李雪，金乾坤，李曉東，于婷，李鵬飛，嚴(yán)紅實(shí)，崔承弼，3，*

（1.延邊大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林延吉133002；2.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林延吉133002；3.延邊大學(xué)長白山生物資源與健康產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，吉林延吉133002）

長白山野生食用菌多糖抗突變作用的研究

李雪1，金乾坤1，李曉東1，于婷1，李鵬飛1，嚴(yán)紅實(shí)2，崔承弼2，3，*

（1.延邊大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林延吉133002；2.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林延吉133002；3.延邊大學(xué)長白山生物資源與健康產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，吉林延吉133002）

利用產(chǎn)自長白山地區(qū)的五種野生食用菌：桑黃、靈芝、樺褐孔菌、猴頭菇和榛蘑為主要材料。從中提取食用菌粗多糖并進(jìn)行抗突變實(shí)驗(yàn)，以期為食用菌保健品的開發(fā)以及精細(xì)加工提供理論參考。

食用菌；Ames試驗(yàn)；微核試驗(yàn)；抗突變

在菌類中，我們將可以作為食物食用的大型真菌的菌核組織和子實(shí)體稱為食用菌，食用菌不但具有食用價(jià)值，被人們認(rèn)為是具有“低糖、低鹽、低脂肪、高蛋白”的綠色食品，而且還具有藥用價(jià)值，常在傳統(tǒng)中藥處方中與其他藥食材料配伍［1］。那些在自然界中以完全野生的狀態(tài)生長在深山老林中的優(yōu)質(zhì)食用菌被稱為野生食用菌，這類食用菌往往含有更多的氨基酸、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、糖類、維生素及其他營養(yǎng)物質(zhì)［2］。

長白山位于吉林省東南部地區(qū)，充沛的降雨量，適宜的氣候，肥沃的土壤使其成為各種珍稀動(dòng)植物資源的天然寶庫。長白山地區(qū)可供藥食兩用的菌類有200多種，其得天獨(dú)厚的地理優(yōu)勢為野生食用菌的生長提供了基礎(chǔ)［3-4］。松茸，猴頭菌，元磨，榛蘑，木耳等均被視為長白山地區(qū)的珍品，不但味道鮮美而且營養(yǎng)價(jià)值極高，都是百姓比較喜歡食用的野生食用菌［5］。

食用菌多糖具有多種藥理活性，如抗腫瘤、降血壓、降血糖以及提高機(jī)體免疫力等。基于以上功效，食用菌多糖被廣泛用于醫(yī)藥保健等方面，是一種天然的免疫增強(qiáng)和激活劑［6］。黑木耳中提取的多糖可以顯著降低高血脂小鼠的低密度脂蛋白和膽固醇［7］。某些食用菌多糖可以促進(jìn)肝膽循環(huán)，平衡肝內(nèi)組織生成的酮和肝外組織利用限度，同時(shí)減少血液中血脂的累積［8］。此外有研究證實(shí)，食用菌多糖可以通過提高抗氧化酶活性、抑制脂質(zhì)過氧化水平及清除體內(nèi)自由基來達(dá)到保護(hù)生物膜和延緩衰老的作用。

長白山地區(qū)的野生食用菌在地方預(yù)防疾病方面發(fā)揮著重要的作用，但由于保存方法及生產(chǎn)方式等眾多原因使其開發(fā)利用率較低。本實(shí)驗(yàn)從五種長白山地區(qū)野生食用菌中提取食用菌粗多糖進(jìn)行抗突變實(shí)驗(yàn)的研究，以期為長白山地區(qū)野生食用菌的研究提供新的理論參考。

1材料與方法

1.1材料與試劑

桑黃、靈芝、樺褐孔菌：購于安圖縣市場；猴頭菇、榛蘑：購于延吉市西市場。N-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍（MNNG）、4-硝基喹啉-1-氧化物（4NQQ），美國SIGMA公司生產(chǎn)；注射用環(huán)磷酰胺，山西普德藥業(yè)股份有限公司；Giemsa色素，天津博迪化工有限公司；其他常規(guī)藥品均為化學(xué)純或分析純。

