吳清林，鄒水洋，陳雁

（東莞理工學院化學與環(huán)境工程學院，廣東東莞523808）

米根霉生料發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的研究

吳清林，鄒水洋*，陳雁

（東莞理工學院化學與環(huán)境工程學院，廣東東莞523808）

為降低生產(chǎn)成本，以大米粉為原料，采用米根霉NRRL395生料發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸。考察了青霉素鈉、青霉素V鉀、硫酸鏈霉素、土霉素等4種抗生素在生料發(fā)酵中的作用及不同接種方式等對發(fā)酵產(chǎn)酸的影響。實驗結果表明，4種抗生素都能起到較好的抑制雜菌、促進乳酸發(fā)酵的作用，其中以160萬單位/L青霉素鈉效果最為顯著。采用菌絲體接種的乳酸產(chǎn)量高于孢子液接種，采用同步糖化發(fā)酵法的生產(chǎn)成本及乳酸產(chǎn)量均優(yōu)于常規(guī)的分步糖化發(fā)酵法。在初步優(yōu)化的培養(yǎng)條件下，120 g/L大米粉發(fā)酵后乳酸產(chǎn)量最高達到67.80 g/L，相應的乳酸轉(zhuǎn)化率為76.45%，展示了米根霉生料發(fā)酵技術生產(chǎn)乳酸的實踐可行性及其廣闊的發(fā)展前景。

米根霉；L-乳酸；生料發(fā)酵；抗生素

生料發(fā)酵是指各種原料不經(jīng)過蒸煮、糊化直接將生料淀粉質(zhì)原料進行糖化和發(fā)酵的過程。與傳統(tǒng)熟料發(fā)酵相比，生料發(fā)酵條件溫和，免除了原料的蒸煮、攪拌、輸送，冷卻水的使用和發(fā)酵設備的滅菌等，節(jié)省了大量的能源及成本費用［1］。生料發(fā)酵在釀酒和制醋等領域已得到廣泛研究應用［2-3］，然而生料發(fā)酵生產(chǎn)乳酸的技術還罕見有文獻報道。

米根霉NRRL395是一株生產(chǎn)L-乳酸的優(yōu)良菌株，具有產(chǎn)物光學純度高、營養(yǎng)需求簡單、產(chǎn)物容易提純等優(yōu)點，受到眾多國內(nèi)外研究者關注［4-6］。我們在研究中發(fā)現(xiàn)該菌株還具有很強的產(chǎn)生淀粉酶的能力，它既能利用糖，也可以利用淀粉質(zhì)原料直接發(fā)酵生成L-乳酸，利用米根霉NRRL395的這一特點可為生料發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸提供一條新的途徑。

發(fā)酵基質(zhì)中淀粉酶活力與雜菌抑制措施是決定生料發(fā)酵成功與否的關鍵因素。米根霉NRRL395發(fā)酵產(chǎn)乳酸的適宜溫度在27℃～33℃，在未經(jīng)殺菌的基質(zhì)中存在各種雜菌，其中一些細菌在此溫度范圍內(nèi)與米根霉NRRL395強烈競爭營養(yǎng)物質(zhì)并產(chǎn)生各種副產(chǎn)物，而一般真菌生長速度遠不及米根霉NRRL395。我們的抑菌策略是：在采用優(yōu)質(zhì)無霉變原料的前提下，一方面采用相對較低的發(fā)酵溫度（28℃對米根霉相對有利），另一方面用常見的抗生素抑菌。本文將對幾種常見抗生素在米根霉生料發(fā)酵中的作用以及接種方式的影響等進行探討。

1材料與方法

1.1材料

菌種：米根霉（Rhizopus oryzae）NRRL395。斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）。液體種子培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖100，（NH4）2SO45，KH2PO40.4，MgSO40.2，ZnSO4.7H2O 0.05，115℃滅菌20 min。發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：大米粉（市售）120，尿素1，KH2PO40.2，MgSO40.1，ZnSO4.7H2O 0.05，CaCO3100?？股兀鹤⑸溆们嗝顾剽c中諾藥業(yè)（石家莊）有限公司；青霉素V鉀片長春海外制藥集團有限公司；注射用硫酸鏈霉素華北制藥股份有限公司；土霉素片廣東華南藥業(yè)；α-淀粉酶廣東環(huán)凱生物科技有限公司。其它化學試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2主要設備

