崔 紅, 許 穎, 吳 清

(佳木斯大學(xué)附屬第二醫(yī)院, 黑龍江 佳木斯 154007)

五味子甲素對糞腸球菌毒力因子作用的初步研究

崔 紅, 許 穎, 吳 清

(佳木斯大學(xué)附屬第二醫(yī)院, 黑龍江 佳木斯 154007)

目的: 研究五味子甲素對糞腸球菌生物膜的抑菌效果及其對某些毒力因子表達(dá)的影響。方法： 體外建立糞腸球菌生物膜模型，分別與31.25、62.5、125、250、500 μg/mL五味子甲素、僅含菌液不含藥物的BHI培養(yǎng)基(陰性對照)、僅含BHI液體培養(yǎng)基的空白對照組共同培養(yǎng)12 h后，MTT法檢測各組抑菌效果；根據(jù)抑菌效果選取適宜藥物濃度(125、250、500 μg/mL)與糞腸球菌共同培養(yǎng)24 h后，RT- PCR法檢測各組糞腸球菌毒力因子srtC、esp、ebpR mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果：五味子甲素對糞腸球菌生物膜的抑菌作用隨藥物濃度的增加而升高(P<0.05)，其中以500 μg/mL組的抑菌效果最好； 125、250、500 μg/mL的五味子甲素均能明顯抑制srtC、esp、ebpR各毒力因子mRNA的表達(dá)，且其抑制程度均隨著藥物濃度的增加而增加(P<0.05)，當(dāng)藥物濃度為500 μg/mL時，可完全抑制srtC、ebpR mRNA的表達(dá)。結(jié)論：一定濃度的五味子甲素不僅能抑制生物膜狀態(tài)的糞腸球菌，同時還能抑制其毒力因子srtC、esp、ebpR的表達(dá)。

五味子甲素; 糞腸球菌; 生物膜; 毒力因子; RT- PCR

[DOI] 10.15956/j.cnki.chin.j.conserv.dent.2015.01.005

[Chinese Journal of Conservative Dentistry,2015,25(1): 24]

牙髓病和根尖周病是口腔常見的細(xì)菌感染性性疾病，其治療方法主要為根管治療術(shù)。近年來，隨著治療手法和儀器的不斷改進(jìn)，其成功率雖有顯著提高，但仍存在一定的失敗率。研究表明，糞腸球菌是導(dǎo)致根管治療失敗的最常見的細(xì)菌之一[1-2]，該菌對生存環(huán)境的要求較低，能在缺氧、饑餓等惡劣環(huán)境下長期存活并形成生物膜；形成生物膜后其耐藥性和治療難度均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于游離菌,很難用傳統(tǒng)的治療方法將其清除。因此，關(guān)于糞腸球菌導(dǎo)致根管治療失敗所起的作用受到越來越多的關(guān)注。加之目前臨床上常用的根管消毒藥物對根管內(nèi)糞腸球菌的清除效果不佳；甚至有些藥物還存在一定的毒副作用，或使糞腸球菌產(chǎn)生耐藥性，故多數(shù)學(xué)者將目光轉(zhuǎn)向毒副作用相對較小且不易產(chǎn)生耐藥性的中藥。本實驗旨在觀察五味子甲素對糞腸球菌生物膜的抑菌效果并探討其對糞腸球菌毒力因子srtC、esp、ebpR轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平的影響。

1 材料和方法

1.1 主要材料和儀器

糞腸球菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC(南京便診生物科技有限公司)；五味子甲素標(biāo)準(zhǔn)品(上海金穗生物科技有限公司，產(chǎn)品批號20140109，HPLC≥98%)；腦心浸液肉湯(BHI)、瓊脂培養(yǎng)基( 青島海博生物科技有限公司)；噻唑藍(lán)MTT、二甲基亞砜DMSO(廣州寶態(tài)克生物科技有限公司)；RNA 提取試劑、PCR反應(yīng)試劑和DNA Marker( 大連寶生物工程有限公司)；引物( 上海生工生物工程有限公司)；電子分析天平( 賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司)；激光共聚焦顯微鏡(Olympus,日本)；Biometra PCR儀(BIOME-TRA，德國)；TGL- 20M高速臺式冷凍離心機(jī)(長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；SMART SPECTMPLUS 超微量分光光度計(美國)；Tanon2500R數(shù)碼凝膠圖像處理系統(tǒng)(海天能科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液的制備

