崔 潔, 于世賓, 何惠明, 張春寶

(第四軍醫(yī)大學口腔醫(yī)學院 軍事口腔醫(yī)學國家重點實驗室：1.修復科; 2.顳下頜關(guān)節(jié)病科; 3. 修復工藝科, 陜西 西安710032)

一次法咬合重建對大鼠咬肌組織損傷相關(guān)蛋白表達的影響

崔 潔1, 于世賓2, 何惠明1, 張春寶3

(第四軍醫(yī)大學口腔醫(yī)學院 軍事口腔醫(yī)學國家重點實驗室：1.修復科; 2.顳下頜關(guān)節(jié)病科; 3. 修復工藝科, 陜西 西安710032)

目的: 探討一次法咬合重建后大鼠咬肌損傷相關(guān)結(jié)蛋白(desmin)和骨骼肌肌鈣蛋白抑制亞基(sTnI)含量的變化。方法：取8周齡健康雄性SD大鼠60只，隨機分為空白對照組(C組)、操作對照組(S組)和一次法咬合重建組(T組)(n=20)。T組采用人工逐次磨除法將各大鼠上頜后牙牙冠磨低約1.2 mm，6周后口外制作咬合板并將其粘固于各大鼠的上頜后牙上；S組麻醉后模擬T組操作過程，無實際操作；C組不作任何處理。咬合重建后3、7、14、28 d處死大鼠(n=5)，取其雙側(cè)咬肌組織并采用western blot方法檢測咬肌細胞內(nèi)desmin和sTnI的表達。結(jié)果：①S組與C組相比desmin、sTnI表達無明顯差異(P>0.05)；②T組于咬合重建后3 d時desmin、sTnI開始降低(P<0.05)，7 d時降至最低，14 d后逐漸增加，28 d時恢復正常；28 d時desmin、sTnI的表達水平與C組、S組相比P>0.05，其他各時間點的desmin、sTnI表達水平均低于C組和S組(P<0.05)。 結(jié)論：一次法咬合重建可造成咬肌細胞內(nèi)desmin和sTnI發(fā)生不同程度的降解，但這種變化是可逆的。

一次法咬合重建; 咬肌; 結(jié)蛋白(desmin); 骨骼肌肌鈣蛋白抑制亞基(sTnI)

[DOI] 10.15956/j.cnki.chin.j.conserv.dent.2015.01.004

[Chinese Journal of Conservative Dentistry,2015,25(1):20]

咬合垂直距離(occlusal vertical dimension，OVD)通常是指上下頜牙尖交錯位時面下1/3的高度，臨床上以鼻底到頦下點的距離來表示[1]。多種先天或后天的原因均可導致咬合垂直距離的降低，從而引起咀嚼肌和顳下頜關(guān)節(jié)的一系列改變，并進一步導致顳下頜關(guān)節(jié)紊亂綜合征；在臨床修復中，常采用咬合重建修復(升高咬合)的方法對其進行治療。目前臨床上升高咬合的方法有兩種：一種是漸進性緩慢地升高，以避免咬合突然升高而導致的口頜系統(tǒng)出現(xiàn)不適；另一種是在雙側(cè)咀嚼肌平衡，且患者無異常感的情況下進行一次性升高[2]。以往的研究多集中于患者逐漸適應的情況下緩慢地升高咬合[3-4]，而對于一次法咬合重建的研究尚未見相關(guān)報道。本課題組在前期研究中成功建立了一次法咬合重建的動物模型，并發(fā)現(xiàn)該模型動物的咬肌顯微、超微結(jié)構(gòu)，以及咬肌內(nèi)線粒體的Ca2+含量均發(fā)生了可逆性變化[5]。本實驗擬通過觀察一次法咬合重建后大鼠咬肌損傷相關(guān)蛋白結(jié)蛋白(desmin)和骨骼肌肌鈣蛋白抑制亞基(skeletal muscle troponin I, sTnI)的變化，進一步探討一次法咬合重建對咬肌組織的影響。

