劉俊勇(綜述)，彭　芳(審校)

(大理學院藥學與化學學院，云南 大理 671000)

?

多藥耐藥性腫瘤動物模型的評價

劉俊勇△(綜述)，彭芳※(審校)

(大理學院藥學與化學學院，云南 大理 671000)

摘要：多藥耐藥性(MDR)腫瘤動物模型是攻克腫瘤耐藥性的基礎，同時在逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥性的藥物篩選研究中也起重要作用，因此，優(yōu)越的MDR腫瘤動物模型在科學研究中具有很高的應用價值。目前，MDR腫瘤動物模型主要通過移植、誘導和體內(nèi)外聯(lián)合誘導3種方法構(gòu)建。該文通過對MDR腫瘤動物模型資料進行歸納和總結(jié)，對這3種方法進行了詳細的表述和評價，并對MDR腫瘤動物模型的評價方法進行了簡要的敘述。

關鍵詞：腫瘤；耐藥；動物模型；移植型；誘導型；評價方法

多藥耐藥性(multiple drug resistance，MDR) 最早是由Biedler和Riehm[1]提出，其是指在惡性腫瘤的治療過程中，由于腫瘤復發(fā)，再次使用曾經(jīng)使用過的有效的抗癌藥物或改用其他從未使用過的抗癌藥物而變得無治療作用的現(xiàn)象[2-3]?；熕幬锬退幍拇_切性質(zhì)和潛在作用是否與參與運輸?shù)目拱┧幬锟剐曰蛴嘘P尚不清楚[4]。MDR的出現(xiàn)與化療藥物在腫瘤細胞內(nèi)的濃度達不到有效作用濃度有關，藥物的外排可能是耐藥產(chǎn)生的一個重要原因[5]。膜轉(zhuǎn)運蛋白ABC (adenosine triphosphate-binding cassette)家族的過度表達與腫瘤耐藥性的形成也密切相關。與MDR有關的ABC家族成員有48個，其中P-糖蛋白、多藥耐藥相關蛋白家族 (MDR-related protein，MRPs)以及乳腺癌耐藥相關蛋白 (breast cancer resistance-related protein，BCRP)最為重要。另外，一些膜轉(zhuǎn)運蛋白也與腫瘤MDR的產(chǎn)生相關[6]。

MDR腫瘤動物模型的建立對腫瘤MDR的基礎研究、藥物評價以及MDR逆轉(zhuǎn)研究等起重要作用?，F(xiàn)對現(xiàn)階段MDR腫瘤動物模型的建立方法及其特點進行評價，旨為建立優(yōu)越的MDR腫瘤動物模型、提高模型建立成功率及逆轉(zhuǎn)腫瘤MDR等提供參考。

1常用的MDR腫瘤動物模型

移植型和誘導型是建立MDR腫瘤動物模型的兩種常規(guī)方法[7-8]，由于這兩種方法建立的模型又存在各自的缺點，因此研究人員又通過體內(nèi)聯(lián)合體外誘導建立了一種新的方法[9]。

1.1移植型MDR腫瘤動物模型移植型又分為細胞株移植型和組織原位移植型。

1.1.1細胞株移植型MDR腫瘤動物模型是把現(xiàn)有的腫瘤耐藥細胞或在體外誘導產(chǎn)生的腫瘤耐藥細胞接種到裸鼠皮下，在腫瘤形成后對模型進行評價指標的檢測[10]。細胞株移植建立的動物模型具有操作簡單，創(chuàng)傷小，耐藥穩(wěn)定，易于重復，腫瘤表淺易于觀察，宿主生長情況一致，個體差異小等優(yōu)點。該方法也可在同種或同品系動物間連續(xù)移植，實驗周期較短，經(jīng)過多年研究，成瘤率較早期有所提高。雖然細胞株移植建立的動物模型有諸多優(yōu)點，但有研究發(fā)現(xiàn)，用于移植的耐藥細胞耐藥指數(shù)越高，在動物上的致瘤率越低[11]。因此，應用該方法建立高耐藥指數(shù)的動物模型仍需進一步研究。同時，部分移植瘤在動物體內(nèi)出現(xiàn)腫瘤生長速度過快、增殖比率高、體積倍增時間短等與人體腫瘤顯著不同的現(xiàn)象，因此其在模擬人體環(huán)境方面仍需進一步研究。