TDL-S-A多管離心機：南京曉曉儀器設備有限公司；HQL300B柜式恒溫冷凍搖床：武漢中科科儀技術發(fā)展有限責任公司；SectrumLap20可見光分光光度計：上海凌光技術有限公司；LDZX-40KB立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；SPX-250型生化培養(yǎng)箱：上海躍進醫(yī)療器械廠；FA2104電子天平：上海恒平科學儀器有限公司。

1.3實驗方法

1）斜面菌種培養(yǎng)：將米根霉接種到PDA培養(yǎng)基斜面上，于28℃下培養(yǎng)5 d～7 d長滿黑色孢子后冷藏。

2）菌絲體種子液的制備：取米根霉孢子一環(huán)接種于液體種子培養(yǎng)基，250 mL錐形瓶裝液量50 mL，于28℃、150 r/min搖瓶培養(yǎng)24 h。

3）孢子液的制備：將長滿黑色孢子的米根霉斜面菌種加入100 mL的無菌生理鹽水稀釋，制成約含有108個米根霉孢子的孢子懸浮液。

4）同步糖化發(fā)酵：取種子液（或孢子液）按10%接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，250 mL錐形瓶裝液量50 mL，按劑量加入各種抗生素，于28℃、150 r/min搖瓶培養(yǎng)72 h，發(fā)酵液經(jīng)4 000 r/min離心分離，取上清液測定還原糖（殘?zhí)牵┘叭樗岷?。文中除特別標明外，一般按同步糖化發(fā)酵法進行實驗。

5）分步糖化發(fā)酵：在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入0.05 g α-淀粉酶混合均勻后，于恒溫水浴鍋70℃保溫1 h，其余步驟與同步糖化發(fā)酵法相同。

1.4分析測試

1.4.1還原糖（殘?zhí)牵y定

用3，5-二硝基水楊酸（DNS）比色法測定發(fā)酵液中還原糖（殘?zhí)牵┖俊?/p>

1.4.2大米粉水解物總糖含量的測定

采用酸解法將大米粉中淀粉水解完全后用3，5-二硝基水楊酸（DNS）比色法測定還原糖含量，測得1.000 g大米粉水解物總糖含量為0.739 g，以下乳酸轉(zhuǎn)化率的計算以此為基準。

1.4.3乳酸的測定

L-乳酸鈣用EDTA滴定法測定，游離乳酸采用酸堿滴定法測定。

乳酸的轉(zhuǎn)化率［4］/%=發(fā)酵液乳酸產(chǎn)量/培養(yǎng)基中大米粉水解物總糖含量×100。

2結果與討論

2.1抗生素種類與劑量對發(fā)酵的影響

本實驗將青霉素鈉、青霉素V鉀、硫酸鏈霉素、土霉素等4種抗生素按2萬單位/L～240萬單位/L的劑量加入培養(yǎng)基，考察抗生素種類與劑量對乳酸發(fā)酵的影響，實驗結果如圖1所示。

圖1　抗生素種類與劑量對乳酸產(chǎn)量的影響Fig.1Effect of dosage of various antibiotics on lactic acid yield

圖1的結果表明，隨著4種抗生素劑量的提高，乳酸產(chǎn)量不斷增加，且都在160萬單位/L左右達到產(chǎn)酸峰值。添加的4種抗生素都能使乳酸產(chǎn)量提高，其中青霉素鈉的效果最好，乳酸產(chǎn)量達到65.01 g/L，相應的乳酸轉(zhuǎn)化率為73.31%?？股貏┝繕O低時，發(fā)酵物有明顯的異臭味，這是雜菌大量繁殖的表現(xiàn)；隨著抗生素劑量的提高，異臭味消失，表明基質(zhì)中雜菌受到抑制，米根霉得到優(yōu)勢生長。但將抗生素劑量繼續(xù)增加到240萬單位/L，乳酸產(chǎn)量反而下降，可能是過高濃度的抗生素也會抑制米根霉的生長或代謝，其真實原因還有待進一步研究。

發(fā)酵液殘?zhí)呛咳鐖D2所示。

圖2　抗生素種類與劑量對殘?zhí)呛康挠绊慒ig.2Effect of dosage of various antibiotics on residual sugar content

