閔兆升，郭會(huì)明，張志強(qiáng)，洪厚勝

（1.南京工業(yè)大學(xué) 理學(xué)院，江蘇 南京 211800；2.南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 211800）

重組畢赤酵母產(chǎn)植酸酶發(fā)酵條件的優(yōu)化

閔兆升1，郭會(huì)明1，張志強(qiáng)2，洪厚勝2

（1.南京工業(yè)大學(xué) 理學(xué)院，江蘇 南京 211800；2.南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 211800）

為研究優(yōu)化畢赤酵母工程菌H311產(chǎn)植酸酶的發(fā)酵條件，采用單因素試驗(yàn)和L18（37）正交試驗(yàn)考察不同工藝條件對(duì)產(chǎn)酶活性的影響。結(jié)果表明：影響重組畢赤酵母產(chǎn)植酸酶的因素重要性從大到小依次為誘導(dǎo)時(shí)間、甲醇添加量、裝液量、初始誘導(dǎo)pH、生長時(shí)間、接種量和初始生長pH，產(chǎn)酶最佳條件為接種量3%（體積分?jǐn)?shù)）、裝液量20mL（250mL搖瓶）、生長時(shí)間20 h，誘導(dǎo)時(shí)間120 h、甲醇添加量1.5%（體積分?jǐn)?shù)）、生長pH 6.0、誘導(dǎo)pH 5.0，在此條件下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，植酸酶的比酶活可達(dá)334 U/mL。

植酸酶；畢赤酵母；發(fā)酵；優(yōu)化；酶活力

植酸酶（phytases）是指能夠?qū)⒅菜峒捌潲}類催化水解，并生成磷酸與肌醇衍生物的一類酶的總稱，屬磷酸單脂水解酶［1-2］。植酸酶可消除單胃動(dòng)物對(duì)體內(nèi)植酸的抗?fàn)I養(yǎng)作用。同時(shí)，它能夠代替抗生素顯著提高畜禽腸胃對(duì)蛋白質(zhì)及磷等多種微量元素的利用率，具有良好的飼用增殖效果，且降低了畜禽排放物中磷的含量，從而減少對(duì)環(huán)境的污染［3-4］。因此，國內(nèi)關(guān)于植酸酶的應(yīng)用最為廣泛的也是飼料工業(yè)，但所產(chǎn)植酸酶品質(zhì)較為粗放。近些年，國外研究者為將其應(yīng)用到食品加工行業(yè)，開始研究食品級(jí)植酸酶，用來提高食品的生理功能和營養(yǎng)效價(jià)［5-6］。然而，眾所周知，天然來源的微生物往往具有表達(dá)量少、分離提取困難、難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的需要等不足。隨著基因工程與發(fā)酵技術(shù)的發(fā)展，使獲得高效表達(dá)植酸酶的基因工程菌成為了可能［7-10］。筆者就1株重組畢赤酵母產(chǎn)植酸酶基因工程菌的產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化，旨在探索高密度發(fā)酵技術(shù)中可改進(jìn)的工藝和設(shè)備。

1 材料與方法

1.1 菌株

基因工程酵母H311，來自云南師范大學(xué)。

1.2 主要試劑

植酸鈉（P8810）（AR級(jí)），Sigma公司；其他試劑均為市售分析純。

1.3 培養(yǎng)基

培養(yǎng)基配制主要參照 Invitrogen公司編著的Multi-Copy Pichia Expression Kit操作手冊(cè)。

YPD培養(yǎng)基（種子培養(yǎng)基，g/L）：葡萄糖20、蛋白胨20、酵母粉10。

BMGY培養(yǎng)基（增殖培養(yǎng)基，g/L）：酵母粉10、蛋白胨20、YNB（無氨基酵母氮源）13.4、生物素4× 10-4、甘油10、1mol/L H3PO4緩沖液100；pH 6.0。

BMMY培養(yǎng)基（誘導(dǎo)培養(yǎng)基，1 L）：酵母粉10g、蛋白胨20g、YNB 13.4g、生物素4×10-4g、1mol/L H3PO4緩沖液100g、甲醇10mL；pH 6.0。

