王豐等

摘要：以長(zhǎng)白山有毒真菌毒蠅鵝膏菌為原料，研究其活性成分的超聲波提取工藝和抑菌性，確定了其最佳提取工藝條件：丙酮質(zhì)量濃度85%，料液比1 g ∶25 mL，浸提溫度20 ℃，浸提時(shí)間40 min。其中，丙酮質(zhì)量濃度是影響提取率的主要因素。毒蠅鵝膏菌提取液對(duì)枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃葡萄球菌均有明顯的抑菌效果，最低抑菌濃度是0.062 5%；對(duì)酵母、青霉、米根霉、黑曲霉抑菌效果不明顯。

關(guān)鍵詞：長(zhǎng)白山有毒真菌；有效成分；提取；抑菌

中圖分類號(hào)： S482.2+92文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）09-0177-03

有毒真菌是含有對(duì)人或動(dòng)物有毒成分的真菌的總稱，一般是指大型真菌的子實(shí)體被人或動(dòng)物食用后產(chǎn)生中毒反應(yīng)的物種。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，世界上已知具較明顯毒性的大型真菌有400多種，如包括有輕微毒性的，則有1 000多種，中國(guó)目前包括懷疑有毒在內(nèi)的大型有毒真菌有421種。近年來(lái)，傳統(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥面臨嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，大量高毒、高殘留農(nóng)藥被禁止使用，開(kāi)發(fā)對(duì)有害生物高效、易分解、且分解產(chǎn)物對(duì)環(huán)境無(wú)損害的生物農(nóng)藥是目前廣泛研究和應(yīng)用的領(lǐng)域。利用天然植物中具有良好抑菌殺菌活性的物質(zhì)來(lái)防治農(nóng)林病蟲(chóng)害成為農(nóng)藥學(xué)研究的熱點(diǎn)[1]。據(jù)相關(guān)資料反映，大多數(shù)研究的是有毒真菌的殺蟲(chóng)效果，國(guó)內(nèi)外比較少有關(guān)于抑菌效果的研究。筆者對(duì)長(zhǎng)白山有毒真菌有效成分的提取工藝及抗菌特性進(jìn)行了研究，旨在為有毒真菌提取物在農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐即植物源抑菌劑中的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)，也為有毒真菌的開(kāi)發(fā)開(kāi)辟一條新途徑。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料與儀器

供試菌種：枯草桿菌、大腸桿菌、金黃葡萄球菌、青霉、黃曲霉、黑曲霉，來(lái)自吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院實(shí)驗(yàn)室。

有毒真菌：毒蠅鵝膏菌，采集于吉林省白山市八道江鎮(zhèn)長(zhǎng)白山原始林區(qū)。

試驗(yàn)儀器：722型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司；電子恒溫水浴鍋；高溫高壓蒸汽滅菌鍋等。

主要試劑：乙醇、三氯甲烷、丙酮、石油醚、牛肉膏、蛋白胨等，均為分析純。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1殺蟲(chóng)活性物質(zhì)提取工藝在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選定料液比、提取溫度、提取時(shí)間3個(gè)參數(shù)為主要影響因素，每個(gè)因素取3個(gè)水平，采用3因素3水平L9（33）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，找到超聲輔助丙酮提取最佳工藝[2-3]，因素及水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

1.2.2真菌提取液的抑菌性測(cè)定將7種供試菌種分別制

表1殺蟲(chóng)活性物質(zhì)提取工藝正交試驗(yàn)因素水平

水平因素A：料液比（g ∶mL）B：溫度（℃）C：時(shí)間（min）11 ∶25202021 ∶20303031 ∶154040

成菌懸液。采用濾紙片法測(cè)定抑菌性：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上分別涂布0.2 mL的金黃葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌菌懸液，PDH培養(yǎng)基平板上分別涂布0.2 mL米根霉、青霉、酵母、黑曲霉懸液，然后將滅菌濾紙片浸在提取液中，放入培養(yǎng)皿中，做3～4個(gè)平行，細(xì)菌置培養(yǎng)箱中30 ℃培養(yǎng) 24 h，霉菌置培養(yǎng)箱中35 ℃培養(yǎng)24 h后，測(cè)量濾紙片抑菌圈直徑大小。抑菌圈越大，抑菌效果越好。

