田 超，陶冠軍，丁重陽，顧正華，張 梁，石貴陽

（1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；3.江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫214122）

猴頭菌發(fā)酵液中抑制非酶糖基化反應(yīng)物質(zhì)的分離及分析

田 超1，2，陶冠軍3，丁重陽1，2，顧正華2，張 梁2，石貴陽2

（1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；3.江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫214122）

以體外非酶糖基化反應(yīng)抑制率為考察指標(biāo)，對(duì)猴頭菌發(fā)酵液中抑制非酶糖基化反應(yīng)的高活性物質(zhì)進(jìn)行分離并純化，通過發(fā)酵液濃縮、二步醇沉、提取物冷凍干燥、C18層析柱等步驟進(jìn)行分離，獲得1種對(duì)非酶糖基化反應(yīng)具有良好抑制作用的物質(zhì)組分HE35，經(jīng)液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）分析后發(fā)現(xiàn)，HE35的相對(duì)分子質(zhì)量為294，2mg/mL的HE35對(duì)體外非酶糖基化抑制率達(dá)到92.17%，半抑制質(zhì)量濃度IC50為0.65mg/mL。初步分析猴頭菌發(fā)酵液中可能存在一種以上的活性物質(zhì)，對(duì)體外非酶糖基化反應(yīng)具有抑制作用。

猴頭菌；非酶糖基化；液態(tài)發(fā)酵；抑制率

持續(xù)高血糖會(huì)引起機(jī)體多種蛋白質(zhì)發(fā)生非酶糖基化（NEG）反應(yīng)，所謂非酶糖基化，是指蛋白質(zhì)、氨基酸等游離的氨基端與還原糖上的羰基通過一系列復(fù)雜的非酶促反應(yīng)最終生成不可逆的糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）的過程。持續(xù)高血糖引發(fā)的糖尿病常伴有白內(nèi)障［1］、糖尿病腎病［2］和動(dòng)脈粥樣硬化［3］等慢性并發(fā)癥，這些并發(fā)癥的發(fā)病因素較多，其中蛋白質(zhì)非酶糖基化是主要因素之一［4］，也是組織器官老化的重要原因［5］。尋找能夠抑制NEG反應(yīng)的抑制劑是防治糖尿病及其并發(fā)癥的方向之一，同時(shí)可以為開發(fā)治療糖尿病藥物提供先導(dǎo)化合物。

食藥用真菌在自然界中來源豐富、分布廣泛，含有多種對(duì)人體有益的天然產(chǎn)物，對(duì)多種疾病具有良好的防治和治療效果，如靈芝中的三萜類物質(zhì)靈芝酸，具有明顯的抗腫瘤作用［6］，靈芝多糖具有調(diào)節(jié)免疫、抗氧化損傷等功效［7］，金耳菌絲體多糖和冬蟲夏草多糖均有降血糖作用［8-9］。黃達(dá)明等［10］研究了猴頭菌轉(zhuǎn)化銀杏葉粗提物（EGB），發(fā)酵液中非多糖提取物對(duì)非酶糖基化具有明顯的抑制作用，但并未明確其物質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量和具體化學(xué)結(jié)構(gòu)。大型真菌中，擔(dān)子菌的許多品種具有降血糖作用［11］，猴頭菌（Hericium erinaceus）就是其中代表之一，它含有豐富的生物活性物質(zhì)，具有促進(jìn)血液循環(huán)、降低血膽固醇、提高機(jī)體免疫力等多種功效［12-14］。目前，NEG反應(yīng)的抑制劑主要為合成類藥物，其毒副作用較大，且價(jià)格昂貴，對(duì)其使用有嚴(yán)格限制。猴頭菌作為一種食藥兩用的真菌，與合成類藥物相比，不但具有良好的疾病治療效果，也是一種可以日常食用的佳肴美食。目前，對(duì)于分離和分析猴頭菌中具有抑制NEG功能的物質(zhì)，并利用猴頭菌液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)具有抑制NEG反應(yīng)的活性物質(zhì)鮮有報(bào)道。