以上培養(yǎng)基均在105℃低壓滅菌30min，生物素與甲醇均過濾除菌，待高溫滅菌后加入。

1.4 菌種活化及培養(yǎng)

在無菌環(huán)境條件下，將冷凍干燥管中的保藏菌種重懸于YPD液體培養(yǎng)基中，并將其置于裝液量為15mL的250mL的搖瓶中，于30℃、220r/min培養(yǎng)24 h；吸取0.1mL發(fā)酵液于YPD固體培養(yǎng)基上，并用涂布棒均勻涂布，于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d；將菌體于YPD固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，挑取2次活化后的單菌落，接種于YPD液體培養(yǎng)基中，30℃、220r/min培養(yǎng)18 h，作為發(fā)酵種子液。

1.5 發(fā)酵培養(yǎng)及培養(yǎng)條件的優(yōu)化

將種子液按不同的接種量轉(zhuǎn)接于BMGY培養(yǎng)基中，30℃、220r/min培養(yǎng)。再轉(zhuǎn)接至BMMY誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，27℃、220r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)。試驗(yàn)分別研究不同接種量、裝液量、甲醇添加量、誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響，并在此基礎(chǔ)上，采用L18（37）正交表設(shè)計(jì)7因素3水平的正交試驗(yàn)，確定畢赤酵母植酸酶搖瓶發(fā)酵最佳誘導(dǎo)條件，并對(duì)此最佳條件進(jìn)行驗(yàn)證。

1.6 植酸酶酶活測(cè)定

由于畢赤酵母植酸酶為胞外表達(dá)。因此，將誘導(dǎo)結(jié)束后的發(fā)酵液經(jīng)4 000r/min離心5min，除去菌體，所得上清液即為發(fā)酵粗酶液。發(fā)酵液中植酸酶活性的測(cè)定采用釩鉬酸銨法［11］，其酶活定義：樣品在37℃、pH5.50條件下，每分鐘從濃度為5.0mmol/L植酸鈉溶液中釋放1 μmol無機(jī)磷，即為1個(gè)植酸酶酶活性單位，以U表示。

準(zhǔn)確吸取適當(dāng)稀釋的酶液0.2mL，并加入1.8mL乙酸-乙酸鈉緩沖液混合，于37℃的水浴鍋中預(yù)熱5min，吸取4.0mL 5.0mmol/L的乙酸緩沖液配制而成底物植酸鈉，37℃ 水浴反應(yīng)30min后，再加入4mL反應(yīng)終止液（由100g/L的鉬酸銨溶液、2.35g/L的偏釩酸銨溶液及硝酸溶液按體積比1∶1∶2現(xiàn)配現(xiàn)用）冷卻至室溫，（對(duì)照組先加反應(yīng)終止液，無需預(yù)熱、無需水解），在UVmini-1240型紫外-可見光分光光度計(jì)415nm處測(cè)定吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸出的直線方程計(jì)算出無機(jī)磷的量，進(jìn)而計(jì)算出酶活。

2 結(jié)果與討論

2.1 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響

在250mL搖瓶中，裝液30mL，發(fā)酵初始生長pH為6.0，發(fā)酵生長溫度為30℃，菌體的接種量為6%（體積分?jǐn)?shù)），初始誘導(dǎo)pH 5.5，甲醇添加量為1%（體積分?jǐn)?shù)），誘導(dǎo)溫度為 27℃，轉(zhuǎn)速220r/min，在此條件下研究誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)產(chǎn)植酸酶的影響。0～84 h，每隔12 h測(cè)定酶活；84～136 h，每隔8 h測(cè)定酶活，考察誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)酶活的影響，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知：隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長，植酸酶酶活越來越高，且在92～136 h能保持較高的酶活。這是因?yàn)殡S著誘導(dǎo)時(shí)間的延長，菌體的生物量不斷積累，目的蛋白表達(dá)量隨之增加。但是，在108 h后，植酸酶的酶活是呈緩慢下降趨勢(shì)的。這是因?yàn)榈搅税l(fā)酵后期，菌體的大量生長需要消耗更多的O2，而由于搖瓶發(fā)酵自身的局限性，容易導(dǎo)致溶氧不足，導(dǎo)致菌體自溶，pH上升，這些都會(huì)影響菌體的生物量，進(jìn)而影響誘導(dǎo)表達(dá)。

