鄭 磊，何軍邀，2，黃 金，王 普

（1.浙江工業(yè)大學 藥學院，浙江 杭州 310032；2.浙江醫(yī)藥高等專科學校，浙江 寧波 315100）

利用產(chǎn)脂肪酶B的畢赤酵母工程菌生物拆分制備西司他丁關鍵手性中間體的體系優(yōu)化

鄭 磊1，何軍邀1，2，黃 金1，王 普1

（1.浙江工業(yè)大學 藥學院，浙江 杭州 310032；2.浙江醫(yī)藥高等專科學校，浙江 寧波 315100）

S-（+）-2，2-二甲基環(huán)丙烷甲酸（S-（+）-DMCPA）是合成西司他丁的關鍵手性中間體。構建的畢赤酵母工程菌生產(chǎn)的脂肪酶可高選擇性催化外消旋2，2-二甲基環(huán)丙烷甲酸乙酯（DMCPE）不對稱水解制備S-（+）-DMCPA。對該工程菌產(chǎn)胞外脂肪酶的產(chǎn)酶條件及生物拆分反應條件進行優(yōu)化，以提高其催化效率。優(yōu)化獲得重組畢赤酵母最佳產(chǎn)酶條件：采用BMMY培養(yǎng)基，培養(yǎng)基初始pH 8.0，500mL搖瓶裝50mL培養(yǎng)基，每隔4 h向培養(yǎng)基中補加終體積分數(shù)為1%的甲醇。培養(yǎng)192 h后，發(fā)酵液中脂肪酶比酶活為4.41 U/L，較優(yōu)化前提高了90.9%。利用含脂肪酶的發(fā)酵上清液進行DMCPE的生物拆分反應，底物濃度為15mmol/L，30℃反應36 h，S-（+）-DMCPA的產(chǎn)率可達43.8%，e.e.值為99.8%。

西司他??；畢赤酵母；脂肪酶；S-（+）-2，2-二甲基環(huán)丙烷甲酸；生物拆分

西司他丁是第一個應用于臨床的腎脫氫二肽酶抑制劑，S-（+）-2，2-二甲基環(huán)丙烷甲酸（S-（+）-DMCPA）是合成西司他丁的關鍵手性中間體［1-2］。目前，西司他丁手性中間體主要通過化學法合成，但存在污染大、合成條件苛刻等缺點［3-4］。由于生物催化法具有反應條件溫和、立體選擇性高和環(huán)境污染小等優(yōu)點，將其應用于藥物手性中間體的合成已逐漸成為研究熱點［1］。Wang等［5］從土壤中篩選得到可不對稱水解2，2-二甲基環(huán)丙烷甲腈制備S-（+）-2，2-二甲基環(huán)丙烷甲酸的菌株Rhodococcus sp.AJ270，產(chǎn)率達44%，e.e.值為88%。Yeom等［6］利用Rhodococcus erythropolis不對稱水解外消旋2，2-二甲基環(huán)丙烷甲腈合成S-（+）-DMCPA，產(chǎn)率為45%，e.e.值為81.8%。

筆者所在實驗室成員前期采用脂肪酶435催化2，2-二甲基環(huán)丙烷甲酸乙酯（DMCPE）不對稱水解合成西司他丁關鍵手性中間體S-（+）-DMCPA［7］，當脂肪酶435用量為16g/L、底物DMCPE濃度為65mmol/L時，以pH 7.2的1mol/L H3PO4緩沖液為反應介質(zhì)，30℃反應64 h，產(chǎn)物的產(chǎn)率和e.e.值分別為45.6%和99.2%。但由于商品脂肪酶價格較高，成為限制其工業(yè)化應用的重要因素之一［8］，利用微生物產(chǎn)脂肪酶替代商品脂肪酶將成為降低工業(yè)化應用成本的途徑之一。

脂肪酶廣泛存在于動植物和微生物中，由于微生物具有種類多、繁殖快、易發(fā)生遺傳突變等特點，目前微生物源脂肪酶已成為研究熱點。酵母菌是國內(nèi)外研究最多的微生物之一，且大部分酵母的發(fā)酵產(chǎn)物被認為對人體安全無害，因而酵母菌成為脂肪酶的重要來源之一，如來源于皺褶假絲酵母（Candida rugosa）和南極假絲酵母（Candida antarctica）的脂肪酶［9］。脂肪酶B是從南極假絲酵母中分離得到的一種具有高效專一性的脂肪酶［10］，目前已被克隆表達于多種宿 主，如 Aspergillus oryzae［11］、Pichia pastoris［12］、Saccharomyces cerevisiae［13］、Escherichia coli［14］和Yarrowia lipolytica［15］。 Liu 等［16］將 C.antarctica ZJB09193中的脂肪酶基因在P.pastoris X33中成功表達，并利用該脂肪酶催化合成維生素A酯。利用基因工程菌表達外源蛋白催化合成藥物手性中間體將成為醫(yī)藥工業(yè)的研究新方向。