將凍存的糞腸球菌標(biāo)準(zhǔn)株接種于BHI液體培養(yǎng)基，置于搖床上37 ℃厭氧條件下復(fù)蘇培養(yǎng)24 h。取復(fù)蘇后的糞腸球菌接種于BHI固體培養(yǎng)基并置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中厭氧條件下培養(yǎng)24 h后，再將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種于BHI液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)24 h；然后用麥?zhǔn)媳葷岱ㄅ渲凭鷳乙?，并調(diào)整細(xì)菌濃度為0.5 McFarland( 1×108/mL)備用。

1.2.2 含藥培養(yǎng)基的制備

取五味子甲素標(biāo)準(zhǔn)品用甲醛溶液配制成1 mg/mL 的母液，過濾后再用BHI肉湯培養(yǎng)基依據(jù)二倍稀釋法將母液稀釋成濃度依次為：500、250、125、62.5、31.25 μg/mL的含藥培養(yǎng)基備用。

1.2.3 不同濃度五味子甲素對糞腸球菌的抗菌作用觀察

取滅菌后的96孔板，分別在每孔中各加入50 μL 糞腸球菌菌懸液和150 μL BHI培養(yǎng)基，封口膜封口后置于37 ℃培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)24 h。抽樣檢測(激光共聚焦顯微鏡觀察)確定生物膜模型建立成功后，棄原培養(yǎng)液，并將其隨機(jī)分為7組(5個實驗組、1個陰性對照組和1個空白對照組)；5個實驗組分別加入含五味子甲素濃度為500、250、125、61.25、31.25 μg/mL的 BHI培養(yǎng)基各100 μL，陰性對照組加入僅含菌液不含藥物的BHI培養(yǎng)基100 μL，空白對照組加入不含菌液和藥物的BHI培養(yǎng)基100 μL，一并置37 ℃厭氧條件下繼續(xù)培養(yǎng)12 h。培養(yǎng)結(jié)束后分別取各組標(biāo)本，用PBS溶液沖洗2～3次后，每孔加入5 mg/mL 的MTT各 20 μL，37 ℃避光孵育4 h;PBS 沖洗2～3次后再于每孔中各加入150 μL DMSO溶液，并置于搖床上震蕩15 min；待結(jié)晶充分溶解后,用全自動酶標(biāo)儀分別檢測各孔490 nm波長處的吸光值(A490)，并按以下公式計算各組的抑菌率(%)。

1.2.4 不同濃度五味子甲素對糞腸球菌毒力因子表達(dá)影響的觀察

1.2.4.1 分組處理和PCR擴(kuò)增

取糞腸球菌菌液分別接種于含五味子甲素濃度為500、250 、125 μg/mL和0 μg/mL(陰性對照組)的BHI培養(yǎng)基，置于37 ℃ 厭氧條件下培養(yǎng) 24 h后，分別從每組中各取1 mL培養(yǎng)液按 RNAiso TM Plus(Total RNA 提取試劑)說明提取其總RNA；并用RNA PCRkit(AMV)Ver 3.0試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA。然后用3對相應(yīng)引物(上海生工設(shè)計合成,具體序列見表1)用Biometra PCR儀并按PCR反應(yīng)試劑盒說明對糞腸球菌毒力因子srtC、esp、ebpR 基因進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物置-20 ℃ 冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 PCR 引物序列

