唐美瓊+閔丹丹+李剛

摘要：對采自廣西不同地點的山豆根根瘤菌進行生物學(xué)特性研究，并將其分別接種在盆栽山豆根幼苗上，室內(nèi)培養(yǎng)180 d后，測定植株藥用有效成分苦參堿、氧化苦參堿含量。結(jié)果表明，山豆根根瘤菌為快生型根瘤菌，在YMA培養(yǎng)基上代謝產(chǎn)酸，大部分菌株的生長溫度范圍為25～35 ℃，酸堿耐受范圍為pH值6.0～10.0，對抗生素卡那霉素（Km）、慶大霉素（Gm）敏感；不同來源的根瘤菌對山豆根藥用有效成分積累的影響不同，與其他菌株相比，來自靖西縣的2株菌JX2、JX3對苦參堿、氧化苦參堿的影響達到了顯著水平。

關(guān)鍵詞：山豆根；根瘤菌；生物學(xué)特性；有效成分

中圖分類號： S567.21+9 文獻標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）01-0131-04

山豆根為豆科植物越南槐（Sophora tonkinensis Gagnep.）的干燥根和根莖，主產(chǎn)于廣西，別稱廣豆根。山豆根具有清火解毒、消腫止痛等功效[1]，其有效成分以苦參堿、氧化苦參堿為主[2]，具有抗炎、抗心律失常、抗腫瘤等生物活性[3]。野生山豆根分布地域狹窄，零星生長于石山區(qū)石縫中，野生資源已瀕臨枯竭[4]。近年來，科技人員已經(jīng)對山豆根的人工繁殖栽培進行研究，并取得了一定的成果[5-6]。在山豆根的栽培生產(chǎn)中，如果能利用豆科植物與根瘤菌的共生固氮效應(yīng)滿足植物對氮素的需求，對提高藥材的質(zhì)量及發(fā)展可持續(xù)農(nóng)業(yè)、保護生態(tài)環(huán)境都有重要意義。但是目前關(guān)于豆科藥材的生物固氮及其結(jié)瘤固氮對藥材質(zhì)量影響等相關(guān)研究甚少，對山豆根的研究更是罕見。本試驗從研究山豆根根瘤菌生物學(xué)特性入手，進一步研究根瘤菌對山豆根幼苗有效成分積累的影響，以期為開發(fā)利用山豆根根瘤菌資源、提高山豆根原料藥材的質(zhì)量提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 根瘤菌的采集及分離純化

分別在廣西藥用植物園、隆安縣、靖西縣栽培的山豆根系上采集新鮮、飽滿、個大的根瘤，放入裝有無水氯化鈣的具塞試管內(nèi)，帶回實驗室進行分離純化。用自來水將采集的根瘤沖洗干凈，在無菌條件下，用95%乙醇浸泡1 min后用無菌水沖洗3次，用0.1%氯化汞浸泡3 min后再用無菌水沖洗4次，然后置于滅菌的研缽中，用無菌玻棒擠壓、破碎根瘤，取汁液在加有0.025 g/L剛果紅的YMA平板上劃線，28 ℃恒溫培養(yǎng)至菌落出現(xiàn)，挑選典型單菌落進行連續(xù)培養(yǎng)，獲得根瘤菌菌株YY、LA1、LA2、JX2、JX3（表1）。

1.2 生長特性測定

革蘭氏染色參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》，按常規(guī)方法進行[7]。生長曲線測定：將根瘤菌接種到Y(jié)MA液體培養(yǎng)基中，接種后每隔4h用紫外-可見分光光度計在600 mn波長處測定各參試菌株培養(yǎng)液的吸光度，以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制生長曲線。溴麝香草酚藍（BTB）反應(yīng)：將菌種接種于含0.1%溴麝香草酚藍的YMA培養(yǎng)基上，于 28 ℃ 培養(yǎng)6～10 d，觀察顏色變化。

1.3 生理生化特性測定

以YMA液體培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基。溫度試驗設(shè)置共設(shè)8個單一溫度和1個耐高溫處理，單一溫度分別設(shè)為4、10、15、20、25、30、35、40 ℃，耐高溫處理先于60 ℃處理10 min，再置于28 ℃搖床中培養(yǎng)5 d。酸堿度影響試驗：分別設(shè)置pH值為4、5、6、7、8、9、10、11、12，共9個梯度。耐鹽性試驗：分別設(shè)置NaCl終濃度為0.1%、0.5%、1.0%、2.0%、3.0%，共5個梯度。抗生素抗性試驗：添加不同濃度氨芐青霉素（Amp）、氯霉素（Cm）、卡那霉素（Km）、慶大霉素（Gm）、大觀霉素（Spec）、鏈霉素（Sm）、羧芐青霉素（Cb）、萘定酮酸（Nm）、四環(huán)素（Tc）至YMA液體培養(yǎng)基中。碳源、氮源利用試驗：以去掉碳源的White培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別加入各種碳源或氮源，使終濃度為1%（質(zhì)量體積分數(shù)），調(diào)節(jié)pH值至7.0。滅菌后接入供試菌株，以YMA液體培養(yǎng)基為陽性對照，以不加任何碳源的培養(yǎng)基為陰性對照，于28 ℃、200 r/min 搖床培養(yǎng)5 d后，顯微鏡下檢測根瘤菌的生長狀況。 以上試驗均設(shè)置3次重復(fù)。