1.2儀器

BH2型生物顯微鏡：日本OLMPUS公司；GT10-1型低溫高速離心機(jī)：北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司；HF-150A型恒溫培養(yǎng)箱：金壇市恒豐儀器廠；SB-2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海愛郎儀器有限公司；YXQ-LS-75S11立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊實(shí)業(yè)有限責(zé)任公司醫(yī)療；全膜終端過濾獨(dú)立送風(fēng)凈化籠具（IVC）：蘇州新區(qū)楓橋凈化設(shè)備廠；A-1000型水流抽氣機(jī)：上海愛郎儀器有限公司；DHG-9143BS-III型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；MCO96型CO2培養(yǎng)箱：上海貝基生物科技有限公司，等。

1.3試驗(yàn)菌株

Ames試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)菌株TA98和TAl00，購置于Ames實(shí)驗(yàn)室。菌株經(jīng)組氨酸缺陷、脂多糖屏障缺陷、R因子、四環(huán)素抗性、uvrB修復(fù)缺陷及自發(fā)回變率鑒定，菌株特性良好符合試驗(yàn)要求。

1.4試驗(yàn)動(dòng)物

小鼠：試驗(yàn)動(dòng)物為昆明種，清潔級，體重18 g～22 g的小鼠，雌雄各半，由延邊大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。小鼠在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室全膜終端過濾獨(dú)立送風(fēng)凈化籠具內(nèi)適應(yīng)飼養(yǎng)3 d，自由攝食飲水，室溫20℃～24℃，相對濕度為40%～65%，每隔1天更換墊料。

1.5試驗(yàn)方法

1.5.1粗多糖的制備

稱取食用菌1 kg加入10倍水后用液體真空濃縮煎藥機(jī)提取2 h，重復(fù)提取一次，真空濃縮濾液至原體積的1/5，加入3倍量的無水乙醇，放置4℃冰箱24 h，4 000 r/min離心10 min，棄上清液，用丙酮和75%乙醇洗滌沉淀，合并后至于60℃下真空干燥成粗多糖［9］。

1.5.2Ames試驗(yàn)

分組及給藥：試驗(yàn)設(shè)4個(gè)劑量組，分別為50、100、150、200 μg/皿的食用菌多糖，同時(shí)設(shè)溶劑對照組與陽性誘變劑對照組，每組設(shè)3個(gè)平皿。誘變劑選用MNNG、4NQO，食用菌多糖與誘變劑均用二甲基亞砜配成0.1 mg/mL溶液。

具體操作：在約45℃的2 mL頂層培養(yǎng)基中加入0.1 mL菌液混勻，加入0.1 mL受試物，再加入0.5 mL磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L，pH 7.4）。迅速混勻，快速傾入底層培養(yǎng)基中，待上層瓊脂凝固后，將平板翻轉(zhuǎn)，37℃溫度下培養(yǎng)48 h后，觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果［10-12］。食用菌粗多糖濃度和突變物質(zhì)濃度通過預(yù)備實(shí)驗(yàn)來確定，抗突變活性通過其對突變物質(zhì)樣品活性的抑制率（%）表示。

回復(fù)突變抑制率（%）=（陽性對照組菌落數(shù)-試驗(yàn)組菌落數(shù)）/陽性對照組菌落數(shù)×100%

1.5.3微核試驗(yàn)

動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)2 d～3 d后，將健康狀況良好且體重為18 g～24 g的昆明種小鼠隨機(jī)分組，每組10只，雌雄各半。小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)分為陰性對照組、環(huán)磷酰胺陽性對照組和1 000 mg/kg·BW的五種野生食用菌多糖實(shí)驗(yàn)組。食用菌多糖按0.1 mL/10 g灌胃給藥，連續(xù)給藥10 d，對照組同時(shí)以蒸餾水灌胃。試驗(yàn)?zāi)┢诮o予陽性對照組環(huán)磷酰胺腹腔注射2次，時(shí)間間隔為24 h，于末次給藥6 h后將各試驗(yàn)組動(dòng)物頸椎脫臼處死。