筆者以抑制體外蛋白質(zhì)NEG反應(yīng)為主要檢測(cè)指標(biāo)，對(duì)猴頭菌發(fā)酵液進(jìn)行初步分離和純化，成功得到一種具有抑制NEG反應(yīng)的活性物質(zhì)，并對(duì)活性物質(zhì)進(jìn)行分析以鑒定此活性物質(zhì)，為其進(jìn)一步應(yīng)用提供數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種與材料

猴頭菌（Hericium erinaceus）保藏于江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室。

乙二醛、牛血清白蛋白（BSA）、氨基胍（AG）、疊氮化鈉，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲醇為色譜純，其余所用試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基（g/L）：馬鈴薯200，葡萄糖20，瓊脂條20～22。

種子培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖20，玉米粉20，麩皮15，KH2PO42，MgSO4·7H2O 1，酵母膏3，VB10.015。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖20，玉米粉15，麩皮15，KH2PO42，MgSO4·7H2O 1。

1.3 儀器與設(shè)備

HITACHI 650-60型熒光分光光度計(jì)，日本Hitachi公司；臺(tái)式高速離心機(jī)，Sigma公司；Waters 600型高效液相色譜儀、液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀、Masslynx4.1工作站，Waters公司；AKTA Purifier系統(tǒng)，Amersham Pharmacia Biotech公司。

1.4 方法

1.4.1 體外非酶糖基化反應(yīng)抑制率的測(cè)定

NEG反應(yīng)抑制率的測(cè)定方法參照文獻(xiàn)［15］的方法并稍加修改。體外NEG反應(yīng)體系反應(yīng)液包含12mg/mL乙二醛、10mg/mL牛血清白蛋白和 2mg/mL疊氮化鈉的pH為7.4的磷酸緩沖液。取1mL樣品液與上述1mL反應(yīng)體系液混合，以蒸餾水為空白樣品，混勻后37℃避光反應(yīng)15 d，反應(yīng)結(jié)束后加蒸餾水定容至10mL，測(cè)定熒光強(qiáng)度。在激發(fā)波長370nm、狹長5nm、發(fā)射波長440nm、狹長6nm條件下利用熒光光度計(jì)測(cè)定熒光強(qiáng)度，重復(fù)3次，取平均值，計(jì)算體外NEG反應(yīng)的抑制率，計(jì)算見式（1）。

式中：I為抑制率；a為空白樣品熒光強(qiáng)度；b為待測(cè)樣品熒光強(qiáng)度。

利用方差分析檢驗(yàn)樣品差異顯著性，抑制率均以平均數(shù)（Mean）±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示。

1.4.2 活性物質(zhì)的粗提取

發(fā)酵得到的猴頭菌發(fā)酵液經(jīng)冷凍離心機(jī)8 000r/min離心10min去菌體取上清，采用30%（體積分?jǐn)?shù)，下同）乙醇和70%乙醇二步醇沉，分離得到2個(gè)沉淀組分HE1和HE2，上清液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去乙醇，上清液濃縮后和乙酸乙酯1∶1（體積比）混合進(jìn)行萃取，得到有機(jī)相HE3和水相HE4，兩相組分分別經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去含有的乙酸乙酯和殘留的乙醇。將得到的4個(gè)組分冷凍干燥后用超純水配制成一定濃度的溶液，取少量測(cè)定體外NEG反應(yīng)抑制率，剩余樣品4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 C18自制低壓層析柱分離及C18制備柱純化活性物質(zhì)

采用自制低壓層析柱（10 mm×50 cm，上海錦華層析設(shè)備廠制造）進(jìn)行分離，C18填料，甲醇水梯度洗脫，流速為體積流量1.0mL/min，雙紫外檢測(cè)，按峰收集洗脫液。將洗脫液濃縮凍干，配制成質(zhì)量濃度分別為0.5、1和2mg/mL溶液，測(cè)定體外NEG反應(yīng)抑制率。