1.1.2組織原位移植型MDR腫瘤動物模型是在動物體內(nèi)原位植入組織學完整的原發(fā)性多藥耐藥人腫瘤組織，從而建立MDR腫瘤動物模型，然后再對模型的各項指標進行檢測[12]。該方法以腫瘤組織為材料，建立的動物模型保留了瘤源組織的MDR和病理生理特點，其不僅能從細胞水平反映出真實的MDR范圍和程度，而且能從組織層面反映耐藥腫瘤細胞間、耐藥腫瘤細胞與基質(zhì)細胞間的相互作用對MDR的影響，最重要的是該方法突破了細胞移植型模型缺乏內(nèi)環(huán)境的問題，這使患者的腫瘤在活體上再現(xiàn)成為可能，并可根據(jù)模型的反應指導患者化療。但該方法操作復雜，對動物創(chuàng)傷較大，腫瘤生長不便于觀察，因而在現(xiàn)實中的應用受到限制。劉艷紅等[13]采用在兔皮下接種和肝原位移植VX2腫瘤組織塊兩種方法建立模型，結(jié)果顯示兩種方法建立的動物模型的耐藥性無明顯差異。因此，該方法已較少應用于實驗研究中。

1.2誘導型MDR腫瘤動物模型不同的誘導劑、不同的誘導劑劑量、不同的誘導方式以及不同動物所建立的模型也存在明顯區(qū)別。

1.2.1阿霉素誘導的MDR腫瘤裸鼠模型其是模仿腫瘤MDR在體內(nèi)的形成過程，通過給予不同劑量(或不同給藥方式)的阿霉素而建立的腫瘤MDR裸鼠模型，同樣運用與移植法相同的耐藥性檢測方法和耐藥標志物進行檢測。阿霉素是最常用的MDR誘導劑，不同給藥劑量或給藥方式可以產(chǎn)生不同的耐藥動物模型。持續(xù)小劑量給藥建立的繼發(fā)性MDR腫瘤裸鼠模型成瘤時間短，成瘤率高，腫瘤生長好，有近似人體的MDR形成過程和生物學特性[14]。通過間歇腹腔注射阿霉素誘導建立的MDR腫瘤裸鼠模型能保證裸鼠長時間生存，其可在較短時間內(nèi)誘導出耐藥性，誘導簡潔，也能很好地模擬人腫瘤MDR的形成過程[15]。

1.2.2阿霉素誘導S180荷瘤小鼠該方法是反復應用低劑量阿霉素對S180荷瘤小鼠進行皮下注射，誘導模型建立后可應用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽[3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT]法、流式細胞術(shù)、聚合酶鏈反應等方法進行耐藥性和耐藥標志物的檢測[16]。該方法克服了以往應用化療方案進行誘導時，S180荷瘤小鼠死亡率高及模型一致性低的缺點，但該方法建立的模型耐藥倍數(shù)相對較低，因此不適合建立高耐藥性模型。

1.2.3紫杉醇誘導的MDR腫瘤裸鼠模型給敏感性荷瘤裸鼠腹腔注射一定劑量的紫杉醇，24 h后取出瘤塊傳代于子代裸鼠，重復給藥誘導與傳代，P-糖蛋白蛋白的表達確定耐藥性的形成[17]。該方法雖然能成功建立腫瘤耐藥動物模型，但操作較為復雜且要求嚴格。因此，無具體要求一般不應用該方法建立模型。

1.2.4聯(lián)合化療PFC (紫杉醇+氟尿嘧啶+順鉑) 方案誘導的S180腹水型小鼠該方法是應用化療PFC方案誘導建立S180腹水型小鼠，經(jīng)過一系列培養(yǎng)傳代，采用免疫組織化學法和流式細胞術(shù)測定其耐藥性和耐藥標志物[18]。該方法符合人體耐藥產(chǎn)生的機制，實驗也相對簡單，但由于多種藥物共同作用，相對來說影響因素較多，不易獲取相對一致的結(jié)果，但可針對現(xiàn)存化療方案耐藥性的產(chǎn)生機制進行研究。

1.2.5聯(lián)合化療誘導615荷瘤小鼠應用5-氟尿嘧啶和阿霉素誘導615荷瘤小鼠，采用MTT法分析耐藥敏感性及耐藥指數(shù)，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應檢測耐藥基因，流式細胞術(shù)檢測耐藥蛋白外排功能[19]。與其他方法相比，615小鼠成瘤率高，存活時間長，可達到3個月，便于成模后進行更長時間的操作，對于一些需要長時間給藥的實驗來說是較為理想的模型。