1.2.4.2 瓊脂糖凝膠電泳及分析

取0.3 g瓊脂糖與25 mL 1×TBE電泳緩沖液混合，加熱制成凝膠后，再加入0.2 μL EB混勻并將其倒入凝膠板中凝固15 min備用。取10 μL PCR 反應(yīng)產(chǎn)物與2 μL 6×Loading buffer混勻后，置于瓊脂糖凝膠小孔中，于110 v、25 min條件下跑電泳。電泳結(jié)束后將凝膠板置于凝膠成像儀UVI下進(jìn)行觀察；采用Taona 2500 R凝膠圖像處理軟件測量各電泳條帶的吸光度值，并分析各目的基因的相對表達(dá)值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 不同濃度五味子甲素對糞腸球菌的抑制率

不同濃度五味子甲素作用糞腸球菌12 h后，MTT法檢測各組的吸光值并計算其抑菌率，結(jié)果顯示：31.25～500 μg/mL五味子甲素對糞腸球菌均有一定的抑制作用，各濃度組的抑菌率分別與陰性對照組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；其中以31.25 μg/mL組的抑菌率最低，但隨著藥物濃度的增加，其抑菌率逐漸增高，各藥物濃度組間兩兩相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而陰性對照組與空白對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(表2)。

表2 各組A值及抑菌率比較

不同字母組間P<0.05

2.2 五味子甲素對 srtC、esp、ebpR表達(dá)水平的影響

糞腸球菌菌懸液分別與 500、250、125、0 μg/mL(陰性對照組) 五味子甲素共同培養(yǎng)24 h后，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示：①陰性對照組和藥物濃度為 125 μg/mL時，3種毒力因子的條帶均比較清晰；②隨著藥物濃度的增加，各毒力因子的條帶亮度均逐漸變淡，當(dāng)藥物濃度為500 μg/mL時， srtC 和 ebpR 條帶消失，而esp條帶只是變淡并沒有消失(圖1)。利用凝膠圖像系統(tǒng)處理軟件對各電泳條帶進(jìn)行定量分析顯示：各濃度藥物組的srtC、esp、ebpR mRNA表達(dá)水平均明顯低于陰性對照組(P<0.05)，其降低程度均隨著藥物濃度的增加而增加，各濃度組間兩兩相比均P<0.05(表3)。以上結(jié)果說明，125～500 μg/mL不同濃度五味甲素對糞腸球菌的3種毒力因子srtC、esp、ebpR 的表達(dá)均有不同程度的干擾或抑制作用，當(dāng)其濃度達(dá)到500 μg/mL時，可完全抑制srtC和ebpR mRNA的表達(dá)，但不能完全抑制esp mRNA的表達(dá)。

1～4為srtC；5～8為esp；9～12 ebpR；各基因的序號分別代表不同藥物濃度，從小到大依次為0、125、250、500 μg/mL

圖1 各組srtC、esp、ebpR的PCR產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果

同一種基因不同藥物濃度組間兩兩相比，不同字母組間P<0.05

3 討論

五味子甲素是木蘭科(Magnoliaceae)植物五味子的干燥成熟果實的主要有效成分之一，具有收斂固澀、益氣生津、補(bǔ)腎寧心等作用[3]。研究表明五味子對糞腸球菌有一定的抑制作用[4]，故本實驗以五味子的有效成分五味子甲素為對象，觀察其是否也具有抑制糞腸球菌的作用。結(jié)果顯示，31.25～500 μg/mL不同濃度五味子甲素作用于糞腸球菌生物膜后，其抑菌率隨著藥物濃度的增加而增高，當(dāng)藥物濃度為500 μg/mL時，抑菌效果最明顯。