將C18自制低壓層析柱分離得到的高抑制率活性組分通入制備柱（SunFire Prep C18 OBD Column，Waters公司）進(jìn)行純化，流動(dòng)相為水（A）和甲醇（B），采用梯度洗脫：0～10min，B液5%～70%；10～40min，B液70%～100%；40.1min，B液回到5%并維持10min。流速為5mL/min，進(jìn)樣量1mL，254、299nm雙紫外（UV）檢測(cè)。按峰收集，將各樣品濃縮凍干，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.4 活性物質(zhì)對(duì)體外NEG反應(yīng)的抑制水平

稱取活性物質(zhì)樣品50mg，溶于10mL水中，逐級(jí)稀釋，配制成質(zhì)量濃度為0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0和5.0mg/mL的溶液，分別測(cè)定不同濃度下對(duì)體外NEG反應(yīng)的抑制率，繪制抑制水平曲線，分析活性物質(zhì)對(duì)體外NEG反應(yīng)的半抑制量IC50。

2 結(jié)果與討論

2.1 猴頭菌發(fā)酵液中抑制NEG反應(yīng)活性組分的初步分離

為了研究猴頭菌液態(tài)發(fā)酵后活性物質(zhì)存在于胞內(nèi)還是分泌到發(fā)酵液中，首先對(duì)發(fā)酵上清液和菌絲體抽提液進(jìn)行抑制率的考察，結(jié)果見表1。由表1可知：猴頭菌發(fā)酵上清液對(duì)體外NEG反應(yīng)的抑制率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于菌絲體抽提液，表明猴頭菌液態(tài)發(fā)酵后具有抑制NEG反應(yīng)的活性物質(zhì)被分泌到發(fā)酵液中。

將發(fā)酵得到的猴頭菌發(fā)酵液經(jīng)乙醇醇沉和乙酸乙酯萃取后，分別得到HE1、HE2、HE3和HE4共4個(gè)組分，測(cè)定4個(gè)組分不同濃度下對(duì)體外NEG反應(yīng)的抑制率，結(jié)果見表2。由表2可知：HE3具有最高的抑制活性，而HE1和HE2的抑制率明顯低于發(fā)酵上清液的抑制率。對(duì)二步醇沉淀得到的較低NEG反應(yīng)抑制率的HE1和HE2進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，兩組物質(zhì)分別為雜蛋白和雜多糖。HE4的抑制活性同樣明顯低于發(fā)酵液，表明乙酸乙酯萃取分離起到了較好的分離效果，將猴頭菌中大部分抑制NEG反應(yīng)的活性物質(zhì)分離到有機(jī)相中。

表1 猴頭菌菌絲體抽提液與發(fā)酵液抑制體外NEG反應(yīng)活性的比較Table 1 Comparison of NEG inhibition percentage between mycelium and fermentation broth from Hericium erinaceus

表2 猴頭菌發(fā)酵液初分離組分對(duì)NEG反應(yīng)抑制率的比較Table 2 Comparison of NEG inhibition percentage of four ingredients in fermentation broth

2.2 利用C18 SPE柱及自制C18低壓層析柱分離活性物質(zhì)

由于體外NEG反應(yīng)需要在37℃孵育箱中避光反應(yīng)15 d，致使抑制率的測(cè)定需在15 d后進(jìn)行，周期相對(duì)較長，因此在對(duì)HE3進(jìn)一步分離前需要建立一種較為方便的快速檢測(cè)方法。通過初步的高壓液相二極管陣列分析發(fā)現(xiàn)，C18 SPE小柱預(yù)分離得到的50%甲醇洗脫液的HPLC圖譜中有4個(gè)比較明顯的色譜峰，對(duì)各保留時(shí)間的色譜峰進(jìn)行全波長掃描，顯示在250nm和300nm左右均有明顯的特征吸收帶（圖1、圖2）。因此，進(jìn)一步的分離過程中采用雙紫外（UV）檢測(cè)器，檢測(cè)波長定為254nm和299nm，以此方法達(dá)到快速檢測(cè)的目的。