小鼠骨髓細(xì)胞微核抑制試驗(yàn)分為陰性對照組、陽性對照組和野生食用菌多糖500、1 000 mg/kg·BW 2個(gè)劑量組。食用菌多糖按上述劑量灌胃，方法與上述相同。

處死小鼠，取兩腿股骨，剔除肌肉，剪斷股骨兩端的骨骺后，將吸取適量胎牛血清的1 mL注射器插入骨髓腔內(nèi)，將骨髓沖入已編完號的載玻片上，用另一塊載玻片將胎牛血清上的骨髓細(xì)胞分散均勻。然后以45°進(jìn)行涂片，長度約為2 cm～3 cm，在室溫下放置晾干。在用甲醇中固定時(shí)間約為10 min，然后用Giemsa應(yīng)用液A染色約15 min后立即用Giemsa應(yīng)用液B沖洗，自然干燥后保存［13-14］。在油鏡下觀察含有微核嗜多染紅細(xì)胞數(shù)，微核率以千分率表示，抑制率公式如下：

2結(jié)果

2.1五種野生食用菌多糖Ames試驗(yàn)的抗突變性

2.1.1五種野生食用菌多糖MNNG誘導(dǎo)的TA100的抗突變效果

對五種食用菌多糖進(jìn)行前期試驗(yàn)，當(dāng)以MNNG和4NQO做為直接致突變劑進(jìn)行Ames試驗(yàn)時(shí)均沒有致突變性。如圖1所示在MNNG（0.4 μg/plate）誘導(dǎo)的TA100試驗(yàn)中，最高濃度200 μg/plate時(shí)其抗突變作用達(dá)到70%以上。

圖1　5種食用菌多糖對MNNG誘導(dǎo)的TA100的抗突變抑制效果Fig.1The inhibition effect of anti-mutation of MNNG induced by five kinds of mushroom polysaccharides on TA100

2.1.2五種野生食用菌多糖對4NQO誘導(dǎo)的TA98、TA100的抗突變效果

4NQO誘導(dǎo)的TA98、TA100試驗(yàn)結(jié)果如圖2、圖3所示。

圖2　5種食用菌多糖對4NQO誘導(dǎo)的TA98的抗突變抑制效果Fig.2The inhibition effect of anti-mutation of 4NQO induced by five kinds of mushroom polysaccharides on TA98

圖3　5種食用菌多糖對4NQO誘導(dǎo)的TA100的抗突變抑制效果Fig.3The inhibition effect of anti-mutation of 4NQO induced by five kinds of mushroom polysaccharides on TA100

在4NQO誘導(dǎo)的TA98實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)多糖濃度達(dá)到最高（200 μg/皿）時(shí)樺褐孔菌顯示出80%以上的抑制率；而在TA100實(shí)驗(yàn)中，桑黃多糖和樺褐孔菌多糖抑制率均達(dá)到了90%。此外，可以發(fā)現(xiàn)隨著濃度的增加其抗突變作用也明顯增強(qiáng)。

2.1.3五種野生食用菌多糖混合物的抗突變效果

將五種食用菌多糖按相同比例混合溶解后，以MNNG和4NQO為致突變劑進(jìn)行了Ames試驗(yàn)。結(jié)果表明多糖混合物沒有致突變性，于是對其抗突變作用進(jìn)行進(jìn)一步試驗(yàn)。圖4 MNNG（0.4 μg/皿）誘導(dǎo)TA100的試驗(yàn)中，多糖最高濃度為200 μg/皿時(shí)抗突變作用達(dá)到75.9%。4NQO誘導(dǎo)的TA98、TA100試驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。

圖4　5種食用菌多糖混合物對MNNG誘導(dǎo)的TA100的抗突變抑制效果Fig.4The inhibition effect of anti-mutation of MNNG induced by five kinds of mushroom polysaccharides mixture on TA100

圖5　5種食用菌多糖混合物對4NQO誘導(dǎo)的TA98、TA100的抗突變抑制效果Fig.5The inhibition effect of anti-mutation of 4NQO induced by five kinds of mushroom polysaccharides mixture on TA98 and TA100