2結(jié)果與分析

2.1料液比對(duì)提取率的影響

稱取真菌粉末1.00 g，加入85%丙酮，料液比分別為 1 g ∶10 mL、1 g ∶ 15 mL、1 g ∶20 mL、1 g ∶25 mL、1 g ∶30 mL，40 ℃水浴中超聲波輔助提取，頻率為24 kHz，提取時(shí)間為30 min，在 35 ℃ 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓蒸餾，過(guò)濾，定容50 mL。分別取提取液1 mL置于分光光度計(jì)352 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度，研究料液比對(duì)提取效果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。從圖1可知，隨著料液比的增大，吸光度不斷提高，而料液比 1 g ∶25 mL 時(shí)與 1 g ∶30 mL 時(shí)的提取率沒(méi)有顯著差異。從節(jié)約成本方面考慮，本試驗(yàn)選擇了1 g ∶25 mL的料液比。

2.2提取時(shí)間對(duì)提取率的影響

稱取真菌粉末1.00 g，加入85%丙酮，料液比為1 g ∶20 mL，提取時(shí)間分別為10、20、30、40、50、60、70 min，在20 ℃水浴中超聲波輔助提取，頻率為24 kHz。分別取提取液1 mL置于分光光度計(jì)352 nm波長(zhǎng)下測(cè)其吸光度，研究提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可以看出，提取時(shí)間為40 min時(shí)，提取效果最好。提取時(shí)間低于40 min時(shí)，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，吸光度逐漸增大；提取時(shí)間高于40 min時(shí)，提取液的吸光度基本沒(méi)有變化。提取時(shí)間為70 min時(shí)，吸光度下降到0.374。因此確定超聲輔助提取時(shí)間為40 min。

2.3提取溫度對(duì)提取率的影響

稱取真菌粉末1.00 g，加入85%丙酮，料液比為 1 g ∶20 mL，分別于10、15、20、25、30 ℃水浴中超聲波輔助提取，頻率為24 kHz，提取時(shí)間為40 min，分別取提取液1 mL置于分光光度計(jì)352 nm波長(zhǎng)下測(cè)其吸光度，研究提取溫度對(duì)提取效果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可以看出，20 ℃時(shí)其吸光度達(dá)最高，當(dāng)溫度超過(guò)20℃后，提取液的吸光度開(kāi)始平緩下

降。在超聲條件下，提取液在較低的提取溫度條件下即可溶出，因此，提取溫度以20 ℃效果最好。

2.4正交試驗(yàn)結(jié)果

由于料液比、提取溫度、提取時(shí)間因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響顯著，故選擇料液比（A）、溫度（B）、時(shí)間（C）進(jìn)行正交試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。根據(jù)極差分析可以得出，3種因素對(duì)提取效果影響大小依次為A>C>B，即料液比對(duì)提取效果影響最大，其次為提取時(shí)間，提取溫度影響最小。由此可確定最佳提取工藝條件為A1B1C3，即料液比為 1 g ∶25 mL、提取溫度為20 ℃、提取時(shí)間為40 min。

表2正交試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)號(hào)ABCD352 nm11110.38721220.38131330.38442130.38252210.37662320.38373120.37883230.38293310.377k10.3840.3820.380 k20.3810.3800.381k30.3790.3810.383R0.0050.0020.003

2.5抑菌作用

提取液對(duì)金黃葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌均有明顯的抑菌效果，對(duì)酵母、青霉、米根霉、黑曲霉抑菌效果很弱。然后用濃縮液對(duì)4種霉菌做抑菌性試驗(yàn)，抑菌效果仍然不明顯?？梢詳喽?，毒蠅鵝膏菌提取液的抑菌性：金黃葡萄球菌>枯草芽孢桿菌>大腸桿菌，對(duì)4種霉菌抑菌性不明顯（表3）。