1 材料和方法

1.1 主要材料及儀器

SD大鼠[第四軍醫(yī)大學實驗動物中心提供，合格證號：SCXK-(軍)一2012-0007]；10 g/L戊巴比妥鈉注射液(西安國安生物科技有限公司)；硅橡膠印模材料、3M RelyX Unicem樹脂粘結(jié)劑(3M公司，美國)；可樂麗菲露自酸蝕粘結(jié)劑(上?？蓸符悋H貿(mào)易有限公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)； Desmin兔抗大鼠多克隆抗體、sTnI綿羊抗大鼠多克隆抗體(Abcam，英國)；SDS- PAGE凝膠配制試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司)；204+102L型微型技工打磨機(世新，韓國)；直徑為0.30 mm慢速球鉆(NTI，美國)；光學顯微鏡(Leica，德國)；火焰狀砂石(松風，日本)；CL- 628樹脂光固化燈(南昌普洋科技有限公司)；垂直電泳槽、電泳儀(Bio- Rad，美國)；scanner Q62型掃描儀(BenQ，德國)。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物選擇及分組

取頜面對稱，牙列完整的8周齡健康雄性SD大鼠60只, 體質(zhì)量(220±15)g，于我院動物實驗中心適應性飼養(yǎng)，室溫(20±3)℃，自由飲水和攝食1周后，將其隨機分為3組：空白對照組(C組)、操作對照組(S組)、實驗組(T組)(n=20)。另取1只10周齡雄性SD大鼠，斷頸處死后取出上頜骨，利用光固化成型片制作大鼠上頜個別托盤。

1.2.2 一次法咬合重建動物模型的建立

取實驗組大鼠按以下步驟建立一次法咬合重建動物模型：①取實驗組各大鼠，分別用 10 g/L 戊巴比妥鈉腹腔注射(0.40 mL/100 g)麻醉后，用個別托盤和硅橡膠以二次印模法制取各大鼠正常牙列的印模，超硬石膏灌注；②在外科手術(shù)顯微鏡下用慢速馬達(35 000 r/min)帶動直徑為0.3 mm的NTI球鉆分次磨低各大鼠的上頜后牙牙冠，使其高度降低約1.2 mm(每隔5 d磨除1次，每次磨除0.3 mm，共計4次)。同時磨低其下頜前牙以保證前后牙列咬合接觸[5]。咬合垂直距離降低完成后，再次用硅橡膠以二次印模法制取印模，超硬石膏灌注； ③用正常牙列石膏模型翻制印模，并灌注自凝塑料(稀糊期)，待其至面團期早期時，取對應的磨耗后石膏模型復位，作為大鼠的個別咬合板(厚度為1.2 mm)； ④根據(jù)本課題組前期實驗結(jié)果(待發(fā)表)(大鼠牙齒重度磨耗后其咀嚼肌改建活動在 42 d后趨于穩(wěn)定)，于大鼠咬合垂直距離降低后 42 d進行一次法咬合重建。實驗組各大鼠在10 g/L戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉下，干棉卷隔濕，分別在其上頜雙側(cè)磨牙咬合面涂粘結(jié)劑，光固化燈光照 20 s；分別取各大鼠的相應咬合板，并將牙托水滴于其粘結(jié)面使之溶脹，干燥后涂粘結(jié)劑并光照20 s；然后用3M RelyX Unicem樹脂粘結(jié)劑將咬合板粘固于相應大鼠的上頜磨牙上，確定咬合板就位且密合后，光照60 s；最后檢查各大鼠的咬合并去除咬合高點，使上下頜達到均勻廣泛地接觸。

操作對照組各大鼠按同樣方法麻醉后僅模擬實驗組的操作過程，不做實際處理；空白對照組不進行任何處理。各組大鼠均在相同環(huán)境下進行飼養(yǎng)。

1.2.3 取材和咬肌肌總蛋白提取

分別于一次法咬合重建后3、7、14、28 d各時間點，從每組中各隨機抽取5只大鼠，脫頸處死后取各大鼠的雙側(cè)咬肌組織并將其剪成細小的碎塊；然后按每20 mg肌肉組織用100 μL裂解液的比例加入裂解液，用手握式電動組織勻漿器對肌肉進行勻漿，直至肌細胞充分裂解。充分裂解后，14 000 r/min 離心10 min，取上清(即肌總蛋白)分裝于EP管中，用BCA蛋白定量試劑盒對提取的蛋白進行定量分析后，加入上樣緩沖液煮沸5 min，-20 ℃ 保存?zhèn)錂z。