混合多糖濃度在200 μg/皿時(shí)TA98、TA100的突變抑制率分別達(dá)到67.9%和76.7%。其抗突變作用隨著多糖濃度的增加而有所增強(qiáng)。

2.2五種野生食用菌多糖的小鼠微核試驗(yàn)

五種野生食用菌多糖的小鼠微核試驗(yàn)見表1。

表1　食用菌多糖小鼠微核試驗(yàn)Table 1Micronucleus test on mice fed with mushroom polysaccharides

續(xù)表1食用菌多糖小鼠微核試驗(yàn)Continue table 1Micronucleus test on mice fed with mushroom polysaccharides

由表1可以看出，本實(shí)驗(yàn)選用小鼠的自發(fā)微核率為（2.4±0.48）‰，介于0‰～4‰之間，自發(fā)微核率低且比較穩(wěn)定因此可以選做微核試驗(yàn)。環(huán)磷酰胺組形成的微核數(shù)量較多且與空白組有顯著性差異（p＜0.05），可以看出50 mg/kg·BW劑量的環(huán)磷酰胺可以誘發(fā)小鼠骨髓微核形成，而五種食用菌多糖組微核率均在正常范圍內(nèi)，且與空白組相比無顯著差異（p＞0.05）。說明五種食用菌多糖的攝入對微核的形成沒有影響，即五種食用菌多糖沒有致突變性。

5種食用菌多糖抑制小鼠骨髓細(xì)胞微核形成的作用結(jié)果如表2所示。

表2　食用菌多糖抑制小鼠微核試驗(yàn)Table 2The inhibition micronucleus test on mice fed with mushroom polysaccharides

5種食用菌多糖兩個(gè)劑量組與環(huán)磷酰胺對照組相比微核率顯著下降（p＜0.05），且高劑量組微核率比低劑量組微核率低，說明其抑制率更高。此外，樺褐孔菌多糖與靈芝多糖的為500 mg/kg·BW時(shí)對小鼠骨髓微核的抑制作用最好，抑制率分別達(dá)到77.0%和70.1%。因此可以看出五種食用菌多糖對環(huán)磷酰胺所引起的染色體損傷具有保護(hù)作用。

3結(jié)論

食用菌多糖的抗突變試驗(yàn)結(jié)果顯示其具有較高的抗突變活性。本實(shí)驗(yàn)從細(xì)菌回復(fù)突變和體細(xì)胞染色體改變兩個(gè)不同的角度對長白山地區(qū)野生食用菌的致突變性和抗突變性進(jìn)行了研究。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可證實(shí)食用菌多糖具有一定的抗突變作用，即長白山地區(qū)的這五種野生食用菌不僅是天然綠色的食品同時(shí)也可用于相關(guān)藥物研發(fā)。因此長白山地區(qū)的野生食用菌可以作為安全綠色的藥食同源材料進(jìn)行進(jìn)一步精加工，其用于新型功能性食品將具有很大的開發(fā)前景。

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Study on the Anti-mutation Effect of Changbai Mountain Wild Edible Fungus Polysaccharide

LI Xue1，JIN Qian-kun1，LI Xiao-dong1，YU Ting1，LI Peng-fei1，YAN Hong-shi2，CUI Cheng-bi2，3，*
（1.School of Basic Medical Science，Yanbian University，Yanji 133002，Jilin，China；2.Dept.of Agriculture，Yanbian University，Yanji 133002，Jilin，China；3.Center of Co-Innovation for Natural Resources of Changbai Mountain&Health Industry，Yanbian University，Yanji 133002，Jilin，China）

In this study，we used five wild edible mushroom in Changbai Mountain area as follows：Phellinus igniarius，glossy ganoderma，Inonotus obliquus，Hericium erinaceus and mellea armillaria sporophore. Extracted mushroom polysaccharide from the five wild edible mushroom for the anti-mutation experiments，there would be a theoretical basis for the development of edible mushrooms in health products and precision machining.

edible mushroom；ames test；micronucleus test；anti-mutation

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.14.034

2014-06-11

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31160314）

李雪（1990—），女（漢），在讀研究生，研究方向：功能性食品的研究。

崔承弼（1968—），男，教授，博士。