參照C18 SPE小柱的預(yù)分離條件，用C18自制低壓層析柱（10 mm×50 cm）進(jìn)行分離，雙紫外檢測(cè)，分離圖譜見圖3。自動(dòng)部分收集儀按峰收集洗脫液，20%、30%、40%、50%、60%、70%和100%甲醇洗脫得到7組不同的分離組分，分別命名為HE32、HE33、HE34、HE35、HE36、HE37和HE31，將各組分濃縮、冷凍干燥后測(cè)定NEG反應(yīng)的抑制率，測(cè)定結(jié)果見表3。

圖1 50%甲醇洗脫樣品HPLC圖譜（總離子強(qiáng)度）Fig.1 HPLC chromatogram of 50%methanol elution sample（Total ions）

圖2 圖1中各峰保留時(shí)間全波長掃描Fig.2 Scan spectra from 200 to 600nm of HE3 in different retention time in Fig.1

圖3 HE3 C18層析柱分離圖譜Fig.3 C18 chromatogram for HE3 separation

表3 猴頭菌發(fā)酵液中HE3各分離組分對(duì)NEG反應(yīng)抑制率的比較Table 3 Comparison of NEG inhibition rate of seven ingredients in HE3

由表3可知：HE3通過C18層析柱分離得到的7組組分中，50%甲醇洗脫樣品HE35的體外NEG反應(yīng)抑制率最高，在2mg/mL濃度下抑制率達(dá)到92.33%，遠(yuǎn)高于其他組分的抑制率，說明猴頭菌發(fā)酵液中HE35是其發(fā)揮抑制作用的主要活性成分。同時(shí)HE33和HE36也有較好的抑制效果，表明猴頭菌發(fā)酵液中可能存在多種物質(zhì)，對(duì)NEG反應(yīng)具有抑制作用。

將乙酸乙酯分離萃取得到的HE3組分經(jīng)C18 SPE小柱（10g，60mL）預(yù)分離，利用甲醇-水梯度洗脫，收集各個(gè)梯度的洗脫液，對(duì)比后發(fā)現(xiàn)50%甲醇洗脫樣品對(duì)NEG反應(yīng)的抑制作用最為明顯，表明C18柱可以將猴頭菌發(fā)酵液中的活性物質(zhì)進(jìn)行有效的分離。

2.3 HE35制備液相純化及LC-MS分析

在確定猴頭菌發(fā)酵液中主要抑制成分后，為進(jìn)一步提高主要活性物質(zhì)HE35的純度以進(jìn)行結(jié)構(gòu)方面的分析，需要對(duì)HE35進(jìn)行高效液相制備，制備圖譜見圖4。由圖4可知：在紫外檢測(cè)波長254nm下無明顯突出的單一洗脫峰，而檢測(cè)波長300nm下有2個(gè)單一峰，保留時(shí)間分別為6.579和14.238min，通過單獨(dú)收集2個(gè)單一洗脫峰，其他洗脫液合并收集，測(cè)定體外NEG反應(yīng)抑制率發(fā)現(xiàn)，僅有保留時(shí)間14.238min收集的樣品在2mg/mL質(zhì)量濃度下抑制率達(dá)到92.17%，與制備前HE35的抑制率最為接近。

HE35通過液相的純化后，將保留時(shí)間14.238min洗脫峰凍干樣品進(jìn)行LC-MS檢測(cè)，結(jié)果見圖5。由圖5（a）可知，HE35的液相色譜圖為近似單一對(duì)稱峰，表明HE35分離純化后基本達(dá)到色譜純。對(duì)HE35進(jìn)行質(zhì)譜（圖5（b））分析，發(fā)現(xiàn)其相對(duì)分子質(zhì)量為294、588和882，為其二聚體和三聚體。