2.6最低抑菌濃度（MIC）的確定

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基滅菌后，在其還未凝固時(shí)，在無(wú)菌操

表3真菌提取液對(duì)7種指示菌的抑菌效果

供試菌種抑菌圈直徑（mm）重復(fù)1重復(fù)2重復(fù)3重復(fù)4均值金黃色葡萄球菌2425242324大腸桿菌1821201819.25枯草芽孢桿菌21.52321.52222米根霉6676.56.375青霉65645.25酵母60001.5黑曲霉66776.5

作臺(tái)中用滅菌的量筒配制含0.031 25%、0.062 5%、0125%、0.25%、0.5%、0.1%、5%的毒蠅鵝膏菌提取液，抑菌試驗(yàn)操作方法同上，用枯草芽孢桿菌涂布，30 ℃培養(yǎng)24 h之后觀察菌落生長(zhǎng)情況，其他2種細(xì)菌以同樣的方法測(cè)定。由表4、5、6可見(jiàn)，和對(duì)照組相比，0.062 5%濃度時(shí)菌落明顯減少；0.25%濃度時(shí)，沒(méi)有菌落出現(xiàn)；0.031 25%以下菌落數(shù)目和對(duì)照組相比沒(méi)有明顯減少。因而得出結(jié)論：毒蠅鵝膏菌提取液對(duì)枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃葡萄球菌的最低抑菌濃度是0.062 5%。

表4對(duì)枯草芽孢桿菌的MIC試驗(yàn)結(jié)果

濃度

（%）菌落生長(zhǎng)情況1號(hào)2號(hào)3號(hào)0++++++++++++0.031 25++++++++++++0.062 5++++++0.125-+-0.25---0.5---1---5---

表5對(duì)大腸桿菌的MIC試驗(yàn)結(jié)果

濃度

（%）菌落生長(zhǎng)情況1號(hào)2號(hào)3號(hào)0++++++++++++0.031 25++++++++++++0.062 5+++++++0.125-+-0.25+--0.5---1---5---

表6對(duì)金黃葡萄球菌的MIC試驗(yàn)結(jié)果

濃度

（%）菌落生長(zhǎng)情況1號(hào)2號(hào)3號(hào)0++++++++++++0.031 25+++++++++++0.062 5+++++0.125---0.25---0.5---1---5---注：“+”為陽(yáng)性，有菌生長(zhǎng)；“-”為陰性，無(wú)菌生長(zhǎng)。

2.7提取物的耐熱性

將真菌提取液沸水浴5、10、20、30、40、50、60 min，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)用金黃葡萄球菌做指示菌，用濾紙片法做抑菌性試驗(yàn)，3個(gè)平行。如圖4、圖5、圖6所示，真菌提取液沸水浴1 h之后，其抑菌圈大小和對(duì)照組相比變化不大，說(shuō)明提取物中的抑菌物質(zhì)耐熱性很強(qiáng)，即溫度對(duì)提取物抑菌效果沒(méi)有明顯的影響。

3結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明，超聲波輔助丙酮提取毒蠅鵝膏菌有效成分最佳提取工藝為：提取時(shí)間為40 min，提取溫度為20 ℃，料液比為1 g ∶25 mL。本試驗(yàn)采用超聲波輔助法提取真菌提取液，影響提取效果的因素還有很多，如其他提取方法、提取劑、粉碎度、提取次數(shù)等，該試驗(yàn)的進(jìn)行可以為進(jìn)一步研究及實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化提供技術(shù)支持。毒蠅鵝膏菌提取液對(duì)金黃葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌均有明顯的抑菌效果，對(duì)酵母、青霉、米根霉、黑曲霉抑菌效果不明顯。

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