在160萬單位/L抗生素劑量時殘?zhí)呛窟_到最低值。從理論上講，米根霉對還原糖的利用速度應快于雜菌，因為在供氧充足的狀態(tài)下，米根霉將葡萄糖轉(zhuǎn)化為乳酸的過程發(fā)生在糖酵解階段，而雜菌在好氧狀態(tài)下對葡萄糖的利用還需通過三羧酸循環(huán)。圖1、圖2顯示，殘?zhí)牵ㄟ€原糖）與乳酸的變化規(guī)律之間有很好的相關性，即殘?zhí)窃降停樗岙a(chǎn)量則越高。在生料發(fā)酵體系中，米根霉與雜菌會形成復雜的彼此消長的生態(tài)關系。由于米根霉分泌的淀粉酶水解淀粉產(chǎn)生還原糖的速度很快，可為米根霉及雜菌提供豐富的碳源生長，當抗生素劑量較低時必使雜菌較多，導致米根霉生長受到抑制；當抗生素劑量較大時，情況恰好相反。以上實驗初步確定了4種抗生素的最佳劑量為160萬單位/L，以下實驗均按此劑量加入抗生素。

2.2不同接種方式對發(fā)酵的影響

米根霉接種方式有兩種：菌絲體接種與孢子接種，不同的接種方式可能導致不同的發(fā)酵效果。不同接種方式對發(fā)酵的影響如圖3所示。

圖3　不同接種方式對乳酸產(chǎn)量的影響Fig.3Effect of inoculation method on lactic acid yield

在添加抗生素的基質(zhì)中，采用菌絲接種方式所得乳酸的產(chǎn)量較孢子接種方式高出7%～11%。其中添加青霉素鈉并采用菌絲接種的發(fā)酵取得了很好的效果，乳酸產(chǎn)量達到67.80 g/L，相應的乳酸轉(zhuǎn)化率為76.45%，達到了文獻報道的較高水平。發(fā)酵液殘?zhí)堑暮颗c上文情況相似，見圖4。

圖4　不同接種方式對殘?zhí)呛康挠绊慒ig.4Effect of inoculation method on residual sugar content

乳酸產(chǎn)量越高，殘?zhí)窃降汀＞z接種發(fā)酵不需孢子萌發(fā)的時間，米根霉在基質(zhì)中可以較快生長，在抗生素的作用下與雜菌競爭更具優(yōu)勢，因而乳酸產(chǎn)量也更高。不論哪種接種方式，不加抗生素的對照組只能得到很少的乳酸，再次表明了抗生素在生料發(fā)酵中所起的重要作用。

2.3分步糖化發(fā)酵法和同步糖化發(fā)酵法的比較

以上實驗中淀粉的糖化與發(fā)酵實際上是同步進行的，即所謂同步糖化發(fā)酵（SSF）。很多文獻用淀粉類原料發(fā)酵生產(chǎn)乳酸的工藝都采用分步糖化發(fā)酵（SHF），即先將淀粉類原料在適當條件下通過外源淀粉酶水解獲得還原糖，再進行乳酸發(fā)酵。我們以前的研究發(fā)現(xiàn)滅菌基質(zhì)發(fā)酵SHF比SSF能獲得更高的乳酸產(chǎn)量［7-8］，因此本實驗對生料SHF法生產(chǎn)乳酸進行嘗試，實驗結果如圖5所示。

圖5　分步糖化發(fā)酵法生產(chǎn)乳酸的效果Fig.5Production of lactic acid with separate hydrolysis and fermentation

在SHF法中抗生素的作用仍然是不可或缺的，比對照組（不加抗生素）的乳酸產(chǎn)量高出7倍以上。但與SSF法相比，SHF法乳酸產(chǎn)量下降約12%～18%。

SHF法用外源淀粉酶預先對淀粉進行了充分的糖化處理，原料利用率更高，這是滅菌發(fā)酵中SHF法比SSF法能獲得更高乳酸產(chǎn)量的原因。但在本實驗進行的生料發(fā)酵中情況卻相反。我們認為，淀粉的預先糖化處理固然可增加原料的利用率，但預處理獲得的大量還原糖無疑也是雜菌良好的營養(yǎng)物，在營養(yǎng)豐富的環(huán)境中，抗生素的滅菌（抑菌）效果會削弱。在SSF法中，還原糖是在米根霉分泌的淀粉酶的作用下逐步釋放的，低濃度的還原糖成為米根霉與雜菌競爭的營養(yǎng)限制因子，加上抗生素的選擇性抑菌作用使米根霉得到優(yōu)勢生長而雜菌受到更有效抑制。在米根霉生料發(fā)酵生產(chǎn)乳酸的工藝中，采用SHF法不但增加成本（外源酶和能耗），而且不利于乳酸發(fā)酵。