圖4 HE35的HPLC圖譜Fig.4 HPLC chromatogram of HE35

圖5 HE35的HPLC圖譜和保留時(shí)間9.375min樣品的質(zhì)譜Fig.5 HPLC chromatogram of HE35 and mass spectra at 9.375min

2.4 HE35的分子式分析

HE35物質(zhì)呈黃色油狀，在波長300nm和254nm下均具有較強(qiáng)的吸收峰，說明HE35的結(jié)構(gòu)中含有苯環(huán)，據(jù)文獻(xiàn)［16］，此紫外吸收波長為共軛雙鍵特性，且含有3個(gè)或3個(gè)以上共軛雙鍵，屬芳香族化合物。苯環(huán)上存在取代基時(shí)，在紫外區(qū)的1條吸收帶會(huì)向長波移動(dòng)且吸收強(qiáng)度增大，也驗(yàn)證了HE35為芳香族化合物，根據(jù)紫外吸收和高效液相分析初步推斷HE35可能為黃酮類物質(zhì)。然而紫外掃描只能反映分子中特定基團(tuán)及附近的結(jié)構(gòu)特征，無法反映整個(gè)分子的特性，在沒有標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照情況下，HPLC分析也不能確定HE35的整個(gè)分子情況，因此需要進(jìn)一步利用質(zhì)譜與核磁進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見圖6和圖7。

由圖6可知HE35質(zhì)譜碎片規(guī)律。圖6（a）中ESI+：m/z=227［M+H］+結(jié)果表明主要有m/z=226和68這2個(gè)碎片脫落，碎片226為1分子HE35脫掉1分子異戊二烯（C5H8）產(chǎn)生的，因此，結(jié)合正離子質(zhì)譜圖分析，可判斷HE35分子中除了含有苯環(huán)外，還含有1個(gè)異戊二烯基團(tuán)；圖6（b）ESI+：m/z=171［M+H］+結(jié)果說明主要有 m/z=170和124這2個(gè)碎片脫落，可能是HE35的母核結(jié)構(gòu)發(fā)生斷裂產(chǎn)生的2個(gè)片段；圖6（c）中ESI+：m/z=277［M+H］+結(jié)果表明主要有m/z=276和18這2個(gè)碎片脫落，碎片276為HE35脫掉1分子H2O產(chǎn)生的，可判斷HE35分子含有基團(tuán)—OH；圖6（d）中ESI+：m/z=119［M+H］+，說明主要有m/z=176和118這2個(gè)碎片脫落。

由圖7可知：化學(xué)位移為10～11的峰為醛基上的質(zhì)子，而化學(xué)位移為6～7的峰可能為酚羥基上的質(zhì)子，化學(xué)位移為4～5的峰為異戊二烯基團(tuán)雙鍵上的質(zhì)子。

圖6 HE35碎片不同保留時(shí)間質(zhì)譜（ESI+）Fig.6 The mass spectrum of fragments at different retention time

圖7 HE35的1H核磁圖譜Fig.71H NMR spectra of HE35

通過以上分析可知：HE35分子中可能含有2個(gè)苯環(huán)、1個(gè)—OH基團(tuán)、1個(gè)異戊二烯基團(tuán)和1個(gè)醛基，2個(gè)苯環(huán)以黃酮類物質(zhì)母核結(jié)構(gòu)C6—C3—C6形式存在，—OH可能位于苯環(huán)上，屬于酚羥基，異戊二烯基團(tuán)可能位于其中1個(gè)苯環(huán)的某一碳位上，且連接方式為C==C斷開，取代苯環(huán)上的1個(gè)H，而醛基可能位于母核結(jié)構(gòu)C6—C3—C6中的C3上，且醛基中的C原子可能為C3中1個(gè)C，因?yàn)楦鶕?jù)相對(duì)分子質(zhì)量294計(jì)算，已經(jīng)不能再容納更多的C原子，綜上推斷HE35的分子式為C20H22O2。確切的化學(xué)結(jié)構(gòu)式有待于進(jìn)一步的研究。