1.3體內(nèi)外聯(lián)合誘導型MDR腫瘤裸鼠模型體內(nèi)外誘導聯(lián)合型MDR腫瘤裸鼠模型是將耐藥腫瘤細胞接種到裸鼠皮下，成瘤后再進行藥物誘導耐藥建立MDR腫瘤動物模型，運用MTT法檢測耐藥指數(shù)，免疫組織化學檢測多藥耐藥蛋白的變化[20]。該方法是現(xiàn)階段較為可靠的MDR腫瘤動物模型的建立方法，這種方法既克服了移植方法建立的動物模型的耐藥性丟失，也克服了誘導方法的誘導時間長、操作復雜等缺點，同時該模型穩(wěn)定性及重復性強，可廣泛用于各種需要耐藥模型的實驗中。

總體來說，細胞移植型模型簡單易行，實驗周期短，可進行不同程度的耐藥細胞株的同時移植，但其耐藥性不穩(wěn)定，易丟失，且缺乏內(nèi)環(huán)境；組織原位移植操作難度大，對動物的創(chuàng)傷大，同樣也存在耐藥性不穩(wěn)定等缺點；誘導型模型雖然是能客觀反映人體產(chǎn)生耐藥的過程，且更符合人體內(nèi)形成MDR的機制和生物學特征，但是該方法較為費時費力，且受荷瘤動物生存時間的限制；體內(nèi)外聯(lián)合誘導型動物模型綜合了移植型和誘導型的優(yōu)點，又克服了以上兩種模型的不足，是較為理想的腫瘤模型，但關于該模型研究的信息還很少，是否存在不足還需要進一步研究。

2MDR腫瘤動物模型的評價方法

動物模型需要進行有效性評定，由評定結(jié)果確定模型建立是否成功[21]。檢測動物模型耐藥性的具體指標如下。

2.1腫瘤生長狀態(tài)記錄腫瘤出現(xiàn)時間，同時在出瘤后每隔4 d用游標卡尺測量腫瘤的長徑(A)和短徑(B)，通過公式V=4/3π×A×B2計算腫瘤體積，并繪制生長曲線。通過比較耐藥組動物模型與對照組動物模型的腫瘤生長狀況，明確腫瘤生長與耐藥性的誘導是否存在顯著差異[22]。同時，成瘤率也是MDR腫瘤動物模型的一個重要指標，其能充分反映模型建立的可行性。

2.2模型動物的生長狀況建立的MDR腫瘤動物模型要確保動物在造模后存活時間足夠長，生長狀況良好，無飲水及進食不正常等情況出現(xiàn)，以便對成模后的動物進行進一步研究[23]。

2.3耐藥倍數(shù)檢測使用某種化療藥物建立的腫瘤MDR模型一般需要選用同種、同類別甚至是不同類別的其他化療藥物檢測其敏感性，以衡量耐藥性。而耐藥性一般用耐藥倍數(shù)表示，常采用MTT法、磺酰羅丹明B比色法和Patterson細胞群體倍增時間法進行檢測，還可通過顯微鏡觀察細胞的形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)、活細胞染色技術(shù)繪制生長曲線計算細胞倍增時間來表示耐藥倍數(shù)[24-26]。

2.4耐藥標志物的檢測多藥耐藥蛋白和惡性功能標志分子是常用的耐藥標志物。多藥耐藥模型一般都存在耐藥標志物的過表達現(xiàn)象?，F(xiàn)階段最常用的耐藥標志物有耐藥蛋白P-糖蛋白、BCRP、多藥耐藥相關蛋白1(multidrug resistance associated protein 1，MRP1)等。主要的檢測方法有熒光法檢測蛋白底物外排的累積，聚合酶鏈反應或逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應法檢測耐藥基因的表達，流式細胞術(shù)和蛋白質(zhì)印跡法檢測蛋白的表達[27-29]。

2.5耐藥機制的檢測常用的耐藥機制檢測包括P-糖蛋白上調(diào)機制、細胞因子異常、凋亡通路失敏、周期調(diào)控紊亂等，它們在耐藥腫瘤與敏感腫瘤中的表達或功能存在明顯的差異，其中P-糖蛋白上調(diào)機制是最常用的耐藥機制檢測[30]。此外，隨著科技的發(fā)展，一些新技術(shù)也開始用于耐藥機制的研究。唐三元[31]采用電泳和質(zhì)譜進行蛋白質(zhì)組學鑒定發(fā)現(xiàn)，耐藥鼻咽癌細胞與其親本細胞的表達譜存在顯著不同；腫瘤干細胞也已被證實與腫瘤的耐藥性密切相關[32]。