1.2.4 western- blot檢測損傷相關(guān)蛋白的含量

取上述提取的各組咬肌肌總蛋白樣品，按以下步驟檢測desmin和sTnI蛋白的含量。①配膠：配制分離膠，待其凝固后再配置濃縮膠并注入玻璃板，同時插入梳子; ②上樣：將玻璃板放入電泳槽并加入電泳液，然后取各組肌總蛋白樣品上樣(10 μg); ③電泳：上層膠以80 V電泳25 min，下層膠以120 V電泳60 min; ④轉(zhuǎn)膜：按照膠的大小裁剪NC膜和濾紙，采用Bio- Rad系統(tǒng)進行轉(zhuǎn)膜; ⑤封閉：將NC膜做好標記后，放入封閉液中37 ℃恒溫孵育30 min; ⑥蛋白免疫印跡檢測：蒸餾水洗膜10 min后，分別滴加TBST溶液(1 ∶1 000的稀釋比)稀釋的兔抗Desmin抗體和綿羊抗sTnI抗體，并將其置于密封袋中4 °C過夜； TBST洗膜15 min×4次，滴加TBST稀釋的二抗，室溫孵育1 h；TBST洗膜15 min×4次后，分別進行化學發(fā)光、顯影、圖像采集; ⑦ 圖像分析：采用IPP軟件對條帶灰度進行計算。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 desmin在各組咬肌中的表達

S組與C組相比，desmin的表達量無統(tǒng)計學差異(P>0.05)； T組于咬合重建后3 d時desmin的表達量開始降低，7 d時達到最低，14 d時開始逐漸增加，至28 d時基本恢復到正常水平，其中除T組28 d時與C組和S組相比無統(tǒng)計學差異(P>0.05)外，3、7、14 d各時間點的desmin表達量均明顯低于C組和S組(P<0.05); T組各時間點的desmin表達量兩兩相比，除3 d與7 d相比無統(tǒng)計學差異(P>0.05)外，其他各時間點間差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖1～2)。

T1、T2、T3、 T4分別為實驗組3、7、14、28 d

T1、T2、T3、 T4分別為實驗組3、7、14、28 d

2.2 sTnI在各組咬肌中的表達

各組sTnI蛋白的表達量兩兩相比與desmin基本一致，即S組與C組相比無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；T組于咬合重建3 d時sTnI的表達量開始降低，7 d時降至最低，14 d時開始逐漸增加，至28 d時基本恢復到正常水平，其中除T組28 d時與C組和S組相比無統(tǒng)計學差異(P>0.05)外，3、7、14 d 各時間點的sTnI表達量均明顯低于C組和S組(P<0.05)(圖3～4)。

T1、T2、T3、 T4分別為實驗組3、7、14、28 d

T1、T2、T3、T4分別為實驗組3、7、14、28 d

3 討論

咬合重建是指用修復方法改造和重新建立牙列的咬合狀態(tài)，使之與顳下頜關(guān)節(jié)及咀嚼肌功能協(xié)調(diào)一致，從而消除因牙合異常而引起的口頜系統(tǒng)紊亂，并使口頜系統(tǒng)恢復正常的生理功能[6]。大部分學者認為，當垂直距離喪失較多時必須采取漸進法升高咬合，一般選用初始厚度為2 mm暫時性牙合墊，然后再根據(jù)復診時患者的舒適度逐漸增加高度，直至達到預期高度[7]；并認為，只有將垂直距離增高至適當范圍，才可減少咀嚼肌升頜肌群的張力，此范圍一般不超過息止頜位[8]。本課題組前期實驗表明，一次法咬合重建可使大鼠咬肌顯微、超微結(jié)構(gòu)及顳下頜關(guān)節(jié)發(fā)生適應性改建[9]。本實驗通過觀察一次法咬合重建后大鼠咬肌細胞中desmin和sTnI表達的變化，進一步探討一次法咬合重建對咬肌的影響。