2.5 HE35體外NEG反應(yīng)抑制水平分析

氨基胍（AG）是目前公認(rèn)的最有臨床應(yīng)用前景的抑制NEG反應(yīng)的藥物，在歐洲一些國家已進(jìn)入Ш期臨床試驗(yàn)［17］，為更好地研究HE35對(duì)非酶糖基化反應(yīng)的抑制效果，選用AG作為陽性對(duì)照藥物，結(jié)果見圖8。

圖8 HE35體外非酶糖基化反應(yīng)的抑制水平Fig.8 Inhibitory effects of HE35 on NEG reaction in vitro

由圖8可知：在0～2mg/mL時(shí)，隨著HE35濃度的提高，對(duì)NEG反應(yīng)的抑制率不斷提高，HE35的抑制活性與其質(zhì)量濃度呈現(xiàn)明顯的正相關(guān)性，線性趨勢(shì)線公式為y=76.4x，R2=0.980 8，半抑制質(zhì)量濃度（IC50）為 0.65mg/mL。當(dāng)質(zhì)量濃度超過 2mg/mL時(shí)，HE35對(duì)NEG反應(yīng)的抑制率趨于穩(wěn)定，保持在90%以上。與AG相比，在低質(zhì)量濃度（≤1.5mg/mL）范圍內(nèi)，HE35抑制效果略低于AG，超過一定質(zhì)量濃度（≥1.5mg/mL）后，HE35的抑制效果優(yōu)于AG，并維持在較高水平，從一定程度上也驗(yàn)證了合成類藥物的治療特點(diǎn)是時(shí)間短、作用迅速，活性物質(zhì)平穩(wěn)溫和。然而，AG的毒副作用限制了HE35在降血糖方面的應(yīng)用，HE35能否成為一種有效抑制NEG反應(yīng)的替代新藥或先導(dǎo)化合物，并進(jìn)一步在治療糖尿病方面發(fā)揮更大的價(jià)值還需要做更多的研究。

3 結(jié)論

采用液態(tài)發(fā)酵方法，以抑制NEG反應(yīng)為檢測(cè)指標(biāo)，利用多種分析方法對(duì)具有抑制NEG反應(yīng)活性的物質(zhì)進(jìn)行分離純化和分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1種相對(duì)分子質(zhì)量為294的小分子物質(zhì)HE35對(duì)NEG反應(yīng)具有良好的抑制作用，分析可能為黃酮類物質(zhì)，初步推斷分子式為C20H22O2，2mg/mL質(zhì)量濃度下抑制率可達(dá) 92.17%，半抑制質(zhì)量濃度（IC50）為 0.65mg/mL。其抑制機(jī)制和具體結(jié)構(gòu)正在進(jìn)一步研究中。

［1］Prabhakaram M，Katz M L，Ortwerth B J.Glycation mediated crosslinking between α-crystallin and MP26 in intactlens membranes［J］.Mech Age Dev，1996，91（1）：65-78.

［2］廉永昕，張嘉莉，李兢.糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制研究進(jìn)展［J］.中國療養(yǎng)醫(yī)學(xué)，2012，21（6）：515-516.

［3］李愛萍，田波，張瀚，等.晚期糖基化終產(chǎn)物在糖尿病誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化中的作用［J］.中國療養(yǎng)醫(yī)學(xué)，2011，20（10）：913-915.

［4］Dan Q，Wong R，Chung S K，et al.Interaction between the polyol pathway and non-enzymatic glycation on aortic smooth muscle cell migration and monocyte adhesion［J］.Life Sci，2004，76（4）：445-459.

［5］Brownlee M，Vlassara H，Kooney A，et al.Aminoguanidine prevents diabetes-induced arterial wall protein cross-linking［J］. Science，1986，232：1629-1632.

［6］Lin S B，Li C H，Lee S S，et al.Triterpene-enriched extracts from Ganoderma lucidum inhibitgrowth ofhepatoma cells via suppressing protein kinase C，activating mitogen-activated protein kinases and G2-phase cell cycle arrest［J］.Life Sci，2003，72（21）：2381-2390.