糞腸球菌是繼發(fā)性根管內(nèi)感染的主要致病菌，與初次感染的根管相比，其數(shù)量增多，且大部分細(xì)菌已形成生物膜，從而導(dǎo)致其具有極強(qiáng)耐藥性，使治療變得非常困難。有研究認(rèn)為，糞腸球菌在根管內(nèi)形成生物膜與其以下3種毒力因子有關(guān)：①分選酶sortase，該酶是一組介導(dǎo)細(xì)菌表面蛋白與G+細(xì)菌細(xì)胞壁共價結(jié)合的蛋白酶，是細(xì)菌粘附并發(fā)揮毒力作用的關(guān)鍵因子，根據(jù)其識別表面蛋白序列的不同，可分為 A、B、C、D等多種[5]，其中srtA 在細(xì)菌錨定到菌細(xì)胞表面的過程中發(fā)揮重要作用；srtC是糞腸球菌生成菌毛、形成生物膜和誘導(dǎo)心內(nèi)膜炎發(fā)生的重要因子，當(dāng)srtA 基因缺失時，srtC和(或)其錨定的蛋白可以補(bǔ)償srtA 的部分功能[6]；②esp編碼的腸球菌表面蛋白，該蛋白是類腸球菌細(xì)胞壁上相對分子量較大的一種表面蛋白(1 873個氨基酸)[7],由其具有介導(dǎo)細(xì)菌粘附的作用,在糞腸球菌生物膜的研究中逐漸受到重視[7-8]； ③ebp，ebp基因座可影響菌毛形成[9]，其中ebpR是ebpABC的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子，ebpABC作為糞腸球菌菌毛相關(guān)操縱子，普遍存在于糞腸球菌分離株中，與其菌毛的生成和生物膜形成有關(guān)[8]。

為進(jìn)一步探討五味子甲素對糞腸球菌的抑制作用是否通過影響其相關(guān)毒力因子的表達(dá)而實現(xiàn)的，本實驗選取與糞腸球菌形成生物膜有一定關(guān)系的3種毒力因子(srtC、esp、ebpR)為對象，觀察其在不同濃度五味子甲素作用下的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，125～500 μg/mL不同濃度五味子甲素對糞腸球菌的3種毒力因子srtC、esp、ebpR mRNA的表達(dá)均有不同程度的干擾或抑制作用，當(dāng)藥物濃度達(dá)到500 μg/mL時，可完全抑制srtC和ebpR mRNA的表達(dá)，但不能完全抑制esp mRNA的表達(dá)。提示，五味子甲素對糞腸球菌生物膜及其生物膜形成相關(guān)毒力因子均有明顯的抑制作用。

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The effects of Schisandrin A on the virulence factors ofenterococcusfaecalis

CUI Hong, XU Ying, WU Qing

(SchoolofStomatology,JiamusiUniversity,Jiamusi154007,China)

AIM: To investigate the antibacterial effect of schisandrin A onEnterococcusfaecalisbiofilm and on the expression of the virulence factors. METHODS:Enterococcusfaecalisbiofilm was cultured in vitro. TheEnterococcusfaecalisbiofilm was co- cultured with schisandrin A at 31.25,62.5,125,250 and 500 μg/mL respectively for 12 h, MTT assay was conducted to determine the viable ofEnterococcusfaecalisin the biofilm.Enterococcusfaecalisbiofilm was co- cultured with schisandrin A at 125,250, and 500 μg/mL for 24 h, then srtC, esp and ebpR mRNA was examined by RT- PCR. RESUITS: Schisandrin A showed a dose- dependent inhibitory effect onEnterococcusfaecaliswiability(P<0.05). The highest inhibition was achieved at 500 μg/mL of schisandrin A. Moreover, schisandrin A decreased srtC,esp and ebpR mRNA in a concentration dependent manner(P<0.05). Schisandrin A at 500 μg/mL completely inhibited the mRNA Expression of srtC,esp,and ebpR. CONCLUSION: Schisandrin A can inhibit the proliferation ofEnterococcusfaecalisand the expression of virulence factors srtC,esp, and ebpR mRNA ofEnterococcusfaecalis.

schisandrin a;Enterococcusfaecalis; biofilm; virulence factor; RT- PCR

2014-07-15;

2014-12-01

佳木斯大學(xué)研究生科技創(chuàng)新項目(LM2014_045)

崔紅(1989- )，女，漢族，黑龍江人，碩士生(導(dǎo)師：許穎)

許穎, E-mail: xuyingjiayi@126.com

R780.2

A

1005-2593(2015)01-0024-04