3MDR腫瘤動物模型的展望

臨床上，腫瘤化療產(chǎn)生的MDR問題仍然突出，國內(nèi)外學者也越來越重視解決腫瘤MDR的問題[33]。MDR的逆轉(zhuǎn)在臨床上具有重要價值，目前對于此方面的研究也取得了較為豐碩的成果[34]，但常常由于其不良反應或操作問題而難以應用于臨床，這些問題仍然需要在良好的MDR腫瘤動物模型的基礎上進行研究。

4結(jié)語

現(xiàn)階段，腫瘤MDR的體外模型研究較多，但體外模型缺少內(nèi)環(huán)境作基礎，說服力不強，而動物模型能充分反映耐藥性形成的復雜機制。由于形成MDR的因素較多，而各種因素又不是獨立存在的，往往相互關聯(lián)，共同促使MDR的產(chǎn)生和維持[35-36]，因此，通過單一因素建立的MDR腫瘤模型很難模擬出真實的MDR，此外，動物模型要在提高成瘤率、縮短建模時間、控制耐藥程度以及耐藥穩(wěn)定性等方面尋找突破，以優(yōu)化動物模型。優(yōu)越的MDR腫瘤動物模型，不僅在腫瘤耐藥性形成機制方面有重要作用，在逆轉(zhuǎn)MDR的研究以及藥物評價方面也具有非常重要的價值。

參考文獻

[1]Bedler JL,Riehm H.Cellular resistance to actinomycin D in Chinese hamster cells in vitro:cross-resistance,radioautographic,and cytogenetic studies[J].Cancer Research,1970,30(4):1174-

1184.

[2]Baguley BC.Multiple drug resistance mechanisms in cancer[J].Mol Biotechnol,2010,46(3):308-316.

[3]Moitra K,Lou H,Dean M.Multidrug efflux pumps and cancer stem cells:insights into multidrug resistance and therapeutic development[J].Clin Pharmacol Ther,2011,89(14):491-502.

[4]Wind NS,Holen I.Multidrug resistance in breast cancer:from in vitro models to clinical studies[J].Int J Breast Cancer,2011,2011:967419.

[5]劉嘉.腫瘤多藥耐藥機制及其逆轉(zhuǎn)方案的研究進展[J].中國腫瘤外科雜志,2010,2(3):174-178.

[6]Shukla S,Ohnuma S,Ambudkar SV.Improving cancer chemothe-rapy with modulators of ABC drug transporters[J].Curr drug targets,2011,12(5):621.

[7]郝淑蘭,劉麗坤,王晞星,等.人胃癌SGC7901/VCR裸鼠移植瘤模型的建立及耐藥性檢測[J].世界中西醫(yī)結(jié)合雜志,2013,8(4):358-360.

[8]葛文剛,張長和,孫倍成.裸鼠人肝癌移植瘤耐藥模型的建立[J].江蘇醫(yī)藥,2010,36(24):2939-2942.

[9]李長龍,柯賢福,郭紅剛，等.長春新堿誘導建立人結(jié)腸癌多藥耐受性小鼠模型及MDR1和MRP1基因表達[J].中國實驗動物學報,2012,20(4):56-61.

[10]陶黎陽,黎漸英.肺癌A549耐藥裸鼠移植瘤模型的建立[J].中國醫(yī)藥指南,2011,9(7):5.

[11]沙慧芳,孫強玲,楊曉華.耐紫杉醇肺癌細胞BNX動物模型的建立[J].第二軍醫(yī)大學學報,2011,32(12):1296-1299.

[12]郜永順,陳孝平,李開艷,等.人肝癌組織多藥耐藥特性裸鼠模型的建立[J].中華實驗外科雜志,2005,22(4):492-493.

[13]劉艷紅,潘錦瑤,楊齊華,等.兔肝VX2腫瘤模型的建立及生物學特征[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志,2008,17(7):981-986.

[14]曹淵,惠璐璐,秦蓉,等.白血病多藥耐藥裸鼠荷瘤模型的建立[J].西安交通大學學報:醫(yī)學版,2013,34(3):302-307.

[15]熊茂明,區(qū)慶嘉,王捷,等.裸鼠人肝癌原位移植多藥耐藥模型的建立及其耐藥機制的探討[J].中華實驗外科雜志,2001,18(2):120-122.

[16]盛秀勝,何忠平.耐多柔比星S180荷瘤小鼠模型的建立[J].中國現(xiàn)代應用藥學,2010,27(9):764-766.

[17]周晴.紫杉醇耐藥的人胃腺癌BGC-823/TA細胞株及BGC-823/Paclitaxel裸鼠異種移植瘤模型的建立及耐藥機制的探討[D].北京:中國醫(yī)學科學院,2012.