圖1 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)產(chǎn)植酸酶的影響Fig.1 Effect of induction time on phytase production

2.2 接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響

在250mL搖瓶中，裝液30mL，發(fā)酵初始生長pH為6.0，發(fā)酵生長溫度為30℃，初始誘導(dǎo) pH 5.5，甲醇添加量為1%，誘導(dǎo)溫度為27℃，轉(zhuǎn)速220r/min，誘導(dǎo)表達(dá)96 h，考察菌體的接種量（3%、6%、9%、12%和15%）對(duì)酶活的影響，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知：接種量較小時(shí)，酶活相對(duì)較高。當(dāng)接種量為6%時(shí)，所產(chǎn)植酸酶活性最高。但當(dāng)接種量增大時(shí)，酶活反而有所下降。這是因?yàn)榕囵B(yǎng)基中菌體密度太大，而基因工程菌發(fā)酵屬于高耗氧發(fā)酵，這就使得菌體生長所需的養(yǎng)分和溶氧都出現(xiàn)供應(yīng)不足的狀況，菌體生長狀態(tài)不良，進(jìn)而使得蛋白表達(dá)量降低，即植酸酶分泌量減少。

圖2 接種量對(duì)產(chǎn)植酸酶的影響Fig.2 Effects of inoculation on phytase production

2.3 裝液量對(duì)產(chǎn)酶的影響

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)過程中，主要是以裝液量來控制溶氧。在250mL的搖瓶中，發(fā)酵初始生長 pH為6.0，發(fā)酵生長溫度為30℃，菌體的接種量為6%，初始誘導(dǎo)pH 5.5，甲醇添加量為1%，誘導(dǎo)溫度為27℃，轉(zhuǎn)速220r/min，誘導(dǎo)表達(dá)96 h，考察裝液量對(duì)酶活的影響，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知：當(dāng)裝液量在20～30mL時(shí)，酶活較高；大于30mL時(shí)，酶活顯著降低。這是因?yàn)檠b液量過大，會(huì)直接導(dǎo)致溶氧不足，影響菌體的代謝生成，從而影響植酸酶的誘導(dǎo)分泌表達(dá)。

圖3 裝液量對(duì)產(chǎn)植酸酶的影響Fig.3 Effect of containted quantity on phytase production

2.4 誘導(dǎo)劑甲醇添加量對(duì)產(chǎn)酶的影響

在250mL的搖瓶中，裝液30mL，發(fā)酵初始生長pH為6.0，發(fā)酵生長溫度為30℃，菌體的接種量為6%，初始誘導(dǎo)pH 5.5，甲醇添加量分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%（體積分?jǐn)?shù)），誘導(dǎo)溫度為27℃，轉(zhuǎn)速220r/min，誘導(dǎo)表達(dá)96 h，考察甲醇添加量對(duì)酶活的影響，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知：在甲醇添加量控制在1.0%～1.5%時(shí)，酶活力較高；但是在甲醇添加量較高（＞1.5%）或較低（＜0.5%）時(shí)，酶活力下降則比較顯著，都不到最高酶活的一半。顯然，在重組畢赤酵母的高密度發(fā)酵中，控制適宜的甲醇添加量是十分重要的。甲醇添加量過低，會(huì)導(dǎo)致AOX1啟動(dòng)子不能有效啟動(dòng)，進(jìn)而使得外源基因不能夠高效轉(zhuǎn)錄；而由于甲醇自身的特性，當(dāng)甲醇添加量過高時(shí)，會(huì)造成發(fā)酵液中甲醇的積累，從而對(duì)菌體細(xì)胞產(chǎn)生毒害，也不能高效表達(dá)植酸酶。因此，在基因工程菌高密度發(fā)酵過程中，適宜的甲醇添加量是實(shí)現(xiàn)外源蛋白高效分泌的保證。

