邵文堯，邱隆輝，郭 靜，胡超群

（廈門大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，福建 廈門 361005）

天然?；撬岬碾x子色譜分析方法研究

邵文堯，邱隆輝，郭 靜，胡超群

（廈門大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，福建 廈門 361005）

通過(guò)考察實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性、精確度及回收率等，研究不同氨基酸對(duì)?；撬釞z測(cè)的干擾，成功建立了離子色譜法分離?；撬崽荻认疵摮绦?，探索出一種更高效、更快速、更靈敏的離子色譜檢測(cè)方法。色譜柱為氨基酸分析柱（AminoPac PA-10，2 mm×250 mm）、氨基酸保護(hù)柱（AminoPac PA-10 2 mm×50 mm）；流動(dòng)相組成為流動(dòng)相A（純水）、流動(dòng)相B（250mmol/L NaOH溶液），流動(dòng)相C（1.0mmol/L乙酸鈉（NaOAc）），進(jìn)行梯度洗脫；流速為0.24mL/min；柱溫為30℃；采用積分脈沖安培檢測(cè)器檢測(cè)；進(jìn)樣量為25 μL。該法優(yōu)化了牛磺酸的檢測(cè)時(shí)間，提高了?；撬岬臋z測(cè)效率，可運(yùn)用于實(shí)驗(yàn)和生產(chǎn)中。

牛磺酸；離子色譜；穩(wěn)定性；精確度；回收率

?；撬幔╰aurine，NH2CH2CH2SO3H）是一種含硫的非蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)氨基酸，氨基在β位，與普通氨基酸存在本質(zhì)區(qū)別，具有很強(qiáng)的生物活性，被廣泛應(yīng)用于保健食品和醫(yī)藥領(lǐng)域［1-3］。牛磺酸天然品除存在于牛膽汁中，還以游離形式分布于動(dòng)物體的各組織、器官中，特別在肌肉組織、神經(jīng)組織、視網(wǎng)膜中含量較高，在海生動(dòng)物中含量尤為豐富。目前，天然提取法是?；撬崽崛〉陌l(fā)展新方向，但傳統(tǒng)的天然提取法需要將水產(chǎn)原料軟體部分打漿，水產(chǎn)品無(wú)法得到綜合利用［4-6］。我國(guó)海洋資源豐富，章魚是其中一種應(yīng)用甚廣的水產(chǎn)品原料，然而在章魚加工中，其下腳料通常都被遺棄。在這些下腳料中，游離態(tài)天然?；撬岬暮扛哌_(dá)1.03%，是牛磺酸含量最高的水產(chǎn)品之一，且原料來(lái)源廣泛、安全，具有較好的發(fā)展前景［7］。近年來(lái)離子色譜在氨基酸檢測(cè)方面已日臻成熟，分析速度快，通常幾分鐘至十幾分鐘；檢測(cè)靈敏度高，檢測(cè)限可達(dá) 10-12～10-8mmol/L［8-9］；選擇性好，對(duì)于非離子性物質(zhì)無(wú)保留；可以實(shí)現(xiàn)多離子同時(shí)分析；離子色譜柱的穩(wěn)定性高，使用壽命長(zhǎng)［10-11］。

基于此，筆者以離子色譜法建立一種快速、高效、準(zhǔn)確的天然牛磺酸定量檢測(cè)方法，以此來(lái)跟蹤分析海洋低值產(chǎn)品中天然?；撬岬奶崛》椒?，用于章魚加工副產(chǎn)物天然?；撬岬臋z測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與試劑

ICS-90型離子色譜儀，美國(guó)戴安公司；5418 R型冷凍離心機(jī)，Eppendorf公司；超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

色譜柱：氨基酸分析柱（AminoPac PA-10，2 mm×250 mm）、氨基酸保護(hù)柱（AminoPac PA-10，2 mm×50 mm）；流動(dòng)相：流動(dòng)相A為水、流動(dòng)相B為250mmol/L NaOH溶液、流動(dòng)相C為1.0mmol/L乙酸鈉（NaOAc），進(jìn)行梯度洗脫；流速為 0.24mL/min；柱溫為30℃；檢測(cè)方法為積分脈沖安培檢測(cè)器；進(jìn)樣量為25 μL。

?；撬針?biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于Sigma-Aldrich公司。其他各種無(wú)機(jī)鹽及試劑購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，均為分析純。

