗證 確定檢查方法后，進(jìn)行至少3次獨立的平行驗證試驗，計算各試驗菌每次試驗的回收率。

試驗組:分別取 1、0.5、0.2、0.1 mL 的 1∶10 供試液，與1 mL試驗菌液注入同一平皿中，注入相應(yīng)的瓊脂培養(yǎng)基，待凝，倒置培養(yǎng)，每株試驗菌平行制備2個平皿，按平皿法測定其菌數(shù)。

菌液組:取試驗菌液1 mL注入平皿中，注入相應(yīng)瓊脂培養(yǎng)，待凝，倒置培養(yǎng)，每株試驗菌平行制備2個平皿，測定所加的試驗菌數(shù)。

對照組:分別取 1、0.5、0.2、0.1 mL 的 1∶10 供試液，根據(jù)試驗組方法，在不加菌液的條件下測定樣品本底菌。計算各試驗菌株的回收率。

計算方法如下:

對照組回收率=對照組平均菌落數(shù)/菌液組平均菌落數(shù)×100%

試驗組回收率=(試驗組平均菌落數(shù)－對照組平均菌落數(shù))/菌液組平均菌落數(shù)×100%

結(jié)果判定:對照組的菌回收率應(yīng)大于或等于70%。當(dāng)試驗組均不低于70%時，供試品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌數(shù)可根據(jù)供試液制備方法和菌落計數(shù)法測定;否則，應(yīng)建立新的方法，進(jìn)行重新驗證。本實驗結(jié)果見表1。

表1 第一次實驗試驗結(jié)果/CFU·mL－1

通過表1可以看出，利用常規(guī)法(每皿1 mL)所得的回收率結(jié)果都大于70%。但是枯草芽孢菌的回收率明顯比其他的菌株低，說明供試液對枯草芽孢菌還有一定的殺菌作用。另外可以看出的是采用每皿0.2 mL以及每皿0.1 mL的稀釋方式所得的回收率比較高，說明采用培養(yǎng)基稀釋法對回收率的影響不大，藥品制劑中的抑菌成分能得到很好的控制，使其產(chǎn)生很少或者不產(chǎn)生抑菌作用。

2.4 控制菌檢查方法的驗證

2.4.1 菌種選擇 由于10%硫軟膏為局部的給藥制劑，所以要進(jìn)行控制菌金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的檢查。

2.4.2 金黃色葡萄球菌檢查方法的驗證 試驗組取10 mL的1∶10供試液和1 mL金黃色葡萄球菌菌液加入100、200及500 mL的營養(yǎng)肉湯增菌培養(yǎng)基中，按金黃色葡萄球菌的檢查法中國藥典(二部)(附錄A)進(jìn)行檢查。結(jié)果見表2。

2.4.3 銅綠假單胞菌檢查法的驗證 試驗組取1∶10供試液10 mL及1 mL銅綠假單胞菌菌液加入100 mL的膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)基中，按銅綠假單胞菌的檢查法進(jìn)行檢查中國藥典(二部)(附錄B)。結(jié)果見表2。

表2 控制菌驗證結(jié)果

從表2看出，培養(yǎng)基中均有菌落形成，為了進(jìn)一步確認(rèn)所生成的菌落為金黃色葡萄球菌以及銅綠假單胞菌，對其進(jìn)行確證實驗，方法如下。

取上述加入了銅綠假單胞菌的供試液劃線接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)18～24 h;取加入了金黃色葡萄球菌的供試液劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)24～72 h。其所得結(jié)果如表3。

根據(jù)《中國藥典》2010年版二部的結(jié)果比較，菌落形態(tài)與其所對應(yīng)的菌種的菌落特征對應(yīng)，根據(jù)表2，可以確定試驗組均能檢出金黃色葡萄球菌或者銅綠假單胞菌，運用常規(guī)法即可消除對這兩控制菌的抑菌作用，對于菌落的生成影響不大，方法成立。運用常規(guī)法即可應(yīng)用于控制菌的檢查。

表3 平板菌落形成形態(tài)

3 重復(fù)試驗

3.1 細(xì)菌、霉菌及酵母菌計數(shù) 采用平行操作，檢查兩批不同藥品進(jìn)行驗證。操作方法與第一次驗證試驗相同，所得的結(jié)果如表4與表5。

從第二次與第三次的重復(fù)試驗可以看出，采用2010年版的方法制備的供試液對于其中的抑菌活性出去比較徹底，菌的回收率都比較高，都能達(dá)到70%以上。故采用常規(guī)法即可進(jìn)行該制劑微生物限度檢查。

3.2 控制菌檢查方法的重復(fù)試驗 根據(jù)第一次試驗的方法進(jìn)行重復(fù)試驗，由于第一次試驗得到的三種培養(yǎng)基稀釋法結(jié)論為方法成立，故后兩次試驗可以不用對采用500 mL的培養(yǎng)基稀釋方法進(jìn)行驗證，只要確保200 mL的培養(yǎng)基稀釋法方法成立即可。兩次試驗得到結(jié)果證實采用常規(guī)法即可進(jìn)行控制菌檢查，方法成立。綜合三次試驗的結(jié)果，可以得到結(jié)論:采用常規(guī)法進(jìn)行控制菌的檢查方法成立，該方法簡單，易于進(jìn)行，適用范圍廣，為10%硫軟膏的控制菌檢查提供了一個可參考的簡單方法。對于醫(yī)院制劑來說，常規(guī)法能夠降低檢查的復(fù)雜度，更方便于醫(yī)院自制制劑的檢查。用此方法能夠降低檢查費用與檢查的時間，提高檢查的效率。

4 討論

由于在加入供試液后再加入試驗菌的菌懸液時未注入培養(yǎng)基，菌懸液與高濃度供試液可能未完全混合，會影響菌懸液中活菌［4］，因此培養(yǎng)基要盡快注入。

10%硫軟膏具有抑菌作用，試驗中除去其抑菌作用是關(guān)鍵。因其本身具有抑菌作用，對菌群造成損傷，容易會給結(jié)果帶來假陰性［5］，造成菌回收率的下降。在試驗中可采取培養(yǎng)基稀釋法進(jìn)行驗證，如果方法不成立，應(yīng)該尋求其他的方法如離心法和薄膜過濾法對抑菌物的除去，這樣才能得到更加準(zhǔn)確、可靠的結(jié)果。

10%硫軟膏為難溶于水的固體制劑，在制備其供試液時，加入了十四烷酸異丙酯，故必須設(shè)置稀釋劑對照組來評價供試液制備方法對微生物的影響程度［6］。

表4 第二次微生物檢查試驗方法結(jié)果

表5 第三次微生物檢查試驗方法結(jié)果

［1］國 明，祝清芬，鄭力真.無菌、微生物限度及細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法學(xué)驗證中常見問題及分析［J］.中國藥品標(biāo)準(zhǔn)，2008，9(1):46－49.

［2］國家藥典委員會.中國藥典(二部)［S］.北京:中國醫(yī)藥科技版社，2010:附錄 XIJ.

［3］呂會成.藥品生物測定的發(fā)展趨勢［J］.中華現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)雜志，2006，15(4):1360 －1362.

［4］潘 強.六種藥微生物限度檢驗方法驗證［J］.中國藥品標(biāo)準(zhǔn)，2010，47(1):44 －47.

［5］馬緒榮，蘇德模.藥品微生物學(xué)檢驗手冊［M］.北京:科學(xué)出版社，2001:55.