desmin是骨骼肌、平滑肌和心肌中重要的細胞骨架蛋白，主要存在于Z帶和閏盤，并排列成相互交錯的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，且能通過該結(jié)構(gòu)將Z帶與細胞膜及細胞核相連接，從而使眾多的單個肌原纖維連接起來；其主要作用不僅能將所有肌原纖維的單個收縮運動機械地整合在一起形成牙合力[10]，同時還能限制肌節(jié)在肌肉收縮時被過分牽拉。除此之外，desmin還在肌肉形態(tài)的形成與維持、細胞之間的信息傳遞、肌細胞分化的調(diào)控等多個方面具有非常重要的意義[11]。大量研究表明，desmin丟失是骨骼肌運動性微損傷的一個敏感指標，desmin不僅在維持肌原纖維的完整性方面起重要作用，而且還與肌肉損傷后的修復或再生密切相關(guān)[12]。Friden 等[13]發(fā)現(xiàn)，運動可導致desmin斷裂，并認為細胞骨架蛋白的破壞是導致肌組織超微結(jié)構(gòu)變化的重要原因。Lieber等[14]報道，肌節(jié)的過度伸展能引起細胞內(nèi)局部鈣離子的濃度升高，并激活細胞內(nèi)的鈣激活蛋白酶，從而使desmin發(fā)生水解，進而導致肌節(jié)結(jié)構(gòu)紊亂。以往研究表明，一次法咬合重建可引起咬肌細胞超微結(jié)構(gòu)發(fā)生可逆性損傷，并使咬肌細胞內(nèi)Ca2+含量增加[5]。本結(jié)果顯示，與對照組相比，一次法咬合重建后第3天時其desmin的表達即開始明顯下降，第7天時達到最低，但隨后其表達逐漸增加，到28 d時恢復正常。以上結(jié)果說明，一次法咬合重建可使大鼠咬肌細胞的desmin發(fā)生降解，分析其原因可能為：咬合重建后咬肌肌纖維被動過度伸展，此時的被動張力可刺激敏感離子通道使鈣離子內(nèi)流，并使細胞內(nèi)局部鈣離子強度升高[15]；細胞內(nèi)升高的鈣離子又可激活蛋白酶(如calpain)，從而使desmin發(fā)生水解。

骨骼肌肌鈣蛋白(Skeletal Troponin，sTn)存在于心肌和骨骼肌中，由3種亞基組成，分別為：肌鈣蛋白C、肌鈣蛋白I和肌鈣蛋白T。TnI亞基為單一多肽鏈，是肌肉收縮的分子開關(guān)，可通過抑制細絲中肌動球蛋白的ATP酶活性而抑制肌球蛋白與肌動蛋白的結(jié)合，從而阻止肌肉的收縮[16]。有研究指出，sTnI可能是反映運動性骨骼肌損傷的一種特異性的早期敏感標志，但目前對運動性骨骼肌損傷后sTnI的早期升高機制還不是很清楚。本結(jié)果顯示，與對照組相比，一次法咬合重建后第3天時sTnI的表達明顯下降，第7天時達到最低，但隨后其表達逐漸增加，到28 d時恢復正常。說明一次法咬合重建可使大鼠咬肌細胞的sTnI發(fā)生降解。Sorichter等[17]曾發(fā)現(xiàn)了一個占骨骼肌肌纖維sTnI總量3%～4%的小型sTnI胞漿池。田吉明等[18]也指出，不習慣性運動引起的細胞內(nèi)鈣離子 — 鈣蛋白酶的激活機制導致的肌小結(jié)復合體的選擇性降解，以及骨骼肌內(nèi)存在的可溶性sTnI胞漿前體池共同導致了運動后血漿sTnI的早期迅速抬升。但有關(guān)一次法咬合重建后肌細胞內(nèi)sTnI逐漸增加的機制仍不清楚，有待于進一步深入研究。

綜上所述，一次法咬合重建后大鼠咬肌組織內(nèi)desmin和sTnI發(fā)生了降解，但隨著重建后咬合狀態(tài)的持續(xù)，損傷表現(xiàn)逐漸消失，desmin和sTnI含量恢復正常。提示，一次法咬合重建可導致大鼠咬肌損傷，但這種損傷是可逆的，隨著狀態(tài)持續(xù)時間的延長，咬肌可逐步適應新的咬合功能狀態(tài)，并恢復其正常功能。

[1]皮昕．口腔解剖生理學[M]．6版 ．北京：人民衛(wèi)生出版社，1979：83.

[2] 潘新華．低位咬合的修復[J]．國外醫(yī)學口腔醫(yī)學分冊，1995，22(3)：161.

[3]程永喜．56例牙合過度磨耗修復治療的分析[J]. 廣東牙病防治，1999，7(1)：66.

[4]溫映萍，邱偉平，江惠珍．升高咬合在臨床中的應用[J]. 廣東牙病防治，2001，9(2)：140-141.

[5]李甜，于世賓，何惠明，等．漸進性咬合垂直距離降低對大鼠咬肌微觀結(jié)構(gòu)及線粒體Ca2+含量的影響[J]. 牙體牙髓牙周病學雜志，2013，23(2)：95-99.