章魚提取液：取3 kg章魚下腳料分多次用攪碎機(jī)進(jìn)行絞碎處理，倒入玻璃加熱釜，把相連著的熱循環(huán)機(jī)加熱設(shè)定到80℃，同時(shí)開(kāi)啟循環(huán)設(shè)定，用電磁爐加熱12 L純水，加熱到90℃左右時(shí)倒入玻璃加熱釜，待溫度到達(dá)80℃后打開(kāi)旋轉(zhuǎn)攪拌器（150r/min），攪拌1 h。

1.1.2 標(biāo)準(zhǔn)品及樣品溶液的制備

1）標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制 稱取?；撬針?biāo)準(zhǔn)品0.5g于100mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得5mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。取儲(chǔ)備液0.8mL于50mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得 80 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。

2）供試品溶液的制備 量取18種標(biāo)樣：L-丙氨酸、NH4Cl、L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-胱氨酸、L-谷氨酸、甘氨酸、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-酪氨酸和L-纈氨酸各0.038 μmol，置于100mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，得空白供試液即標(biāo)準(zhǔn)氨基酸混合液。量取空白供試液1mL，置于100mL容量瓶中，量取5mg/mL標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液1mL，置于上述容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，得標(biāo)準(zhǔn)品供試液，即標(biāo)準(zhǔn)品與標(biāo)準(zhǔn)氨基酸溶液的混合液。

3）樣品溶液 量取已處理的章魚提取液5mL，置50mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得樣品溶液。

1.2 方法

1.2.1 專屬性試驗(yàn)——洗脫條件優(yōu)化

［12-14］設(shè)計(jì)了一組?；撬岬奶荻认疵摮绦颍?jiàn)表1。量取5mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液、空白供試液和標(biāo)準(zhǔn)品供試液各5mL，過(guò)0.45μm水系膜備用，精密吸取上述過(guò)濾液各0.25 μL，在前述色譜條件下，用表1中的離子色譜法分離?；撬崽荻认疵摮绦蜻M(jìn)行檢測(cè)。

表1 離子色譜法分離?；撬崽荻认疵摮绦騎able 1 The elution program of taurine byion chromatography

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

量取5mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液0.1、0.2、0.4、1、2、4和8mL，置于100mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度為5、10、20、50、100、200和400 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。量取上述各濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液5mL，過(guò)0.45μm水系膜備用，吸取上述過(guò)濾液各0.25 μL，在前述色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，以質(zhì)量濃度（ρ）為橫坐標(biāo)，峰面積（A）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。

1.2.3 精密度試驗(yàn)

量取80 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液5mL，過(guò)0.45μm水系膜備用，吸取過(guò)濾液0.25 μL，在前述色譜條件下連續(xù)、重復(fù)進(jìn)樣6次。

1.2.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

量取80 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液5mL，過(guò)0.45μm水系膜備用，吸取過(guò)濾液0.25 μL，在前述色譜條件下，分別于過(guò)濾后 0、2、4、8、16、24和 48 h進(jìn)樣。

1.2.5 檢測(cè)限與定量限測(cè)定

按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法進(jìn)行測(cè)定。

1.2.6 回收率試驗(yàn)

量取1mL樣品5份于小燒杯中，加入7mL水，分別加入50 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液2mL后超聲2min，使之充分混合。量取上述各混合溶液5mL，過(guò)0.45μm水系膜備用，吸取上述過(guò)濾液0.25 μL，在前述色譜條件下進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 專屬性試驗(yàn)結(jié)果

由于實(shí)驗(yàn)樣品溶液為章魚下腳料的濃縮液，含有多種氨基酸，用離子色譜法進(jìn)行分離檢測(cè)時(shí)會(huì)受到干擾，所以先要進(jìn)行專屬性實(shí)驗(yàn)確定牛磺酸在離子色譜中的出峰時(shí)間。用離子色譜法分離?；撬崽荻认疵摮绦颍ū?）進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 ?；撬針?biāo)準(zhǔn)品的離子色譜Fig.1 Ion chromatogram of taurine standard substance

圖2 ?；撬峥瞻自囈汉蜆?biāo)準(zhǔn)品供試液的離子色譜Fig.2 Ion chromatogram of taurine blank test solution and standard test solution

由圖1可知：?；撬岬某龇鍟r(shí)間為17.97min。由圖2可知：空白供試液中的8種氨基酸無(wú)干擾，專屬性良好。

當(dāng)流動(dòng)相中NaOH比例提高時(shí)，?；撬岬某龇鍟r(shí)間提前，空白供試液中的氨基酸對(duì)?；撬岬臋z測(cè)依然不存在干擾，專屬性良好。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖3為離子色譜法檢測(cè)?；撬岬臉?biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為y=0.136 4x+2.052 5，R2=0.997。由圖3可知，?；撬嵩?～400 μg/mL的范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