1.4 回接試驗

培養(yǎng)基質(zhì)為按1 ∶1體積混合的水洗河沙、蛭石，121 ℃高壓滅菌1 h。山豆根種子來自廣西藥用植物園科研基地。先將山豆根種子在60 ℃左右熱水中浸泡，并讓其自然冷卻，吸脹后分別用75%乙醇、0.1%氯化汞進行表面消毒，在無菌的水洗河沙中，于28 ℃培養(yǎng)至發(fā)芽，選取長勢一致的植株移栽至花盆中，花盆用5%高錳酸鉀浸泡5～6 h后清洗干凈。

將供試菌株分別接種到山豆根幼苗根系上作為接種處理，以不接種根瘤菌為對照處理（CK），共6個處理，每個處理種植3盆，每盆15株。接種方法：移栽山豆根幼苗后，用移液槍吸取相應(yīng)的根瘤菌菌液2 mL，注于幼苗根系周圍，CK處理用等量的無菌水代替。將植株置于日—夜溫度周期 28 ℃—22 ℃、光照度3 000 lx的無菌光照培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)。用Fahraeus無氮營養(yǎng)液補充營養(yǎng)元素、水分。培養(yǎng)180 d 后取出植株清洗，統(tǒng)計山豆根幼苗根瘤數(shù)量。

1.5 苦參堿與氧化苦參堿的含量測定

測定方法參照2010年《中華人民共和國藥典》（簡稱《藥典》）[8]。以苦參堿、氧化苦參堿對照品作為試驗對照，按照《藥典》中山豆根測定的方法制備供試液。稱取山豆根藥材 0.5 g，精確加入20mL混合溶液（三氯甲烷 ∶甲醇 ∶濃氨水體積比為40 ∶10 ∶1）密塞，稱質(zhì)量，放置30 min，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min；再次稱質(zhì)量后用混合溶液補足質(zhì)量，搖勻，過濾，精確量取續(xù)濾液10 mL，40 ℃減壓回收（使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀）至溶劑全部揮盡，在殘渣中加入適量甲醇（色譜純）溶解，轉(zhuǎn)移至容量瓶中，用甲醇定容至10 mL，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜過濾。另取適量苦參堿、氧化苦參堿對照品，加入液相流動相（乙腈 ∶異丙醇 ∶3%磷酸溶液體積比為80 ∶5 ∶15），使苦參堿含量為20 μg/mL，氧化苦參堿含量為150 μg/mL。儀器：高效液相色譜儀 Varian JC2X058；色譜柱：Phenomenex Luna 5 μ NH2 100 A，150 mm×4.6 mm；柱溫：25 ℃；流動相：乙腈 ∶異丙醇 ∶3%磷酸溶液體積比為 80 ∶5 ∶15；檢測波長210 nm；液相時間16 min。

1.6 數(shù)據(jù)處理方法

采用SPSS 16.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 山豆根根瘤菌的生長特性

山豆根根瘤菌在YMA平板上于28 ℃培養(yǎng)3～5 d能形成良好的典型菌落，其菌落呈圓形，透明黏稠，表面光滑，有光澤，邊緣整齊，中心稍有突起。按菌落大小可分為2種類型，其中YY、LA2、JX3菌落直徑為0.6～0.8 cm，LA1、JX2菌落直徑為0.2～0.4 cm。BTB反應(yīng)表明，參試的山豆根菌株代謝產(chǎn)酸；革蘭氏染色均為陰性。生長曲線測定結(jié)果表明：各菌株在培養(yǎng)0～4 h為遲緩期，4～24 h為對數(shù)生長期，24 h后進入穩(wěn)定生長期（圖1）。由此可見，本研究分離到的根瘤菌具有快生型根瘤菌的一般特征[9]，初步判定它為快生型根瘤菌。

2.2 山豆根根瘤菌的生理生化特性

2.2.1 溫度對山豆根根瘤菌生長的影響 山豆根根瘤菌對不同溫度的反應(yīng)較為一致，對低溫的忍耐能力較差，在30 ℃左右生長良好。各菌株對異常溫度的耐受性有一定的差異，來自同一產(chǎn)地的不同根瘤菌株對高溫的耐受性也存在著差異，其中YY、LA1、JX2能耐受短時60 ℃的高溫（表2）。

2.2.2 pH值對山豆根根瘤菌生長的影響 一般過酸、過堿的環(huán)境條件不利于根瘤菌的生長，山豆根根瘤菌對酸堿的反應(yīng)較為一致，在pH值為 6.0～10.0時均能生長，其中LA1、JX2、JX3在pH 值為11的條件下仍能生長（表3）。由試驗結(jié)果可知，山豆根根瘤菌對酸性環(huán)境較為敏感，pH值低于6.0時菌株不能再生長，但具有較豐富的耐堿種質(zhì)資源。