3結論

青霉素鈉、青霉素V鉀、硫酸鏈霉素、土霉素等4種抗生素應用于米根霉NRRL395生料大米粉發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的工藝中都能起到較好的抑制雜菌、促進乳酸發(fā)酵的作用，其中以160萬單位/L青霉素鈉效果最為顯著。采用菌絲體接種進行生料發(fā)酵的乳酸產(chǎn)量高于孢子液接種發(fā)酵。采用常規(guī)的分步糖化發(fā)酵法不但增加生產(chǎn)成本，而且不利于乳酸發(fā)酵。在初步優(yōu)化的培養(yǎng)條件下，120 g/L大米粉經(jīng)米根霉NRRL395生料發(fā)酵的乳酸產(chǎn)量最高達到67.80 g/L，相應的乳酸轉(zhuǎn)化率為76.45%，初步展示了米根霉生料發(fā)酵技術生產(chǎn)乳酸的實踐可行性及其廣闊的發(fā)展前景。

［1］阮彩彪，何建，李文華.生料發(fā)酵技術應用概述［J］.中國釀造，2010（1）:4-8

［2］鍛鋼，許宏賢.大米生料發(fā)酵酒精生產(chǎn)的研究［J］.食品與生物技術學報，2008，27（1）:95-102

［3］胡海賓，黃環(huán)宇，劉學文，等.生料固態(tài)發(fā)酵制醋新工藝的研究［J］.食品研究與開發(fā)，2008，29（2）:85-88

［4］徐忠義，閆巧娟，江正強，等.米根霉高效利用玉米淀粉生產(chǎn)乳酸的發(fā)酵條件優(yōu)化［J］.食品科學，2012，33（5）:150-154

［5］Bulut S，Elibol M，Ozer D.Effect of different carbon sources on L（+）-lacticacid production by Rhizopus oryzae［J］.BiochemicalEngineering Journal，2004，21（1）:33-37

［6］Yao W，Wu X，Zhu J，et al.Utilization of protein extract from dairy manure as a nitrogen source by Rhizopus oryzae NRRL-395 for L-lactic acid production［J］.Bioresource Technology，2010，101:4132-4138

［7］吳清林，李學梅，郭寶江.米根霉直接發(fā)酵玉米粉生產(chǎn)L-（+）乳酸的新工藝［J］.廣州食品工業(yè)科技，2001，11（3）:16-85

［8］吳清林，郭寶江.玉米淀粉雙酶水解糖米根霉L-乳酸發(fā)酵的研究［J］.華南師范大學學報（自然科學版），2002（1）:31-35

Production of L-lactic Acid with Uncooked Material Fermentation by Rhizopus oryzae

WU Qing-lin，ZOU Shui-yang*，CHEN Yan
（College of Chemistry and Environmental Engineering，Dongguan University of Technology，Dongguan 523808，Guangdong，China）

L-lactic acid was produced with uncooked rice powder fermentation by Rhizopus oryzae NRRL 395 for reducing costs.The influence of the following four antibiotics（Sodium penicillin，penicillin V potassium，streptomycin，and oxytetracycline）and other factors on the fermentation was investigated.Experimental results showed that all four kinds of antibiotics could inhibit bacterial contamination and promote the yield of L-lactic acid，in which 1.6 million units/L of sodium penicillin showed the most significant effect.Inoculation with mycelium could reach higher L-lactic acid yield than that of spores inoculation.Also，the simultaneous saccharification fermentation reduced the costs，while increasing L-lactic acid yield，which was better than the conventional method of separate hydrolysis and fermentation.Under preliminary optimized culture conditions，L-lactic acid yield was up to 67.80 g/L by fermentation of 120 g/L of rice powder，corresponding to 76.45% conversion rate.These results showed the practical feasibility and development prospect of the uncooked material fermentation by Rhizopus oryzae for production of L-lactic acid.

Rhizopus oryzae；L-lactic acid；uncooked material fermentation；antibiotics

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.14.016

2015-05-22

東莞市高等院?？蒲袡C構科技計劃項目（19）

吳清林（1963—），男（漢），講師，博士，研究方向：生物化學工程。

鄒水洋（1970—），男（漢），副教授，博士，研究方向：食品工程。