圖3 離子色譜法檢測(cè)牛磺酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of taurine detected by ion chromatography

2.3 精密度試驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)的精密度試驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，重復(fù)進(jìn)樣 6次的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.6%，說(shuō)明儀器精密度良好。

表2 ?；撬峋芏葘?shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of precision test

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

穩(wěn)定性試驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，48 h內(nèi)樣品檢測(cè)RSD為1.14%，說(shuō)明樣品在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 檢測(cè)限與定量限測(cè)定

檢測(cè)限與定量限測(cè)定的結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知：當(dāng)牛磺酸的質(zhì)量濃度為5 μg/mL時(shí)的信噪比為3.2（大于3），因此確定其檢測(cè)限在5 μg/mL左右；當(dāng)?；撬岬馁|(zhì)量濃度為10 μg/mL時(shí)，信噪比為18.6（大于10），由此確定其定量限在10 μg/mL左右。

表3 牛磺酸穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of stability test

表4 ?；撬釞z測(cè)限和定量限實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of LOD and LOQ test

2.6 回收率試驗(yàn)

表5為回收率試驗(yàn)結(jié)果。由表5可知：平均回收率為98.192%，RSD為2.8%，說(shuō)明儀器的回收效果良好。

表5 ?；撬針悠坊厥章蕦?shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results ofrecovery rate test

2.7 樣品的檢測(cè)

圖4和圖5分別是離子色譜法檢測(cè)?；撬針悠穲D和離子色譜法檢測(cè)牛磺酸原液樣品的色譜。

由圖4、圖5看出，此種離子色譜法檢測(cè)樣品，牛磺酸出峰時(shí)間為17.967min，原液樣品牛磺酸出峰時(shí)間為17.168min，樣品稀釋與否對(duì)出峰時(shí)間沒(méi)有影響。

圖4 ?；撬針悠返碾x子色譜Fig.4 Ion chromatography of taurine sample

圖5 牛磺酸原液樣品的離子色譜Fig.5 Ion chromatography of taurine stock solution

3 結(jié)論

考察離子色譜法檢測(cè)天然?；撬?，利用梯度洗脫程序達(dá)到分析檢測(cè)的目的。色譜柱：氨基酸分析柱（AminoPac PA-10，2 mm×250 mm）、氨基酸保護(hù)柱（AminoPac PA-10，2 mm×50 mm）；流動(dòng)相：流動(dòng)相A為水、流動(dòng)相B為250mmol/L NaOH溶液、流動(dòng)相C為1.0mmol/L NaOAc，進(jìn)行梯度洗脫；流速為0.24mL/min；柱溫為30℃；檢測(cè)方法為積分脈沖安培檢測(cè)器；進(jìn)樣量為25 μL。進(jìn)一步結(jié)合穩(wěn)定性試驗(yàn)、精確度試驗(yàn)及回收率試驗(yàn)等，表明該離子色譜法具有高效、快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，可用于實(shí)驗(yàn)和生產(chǎn)。但是本文中離子色譜檢測(cè)方法的建立過(guò)程中檢測(cè)限和定量限偏高，有待進(jìn)一步探索實(shí)驗(yàn)方法以提高該方法的靈敏度。

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（責(zé)任編輯 荀志金）

Rapiddetection of taurine by ion chromatography

SHAO Wenyao，QIU Longhui，GUO Jing，HU Chaoqun
（College of Chemistry and Chemical Engineering，Xiamen University，Xiamen 361005，China）

A more efficient，more rapid and more sensitive ion chromatography detection program was established to detect taurine in experiment and production.The conditions were as follows：amino acid analysis column（AminoPac PA-10，2 mm×250 mm），amino acid protection column（AminoPac PA-10，2 mm×50 mm），mobile phase（the mobile phase A was pure water，the mobile phase B was 250mmol/L NaOH solution，the mobile phase C was 1.0mmol/L sodium acetate（NaOAc）），gradient elution，flow rate（0.24mL/min），column temperature（30℃），integrated pulsed amperometric detection with injection volume of 25 μL.We have successfully established the gradient elution program in ion chromatography to separate taurine.The present ion chromatography method for detection taurine was efficient，rapid，accurate and the detection time was greatly improved.

taurine；ion chromatography；stability；precision；recovery

Q819

A

1672-3678（2015）03-0064-06

10.3969/j.issn.1672-3678.2015.03.012

2014-08-16

國(guó)家自然科學(xué)基金（21406185）

邵文堯（1980—），男，福建廈門人，碩士，工程師，研究方向：天然產(chǎn)物應(yīng)用開(kāi)發(fā)，E-mail：wyshao@xmu.edu.cn