［7］Li X L，Zhou A G，Li X M.Inhibition of Lycium barbarum polysaccharides and Ganoderma lucidum polysaccharides against oxidative injury induced by γ-irradiation in rat liver mitochondria［J］.Carbohydr Polym，2007，69（1）：172-178.

［8］張?chǎng)w旌旌，王捷思，等.金耳菌絲體多糖對(duì)實(shí)驗(yàn)性2型糖尿病大鼠的降血糖作用研究［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2010，22（1）：49-53.

［9］Li S P，Zhang G H，Zeng Q，et al.Hypoglycemic activity of polysaccharide，with antioxidation，isolated from cultured Cordyceps mycelia［J］.Phytomedicine，2006，13（6）：428-433.

［10］黃達(dá)明，常為眾，張志才，等.猴頭菌轉(zhuǎn)化 EGB發(fā)酵液提取物抗氧化及抑制非酶糖基化活性研究［J］.農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)：英文版，2008，9（2）：10-13.

［11］Higaki M，Eguchi F，Watanabe Y.A stable culturing method and pharmacological effectsofthe Agaricusblazei［J］.Nihon Yakurigaku Zasshi，1997，110：98P-103P.

［12］張鵬，圖力古爾，包海鷹.猴頭菌屬真菌化學(xué)成分及藥理活性研究概述［J］.菌物研究，2011，9（1）：54-62.

［13］杜志強(qiáng)，任大明，葛超，等.猴頭菌絲多糖降血糖作用研究［J］.生物技術(shù)，2007，16（6）：40-41.

［14］楊焱，周昌艷.猴頭菌多糖調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的研究［J］.食用菌學(xué)報(bào)，2000，7（1）：19-22.

［15］Pampati P K，Suravajjala S，Dain J A.Monitoring nonenzymatic glycation of human immunoglobulin G by methylglyoxal and glyoxal：a spectroscopic study［J］.Anal Biochem，2011，408（1）：59-63.

［16］徐瑞秋，周政.基礎(chǔ)有機(jī)化學(xué)［M］.北京：人民教育出版社，1983.

［17］Williams M E.Clinical studies of advanced glycation end product inhibitors and diabetic kidney disease［J］.Curr Diab Rep，2004，4（6）：441-446.

（責(zé)任編輯 荀志金）

Separation and analysis of bioactive substances inhibiting non-enzymatic glycosylation from Hericium erinaceus fermentation broth

TIAN Chao1，2，TAO Guanjun3，DING Zhongyang1，2，GU Zhenghua2，ZHANG Liang2，SHI Guiyang2
（1.Key Laboratory of Industrial Biotechnology of the Ministry of Education，School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.National Engineering Laboratory for Cereal Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；3.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

The bioactive component inhibited non-enzymatic glycosylation（NEG）reaction in Hericium erinaceus culture broth was purified by detecting the inhibitory rate against NEG reaction.The purified procedure included the fermentation broth concentration，two-step ethanol precipitation，lyophilization of extracts and C18 chromatography，and the high inhibitory component of HE35 was obtained.Analyzing by liquid chromatography-mass spectrometry（LC-MS），the relative molecular mass was 294.In vitro experiment，the inhibition rate of HE35 at 2mg/mL against NEG reaction was 92.17%and its IC50was 0.65mg/mL.The purification results indicate that more than one component in H.erinaceus culture broth possess the inhibitory activity to NEG reaction.

Hericium erinaceus；non-enzymatic glycosylation；submerged fermentation；inhibition

TS201.2

A

1672-3678（2015）03-0047-08

10.3969/j.issn.1672-3678.2015.03.009

2014-04-01

江蘇省自然科學(xué)基金（BK2011154）

田 超（1986—），男，河北保定人，碩士研究生，研究方向：生物化工；丁重陽（聯(lián)系人），副教授，E-mail：zyding@jiangnan.edu.cn