筆者所在實驗室成員以Pichia pastoris為宿主菌株，以pPICZaA為表達載體，采用PCR裝配法，成功克隆表達了脂肪酶B基因，利用該重組菌產(chǎn)生的胞外脂肪酶可高選擇性催化外消旋DMCPE不對稱水解制備得到西司他丁關鍵手性中間體S-（+）-DMCPA。本研究中，筆者通過對該菌株的最佳產(chǎn)酶條件和生物拆分條件進行優(yōu)化，以期提高該菌株所產(chǎn)脂肪酶的催化效率，進而為后續(xù)的深入研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種

含脂肪酶B基因的畢赤酵母（Pichia pastoris）菌株（表達載體pPICZaA），由筆者所在實驗室成員自行構建、保藏。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 斜面培養(yǎng)基

酵母粉-蛋白胨-葡萄糖（YPD）培養(yǎng)基（g/L）：酵母浸出粉10，蛋白胨20，葡萄糖20，瓊脂粉15。

1.2.2 種子培養(yǎng)基

甘油基礎緩沖培養(yǎng)基（BMGY）（1 L）：無氨基酵母氮源（YNB）13.4g，500×生物素2mL，甘油10g，酵母浸出粉10g，蛋白胨20g，1mol/L pH 6.0磷酸鹽緩沖液100mL。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基

甲醇基礎緩沖培養(yǎng)基（BMMY）（1 L）：YNB 13.4g，500×生物素2mL，無水甲醇10mL，酵母浸出粉10g，蛋白胨20g，1mol/L pH 6.0磷酸鹽緩沖液100mL。

1.3 培養(yǎng)條件

將保藏菌種劃線轉接至YPD培養(yǎng)基上活化，30℃恒溫培養(yǎng)48 h，將單菌落接種至50mL BMGY培養(yǎng)基，200r/min、30℃振蕩培養(yǎng)至600nm的吸光度值OD600為2～6。

以10%的接種量將種子液接入裝有50mL BMMY培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，200r/min、30℃下，每24 h按培養(yǎng)基體積分數(shù)的1%補加無水甲醇，培養(yǎng)96 h后檢測發(fā)酵液中胞外脂肪酶的酶活。

1.4 產(chǎn)酶條件優(yōu)化

為了考察畢赤酵母工程菌的最佳產(chǎn)酶條件，分別對裝液量、發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH、補加甲醇濃度、甲醇添加時間間隔和產(chǎn)酶發(fā)酵時間進行優(yōu)化，實驗重復3次，每項優(yōu)化結果都用于后續(xù)實驗。

1.5 生物拆分DMCPE制備S-（+）-DMCPA的反應條件優(yōu)化

為了考察重組菌株所產(chǎn)脂肪酶不對稱拆分DMCPE制備S-（+）DMCPA的最佳反應條件，采用最佳產(chǎn)酶條件下培養(yǎng)得到的含酶發(fā)酵液，分別選取不同反應溫度（25～45℃）、底物濃度（10～30mmol/L）和反應時間進行生物拆分反應，氣相色譜法（GC）檢測得到S-（+）-DMCPA產(chǎn)率和e.e.值。實驗重復3次，每項優(yōu)化結果都用于以后的實驗。

1.6 檢測方法與酶活力定義

底物DMCPE和產(chǎn)物S-（+）-DMCPA的濃度和e.e.值采用氣相色譜法檢測，具體測定條件參照文獻［16］。

酶活力定義：在30℃下，1min內(nèi)不對稱水解DMCPE生成1 μmol S-（+）-DMCPA所需的酶量，定義為1個酶活單位（U）。

酶活力檢測方法：取10mL發(fā)酵上清液于50mL錐形瓶中，加入0.02g底物DMCPE，30℃、200r/min反應6 h。反應結束后，加入2倍體積的乙酸乙酯，30℃、200r/min振蕩萃取45min，靜置分層后取乙酸乙酯相檢測產(chǎn)物S-（+）-DMCPA的生成量，計算得到單位體積發(fā)酵液的脂肪酶酶活（U/L）。