[18]徐龍進,王祖梅,孫付軍,等.聯(lián)合化療誘導小鼠在體腫瘤多藥耐藥模型的建立[J].實驗動物與比較醫(yī)學,2005,25(4):215-217.

[19]桂琳玲,金先慶,羅慶,等.小鼠CT26結(jié)腸癌耐藥動物模型的建立[J].重慶醫(yī)科大學學報,2010,35(8):1224-1227.

[20]徐小方,劉斌,吳軍正,等.人黏液表皮樣癌裸鼠耐藥移植瘤模型的建立及其生物學特性[J].實用口腔醫(yī)學雜志,2010,26(2):177-180.

[21]張峰,岑娟.腫瘤多藥耐藥模型的建立與評價方法[J].藥物評價研究,2013,36(5):377-381.

[22]諶海燕,侯麗,陳信義.耐三苯氧胺乳腺癌異種移植瘤動物模型建立與評價[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學進展,2011,11(5):841-843.

[23]王萌,洪璇,孫欽文,等.人肺腺癌Anip973/NVB耐藥細胞系動物模型的建立及其耐藥機制的研究[J].中國肺癌雜志,2012,15(3):146-151.

[24]Shan JZ,Xuan YY,Ruan SQ,etal.Proliferation-inhibiting and apoptosis-inducing effects of ursolic acid and oleanolic acid on multi-drug resistance cancer cells in vitro[J].Chin J Integr Med,2011,17(8):607-611.

[25]Wu JY,Yu ZL,Fong WF,etal.Chemotherapeutic activities of Carthami Flos and its reversal effect on multidrug resistance in cancer cells[J].Afr J Tradit Complement Altern Med,2013,10(4):36-40.

[26]李文靜,張磊,賴婭娜,等.人乳腺癌多西紫杉醇耐藥細胞株的建立及特性[J].第三軍醫(yī)大學學報,2011,33(21):2297-

2299.

[27]Boyerinas B,Park SM,Murmann AE,etal.Let-7 modulates acquired resistance of ovarian cancer to Taxanes via IMP-1-mediated stabilization of multidrug resistance 1[J].Int J Cancer,2012,130(8):1787-1797.

[28]Dai Y,Xie CH,Neis JP,etal.MicroRNA expression profiles of head and neck squamous cell carcinoma with docetaxel-induced multidrug resistance[J].Head Neck,2011,33(6):786-791.

[29]Gillet JP,Gottesman MM.Advances in the molecular detection of ABC transporters involved in multidrug resistance in cancer[J].Curr Pharm Biotechnol,2011,12(4):686-692.

[30]浦龍健.腫瘤多藥耐藥機制及逆轉(zhuǎn)策略的研究進展[J].蚌埠醫(yī)學院學報,2014,39(3):409-412.

[31]唐三元.鼻咽癌順鉑耐藥細胞系的建立及耐藥蛋白質(zhì)組學研究[D].長沙:中南大學,2012.

[32]徐建梅,劉風玲,陳浩.Wnt信號通路與腫瘤多藥耐藥性的研

[33]隋華,李琦.JNK/SAPK信號轉(zhuǎn)導通路與多藥耐藥機制的研究[J].腫瘤防治研究,2010,37(7):844-847.

[34]吳麗娟,張海鳳.腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑的研究進展[J].黑龍江醫(yī)學,2013,37(10):913-915.

[35]岑娟,李運曼.多藥耐藥腫瘤的聯(lián)合用藥[J].國外醫(yī)藥：抗生素分冊,2009,30(5):224-228.

[36]Filipits M.Mechanisms of cancer:multidrug resistance[J].Drug Discovery Today:Disease Mechanisms,2004,1(2):229-234.

Evaluation of Tumor Multidrug Resistance Animal ModelsLIUJun-yong,PENGFang.(CollegeofPharmacyandChemistry,DaliUniversity,Dali671000,China)

Abstract:Multidrug resistant(MDR) tumor animal model is fundamental to overcome tumor resistance,which also plays a crucial role in the drug screening study about effectively reversing drug resistance in a variety of tumors,therefore,the value of superior MDR animal model is even more prominent in scientific research.So far,transplantation,induction and combination of in vitro and in vivo induction,are three methods to build the MDR tumor animal models.Here is to summarize the data about MDR tumor animal models,and the three methods are described and evaluated in detail,the evaluation method of MDR tumor animal models is briefly described as well.

Key words:Tumor; Resistance; Animal model; Transplantation; Induction; Evaluation method

收稿日期：2014-10-04修回日期：2015-03-15編輯：辛欣

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.21.022

中圖分類號：R752.11

文獻標識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)21-3905-04