[6]馬軒祥．口腔修復學[M]．5版．北京：人民衛(wèi)生出版社，2003：464.

[7]高杰，唐旭炎，劉世明．金屬烤瓷牙治療牙合面重度磨耗30例療效分析[J]．蚌埠醫(yī)學院學報，2007，32(4)：419-420.

[8]Rivera- Morales WC，Mohl D．Relationship of occlusal vertical dimension to the health of the masticatory system[J]．JProsthetDent，1991，65(4)：547.[9]黨薇，于世賓，何惠明，等．不同開口度對大鼠咬肌及顳下頜關(guān)節(jié)的影響[J]．牙體牙髓牙周病學雜志，2013，23(2) ：100-103.

[10]白雪梅．大鼠心肌缺血再灌注后結(jié)蛋白的變化[J]．中國醫(yī)學創(chuàng)新，2013，10(26)：6-8.

[11]段立公，李國平，李肅反．.結(jié)蛋白和波形蛋白在運動性肌肉損傷和再生過程中表達及意義的實驗研究[J]．中國運動醫(yī)學雜志，2001，20(2)：167-170.

[12]Goebel HH，Bornemann Antje．Desmin pathology in neuromuscular disease[J].CellPathol，1993，64(3)：127-135.

[13]Friden J, Kjorell U, Thornell LE．Delayed muscle soreness and cytoskeletal alterations：an immunocytological study in man[J].IntSportsMed，1984，5(1)：15-18.

[14]Lieber RL，F(xiàn)riden J． Mechanisms of muscle injury after eccentric contraction[J].SciMedSport，1999，2(3)：253-265.

[15]Guharay F，Sachs F．Stretch- activated single ion channel currents in tissue- cultured embryonic chick skeletal muscle[J].PhysiolLond，1984，352：685-701.

[16]Mukhopadhyay S，Langsetmo K，Stafford WF，etal. Identification of a region of fast skeletal troponin T required for stabilization of the coiled- coil formation with troponin I[J]．TheJBiolChem，2005， 280(1)：538-547.

[17]Sorichter S，Mair J，Koller A，etal． Skeletal muscle troponin I release and magnetic resonance imaging signal intensity changes after eccentric exercise- induced skeletal muscle injurv[J]．ClinChimActa， 1997，262(1-2)：139-146.

[18]田吉明，丁樹哲．運動性骨骼肌損傷標志的研究進展[J]．浙江體育科學，2001，23(1)：52-54.

The effects of one- visit occlusal rehabilitation on the expression of injury- sensitive proteins in rat′s masseter muscle

CUI Jie*, YU Shi- bin, HE Hui- ming, ZHANG Chun- bao

(*DepartmentofProsthodontics,SchoolofStomatology,TheFourthMillitaryMedicalUniversity,Xi'an710032,China)

AIM: To investigate the effects of one- visit occlusal rehabilitation(OR) on the expression of desmin and skeletal troponin I (sTnI) in rat's masseter muscle. METHODS: 60 healthy 8- week- old male SD rats were randomly divided into control group (C), sham operation group (S) and one- visit OR group (T)(n=20). In T group, the crown height of the upper molars of the rats were shortened by 1.2 mm mechanically and gradually, 6 weeks later, the occlusal splints were made and adhered to the molar surface by resin bonding. In S group the sham operation was used, the controls were without any operation. 5 rats in every group were sacrificed at 3 d, 7 d, 14 d, and 28 d after operation respectively. The deep masseter muscles were excised, western blot method was used to detect the expression of desmin and sTnI. RESULTS: ① The expression of desmin and sTnI showed no significant difference between group C and S(P>0.05).② Desmin and sTnI in the masseter muscle in group T decreased 3 d after OR(P<0.05), decreased to the lowest level 7 d after OR(P<0.05), then began to increase gradually and reached the normal level 28 d after the OR(P>0.05). CONCLUSION: One- visit occlusal rehabilitation can cause the degradation of desmin and sTnI in masseter muscle. However, the damage is reversible.

one- visit occlusal rehabilitation; masseter muscle; desmin; skeletal troponin I

2014-07-29

全軍后勤科研計劃面上項目(CWS12J101)

崔潔(1989-)，女，漢族，山西省人。碩士生(導師：何惠明)

何惠明，E-mail: hhming@fmmu.edu.com

R780.2

A

1005-2593(2015)01-0020-05