2 結果與討論

2.1 產(chǎn)酶條件優(yōu)化

2.1.1 裝液量對產(chǎn)酶的影響

在發(fā)酵產(chǎn)酶時，培養(yǎng)基裝液量會影響搖瓶內(nèi)的溶氧水平，進而影響菌體生長和目的蛋白的表達。為了考察裝液量對產(chǎn)酶的影響，將種子液接至不同裝液量（25、50、75、100和150mL BMMY培養(yǎng)基）的500mL三角瓶中，按發(fā)酵培養(yǎng)條件對基因工程菌P.pastoris進行誘導培養(yǎng)，培養(yǎng)96 h后檢測發(fā)酵液中脂肪酶的酶活，結果如圖1所示。

由圖1可知：當裝液量為50mL時，比酶活達到最大值（2.31 U/L），繼續(xù)增加裝液量，酶活逐漸下降。原因可能是裝液量過少會增加發(fā)酵過程中發(fā)酵液的蒸發(fā)損失，使有害代謝物濃度上升，從而影響菌體的生長及脂肪酶的表達。適量增加裝液量可部分緩解上述問題，但裝液量過多會導致培養(yǎng)基中溶氧水平降低，影響菌體生長和蛋白表達。因此，最佳裝液量為500mL三角瓶中裝液50mL。

圖1 裝液量對產(chǎn)酶的影響Fig.1 Effect of loaded volume on enzyme activity

2.1.2 發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH對產(chǎn)酶的影響

重組畢赤酵母可在pH 3.0～7.0范圍內(nèi)正常生長，但外源蛋白表達的適宜pH隨著目的蛋白不同存在很大的差異。考察發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH對產(chǎn)酶的影響，將種子液接入初始 pH分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0的BMMY培養(yǎng)基中，按發(fā)酵液培養(yǎng)條件對基因工程菌P.pastoris進行誘導培養(yǎng)，96 h后檢測發(fā)酵液中脂肪酶的酶活，結果如圖2所示。

圖2 培養(yǎng)基初始pH對產(chǎn)酶的影響Fig.2 Effect of pH on enzyme activity

由圖2可知：培養(yǎng)基初始pH為8.0時比酶活最高（3.0 U/L）。當pH低于8.0時，脂肪酶酶活隨pH升高明顯增加，這可能是由于發(fā)酵過程中菌體產(chǎn)生的酸性代謝產(chǎn)物使發(fā)酵液酸性增強，從而影響細胞代謝和脂肪酶酶活。當pH高于8.0時，堿性條件會抑制畢赤酵母的生長，從而抑制脂肪酶的表達。故培養(yǎng)基初始pH以8.0為宜。

2.1.3 甲醇體積分數(shù)對產(chǎn)酶的影響

發(fā)酵培養(yǎng)階段，甲醇可作為重組畢赤酵母的C源和產(chǎn)酶誘導劑，誘導醇氧化酶（AOX）的合成［17］，因此，甲醇體積分數(shù)可能會影響胞外蛋白的表達量。按發(fā)酵液培養(yǎng)條件對基因工程菌P.pastoris進行誘導培養(yǎng)，每隔24 h按培養(yǎng)基體積分數(shù)的0.5%、0.75%、1.0%、1.25%、1.5%和2.0%補加無水甲醇，培養(yǎng)96 h后檢測發(fā)酵液中脂肪酶的酶活，結果如圖3所示。

圖3 甲醇體積分數(shù)對產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effect of methanol volume fraction on enzyme activity

由圖3可知：當甲醇體積分數(shù)為0.5%時，已有胞外脂肪酶的表達，但酶活較低，表明0.5%的甲醇不能有效維持重組畢赤酵母的菌體生長代謝及胞外蛋白表達。隨著甲醇體積分數(shù)的增加，脂肪酶活力逐漸提高；當甲醇體積分數(shù)為1.0%時，脂肪酶比酶活力最高（3.32 U/L）；繼續(xù)提高甲醇體積分數(shù)，脂肪酶比酶活力下降迅速，原因可能是甲醇積累抑制了細胞生長［18］。因此選擇甲醇的最佳誘導體積分數(shù)為1.0%。