圖4 甲醇添加量對(duì)產(chǎn)植酸酶的影響Fig.4 Effect of methanol concentration on phytase production

2.5 正交試驗(yàn)結(jié)果

在設(shè)定的水平范圍內(nèi)，根據(jù)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果（表1），利用SPSS 10.0對(duì)結(jié)果進(jìn)行極差分析，結(jié)果見表2。由表2可知：重組畢赤酵母產(chǎn)植酸酶的因素主次順序從大到小依次為誘導(dǎo)時(shí)間、甲醇添加量、裝液量、初始誘導(dǎo)pH、生長時(shí)間、接種量和初始生長pH，其中初始生長pH對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響最小，誘導(dǎo)時(shí)間及誘導(dǎo)甲醇量對(duì)產(chǎn)酶的影響較大。通過極差分析，確定了重組畢赤酵母搖瓶發(fā)酵產(chǎn)植酸酶的優(yōu)組合和優(yōu)水平：接種量3%、裝液量20mL、生長時(shí)間20 h，誘導(dǎo)時(shí)間120 h，甲醇添加量1.5%、初始生長pH 6.0，初始誘導(dǎo)pH 5.0。按照此條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，誘導(dǎo)表達(dá)出的植酸酶比酶活可達(dá)334 U/mL，比優(yōu)化前（230 U/mL）提高了45%。

表1 L18（37）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 1 Results and designs of L18（37）orthogonal experiments

表2 正交試驗(yàn)極差分析Table 2 Range analysis of orthogonal experiments

3 結(jié)論

利用單因素及正交試驗(yàn)對(duì)畢赤酵母基因工程菌H311產(chǎn)植酸酶的搖瓶發(fā)酵工藝條件進(jìn)行初步優(yōu)化，并對(duì)正交試驗(yàn)條件進(jìn)行了驗(yàn)證，優(yōu)化后的搖瓶產(chǎn)植酸酶活性可達(dá) 334 U/mL，與優(yōu)化前（230 U/mL）發(fā)酵產(chǎn)酶酶活相比有顯著提高。但是，在搖瓶發(fā)酵水平上，由于不能較好地控制菌體生長所需要的溶氧、也不能實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)發(fā)酵過程中甲醇濃度和pH值變化，因此搖瓶發(fā)酵并不能實(shí)現(xiàn)菌體的高密度培養(yǎng)，即重組基因工程菌的產(chǎn)酶水平若需達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)要求，則要進(jìn)一步放大到發(fā)酵罐中發(fā)酵，并對(duì)其工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。

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（責(zé)任編輯 管 珺）

Optimization of phytase production by recombinant Pichia pastoris

MIN Zhaosheng1，GUO Huiming1，ZHANG Zhiqiang2，HONG Housheng2
（1.College of Sciences，Nanjing Tech University，Nanjing 211800，China；2.College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，Nanjing Tech University，Nanjing 211800，China）

To optimize the condition for fermentation of phytase production by recombinant Pichia pastoris H311.The effects of inoculum，liquid volume，growth time，induction time，methanol concentration，initial growth pH and initial induction pH on expression of phytase in recombinant P.pastoris H311were studied by single factor experiment and L18（37）orthogonal experiment.Recombinant phytase was then characterized.The influencing factors on the expression of phytase were in the following order：induction time，methanol concentration，liquid volume，the initial induction pH value，growth time，inoculum and initial growth pH value.The optimal condition was with 3%（v/v）inoculum，20mL liquid volume（250mL flask），20 h growth time，120 h induction time，1.5%（v/v）methanol concentration，initial growth pH 6.0 value and initial induction pH 5.0.Under the optimal condition，the recombinant phytase reached an activity of 334 U/mL.

phytase；Pichia pastoris；fermentation；optimization；enzymatic activity

Q786

A

1672-3678（2015）03-0031-05

10.3969/j.issn.1672-3678.2015.03.006

2014-04-08

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）（2012AA021201）

閔兆升（1989—），男，江蘇鹽城人，碩士研究生，研究方向：基因工程、酶制劑；洪厚勝（聯(lián)系人），教授，E-mail：hhs@njtech.edu.cn