2.1.4 甲醇添加時間間隔對產(chǎn)酶的影響

畢赤酵母含有2個AOX基因，分別為AOX1和AOX2，其中AOX1為強啟動子，細胞中絕大多數(shù)醇氧化酶活力由 AOX1提供［19］。將種子液接入BMMY培養(yǎng)基中，按發(fā)酵液培養(yǎng)條件對基因工程菌P.pastoris進行誘導培養(yǎng)，每隔4、8、12和24 h補加甲醇1次，培養(yǎng)96 h后檢測發(fā)酵液中脂肪酶的酶活，結果如圖4所示。

圖4 甲醇添加時間間隔對產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effects of time interval of adding methanol on enzyme activity

由圖4可知：在24 h內(nèi)甲醇添加總量不變的情況下，甲醇添加時間間隔為4 h時比酶活最高（4.06 U/L），隨著添加時間間隔的變大，酶活逐漸下降。這主要是由于重組畢赤酵母對甲醇濃度的瞬間變化較敏感，甲醇濃度頻繁波動會導致AOX1活力降低，并可能導致細胞死亡，因此維持發(fā)酵液中甲醇濃度相對穩(wěn)定對提高重組蛋白的誘導表達有重要意義［20-21］。

2.1.5 培養(yǎng)時間對酶活的影響

按發(fā)酵液培養(yǎng)條件對基因工程菌P.pastoris進行誘導培養(yǎng)，每隔24 h取樣檢測發(fā)酵液中脂肪酶的酶活，分別培養(yǎng)24、48、72、96、120、144、168、192和216 h，考察培養(yǎng)時間對產(chǎn)酶的影響，結果如圖5所示。

圖5 發(fā)酵時間對產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effect of fermentation time on enzyme activity

由圖5可知：隨著發(fā)酵時間的延長，脂肪酶活力逐漸提高，在192 h時比酶活最高（4.41 U/L），比優(yōu)化前（2.31 U/L）提高90.9%。192 h后有所下降，推測為菌體密度大、營養(yǎng)缺乏、酵母細胞衰老、表達外源蛋白能力減弱，酵母細胞分泌的蛋白酶積累，降解外源蛋白，從而導致酶活下降［22］。因此，確定最佳發(fā)酵時間為192 h。據(jù)文獻［2］報道，脂肪酶435比酶活為0.92 U/g，因此，每升該發(fā)酵液酶活力相當于4.79g脂肪酶435酶活力。

2.2 生物拆分制備S-（+）-DMCPA的條件優(yōu)化

2.2.1 反應溫度對拆分產(chǎn)率和e.e.值的影響

反應溫度在手性拆分過程中對酶活力以及對映體選擇性具有關鍵作用。考察不同溫度（25、30、35、40和45℃）對產(chǎn)物S-（+）-DMCPA產(chǎn)率和e.e.值的影響，結果如圖6所示。

由圖6可知：當溫度為30℃時，S-（+）-DMCPA產(chǎn)率最高。隨著溫度升高，產(chǎn)率逐漸下降，這可能是由于高溫導致脂肪酶失活。而e.e.值隨溫度變化不大，均在99%以上。因此最佳反應溫度為30℃。

圖6 溫度對拆分產(chǎn)率和e.e.值的影響Fig.6 Effects of temperature on yield and e.e.value of S-（+）-DMCPA

2.2.2 底物濃度對產(chǎn)率和e.e.值的影響

底物濃度越高，酶與底物接觸的幾率就越高，反應也越充分；當?shù)孜餄舛容^低時，酶催化反應速度與底物濃度成正比，反應速度隨著底物濃度的增加而加快。當?shù)孜餄舛瘸^一定值后，反應速度的上升與底物濃度不再成正比，而是逐漸趨向平衡，此時繼續(xù)增大底物濃度已無意義。為此，考察不同底物濃度（10、15、20、25和30mmol/L）對產(chǎn)物S-（+）-DMCPA產(chǎn)率和 e.e.值的影響，結果如圖 7所示。

圖7 底物濃度對拆分產(chǎn)率和e.e.值的影響Fig.7 Effects of substrate concentration on yield and e.e.value of S-（+）-DMCPA

由圖7可知：當?shù)孜餄舛鹊陀?5mmol/L時，S-（+）-DMCPA產(chǎn)率均保持在40%以上，e.e.值為99%以上。繼續(xù)增加底物濃度，產(chǎn)率降低，綜合考慮產(chǎn)率和e.e.值，選擇最適底物濃度為15mmol/L。底物濃度高于 Wang等［5］報道的利用 Rhodococcus sp.AJ270不對稱水解1mmol/L的2，2-二甲基環(huán)丙烷甲腈制備S-（+）-DMCPA，產(chǎn)物e.e.值也優(yōu)于其報道的88%。

2.2.3 反應時間對產(chǎn)率和e.e.值的影響

為考察反應時間對產(chǎn)率和e.e.值的影響，反應8 h后每隔4 h取樣檢測，考察產(chǎn)物產(chǎn)率和e.e.值隨時間的變化規(guī)律，結果如圖8所示。

圖8 反應時間對產(chǎn)率和e.e.值的影響Fig.8 Effects of time course on yield and e.e.value of S-（+）-DMCPE

由圖8可知：S-（+）-DMCPA產(chǎn)率隨著時間的延長而增高，e.e.值均在99%以上，36 h時產(chǎn)率最大，為43.8%，產(chǎn)物濃度達6.6mmol/L。繼續(xù)延長反應時間未能提高產(chǎn)率，綜合考慮產(chǎn)率和e.e.值，選擇反應時間為36 h。

3 結論

利用工程菌產(chǎn)生的胞外脂肪酶催化外消旋2，2-二甲基環(huán)丙烷甲酸乙酯不對稱水解合成西司他丁關鍵手性中間體S-（+）-2，2-二甲基環(huán)丙烷甲酸。當500mL三角瓶裝液量為50mL，發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH為8.0，產(chǎn)酶培養(yǎng)過程中每隔4 h向培養(yǎng)基中補加終體積分數(shù)為1.0%的甲醇，200r/min、30℃下誘導發(fā)酵192 h，酶活可達到4.41 U/L，較優(yōu)化前（2.31 U/L）提高90.9%。優(yōu)化獲得最佳轉化條件：200r/min、30℃、底物濃度15mmol/L、反應36 h，產(chǎn)物S-（+）-DMCPA產(chǎn)率為43.8%，e.e.值為99.8%。

采用重組脂肪酶催化DMCPE不對稱水解合成西司他丁關鍵手性中間體S-（+）-DMCPA，與采用產(chǎn)胞內(nèi)脂肪酶的全細胞催化相比，以含胞外脂肪酶的發(fā)酵上清液直接催化具有預處理簡單、反應過程中傳質(zhì)阻力小等優(yōu)點；與脂肪酶435的催化相比，具有成本低廉的優(yōu)點。但目前工藝仍然存在菌體產(chǎn)酶周期較長、催化水解的底物濃度較低等缺點，如何縮短菌體培養(yǎng)時間、提高底物濃度及脂肪酶重復利用將會成為后續(xù)的研究方向。

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（責任編輯 管 珺）

Process optimization catalyzed by recombinant Pichia patoris derived lipase B for the synthesis of cilastatin

ZHENG Lei1，HE Junyao1，2，HUANG Jin1，WANG Pu1
（1.College of Pharmaceutical Science，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310032，China；2.Zhejiang Pharmaceutical College，Ningbo 315100，China）

S-（+）-2，2-dimethylcyclopropane carboxylic acid （S-（+）-DMCPA） is a key chiral intermediate for the synthesis of cilastatin.A recombinant Pichia patoris can convert racemic ethyl-2，2-dimethylcyclopropane carboxylate（DMCPE）to S-（+）-DMCPA with high enantioselectivity.In order to enhance its catalytic efficiency，the lipase-producing conditions and catalytic conditions were optimized. The optimal conditions for lipase production were as follows：the optimal loaded volume was 50mL/500mL，initial pH of fermentation medium was 8.0.Methanol was added into the medium to a final concentration of 1%（V/V）at every 4 h intervals.Under the optimal conditions，the lipase activity of the recombinant reached 4.41 U/L within 192 h，with an increase of 90.9%compared to the control.The supernatant containing lipase was then used for biocatalytic resolution of DMCPE to S-（+）-DMCPA at 15mmol/L substrate concentration at 30℃ for 36 h.Under above conditions，the best yield of 43.8%was obtained with enantiomeric excess（e.e.）value of 99.8%.

cilastatin；Pichia pastoris；lipase；S-（+）-2，2-dimethylcyclopropane carboxylic acid；biocatalytic resolution

Q815

A

1672-3678（2015）03-0070-06

10.3969/j.issn.1672-3678.2015.03.013

2014-03-26

浙江省科技廳重大科技攻關項目（2010C11040）；浙江省級公益性技術應用研究計劃（2011C33005）；浙江省教育廳科研項目（Y201226056）

鄭 磊（1989—），男，浙江杭州人，碩士研究生，研究方向：生物催化與手性合成；王 普（聯(lián)系人），教授，E-mail：wangpu@zjut.edu.cn