2.2.3 NaCl含量對山豆根根瘤菌生長的影響 表4表明，山豆根根瘤菌在無鹽條件下能生長，隨著NaCl含量的增加，菌株生長受到抑制，當(dāng)NaCl含量達到1%及以上時，菌株不能生長。

2.2.4 山豆根根瘤菌對幾種抗生素的耐受性 對抗生素的敏感性是根瘤菌的重要生理生化特性，可以作為分類的指標(biāo)之一。表5表明，山豆根根瘤菌株對Km、Gm的耐受性最差，在低含量（5 μg/mL）下均不能生長；對Cb表現(xiàn)出抗性，在較高含量（300 μg/mL）下仍能夠生長；在100 μg/mL Cm、10 μg/mL Nm中都能夠生長。此外，菌株間對不同抗生素或同一抗生素不同濃度的抗性差異較大，即使是來自同一地域的菌株之間也有部分差異。如來自靖西縣的菌JX2、JX3對Amp敏感，相反另外2株來自隆安縣的LA1、LA2對Amp（600 μg/mL）表現(xiàn)出抗性，而分離自廣西藥用植物園的YY菌株能忍耐100 μg/mL Amp。

2.2.5 碳源和氮源利用 根瘤菌一般能較好地利用單糖和雙糖，而快生型根瘤菌能利用麥芽糖、乳糖、蔗糖等雙糖[10]。由表6可知，山豆根根瘤菌均能利用葡萄糖、蔗糖、甘露醇、麥芽糖、果糖、乳糖，但不能利用乙酸鈉、甘氨酸和肌醇。

本試驗檢測了供試菌株對5種氮源的利用情況，由表6可見，所有的菌株都能利用蛋白胨和硫酸銨；所有菌株均不能利用半胱氨酸；除YY外，其余菌株均能利用硝酸鉀，而且YY、LA1不能利用甘氨酸，說明大部分供試根瘤菌可以利用無機氮源作為其生長所需氮源。試驗結(jié)果表明，來源不同的山豆根根瘤菌對供試碳源、氮源的利用能力比較一致。

2.3 根瘤菌對山豆根幼苗有效成分的影響

接種根瘤菌能使山豆根幼苗結(jié)瘤，不同根瘤菌處理的植株苦參堿和氧化苦參堿含量是不同的。接種根瘤菌的處理，其苦參堿、氧化苦參堿含量均比對照有所增加，其中接種來自靖西縣菌株的植株含量顯著高于對照及其他大部分處理（表7）。由結(jié)果可見，接種根瘤菌有利于根瘤形成，再通過根瘤進行生物固氮來積累氮素，從而促進植株有效成分的積累。

3 討論

藥材原料質(zhì)量是藥材生產(chǎn)中亟待解決的問題，許多學(xué)者也在探索解決、評價藥材質(zhì)量的方法[11-12]。山豆根人工馴化獲得成功之后，人們總結(jié)了山豆根人工栽培的一些技術(shù)措施[5-6]，但是在栽培生產(chǎn)中，藥農(nóng)為了追求產(chǎn)量而多施重施氮肥，造成病蟲害加重、農(nóng)藥殘留量升高、硝酸鹽含量超標(biāo)等問題，嚴重影響藥材質(zhì)量，這是目前山豆根可持續(xù)生產(chǎn)中不可忽視的問題。生物固氮是豆科植物的一個重要特性，通過生物固氮可以利用自然界的N2改善植株的氮素營養(yǎng)狀況，從而避免盲目施氮肥造成對山豆根等豆科藥材質(zhì)量的不良影響。因此，篩選出具有優(yōu)良特性的土著根瘤菌菌株對進一步在生產(chǎn)上進行接種應(yīng)用是十分有利的。本試驗從山豆根根瘤中獲得5株根瘤菌，它們均具有快生型根瘤菌生長特征和生理生化特征。

楊亞珍等發(fā)現(xiàn)，不同地理來源、同一地理來源、甚至同一植株不同甘草根瘤菌菌株在個別指標(biāo)方面存在差異[13]；黃榮韶等發(fā)現(xiàn)，不同生態(tài)環(huán)境下采集的雞骨草根瘤菌在生物學(xué)特性方面具有較大的差異[14]。本試驗結(jié)果與這些研究有相似之處，即來源相同或來源不同的山豆根根瘤菌在對高溫忍耐能力、酸堿環(huán)境的適應(yīng)性、抗生素的敏感性等方面存在差異，但對酸堿環(huán)境的適應(yīng)性及碳源的利用能力比較一致，推測這可能與不同的菌株含有的一些特殊基因有關(guān)。通過回接試驗發(fā)現(xiàn)，人工接種根瘤菌明顯促進山豆根根瘤的形成，植株的有效成分含量大幅度提高，其原因可能是生物堿是含氮化合物，氮素的供給利用在山豆根生物堿的生物合成和積累中起重要作用。但是不同來源的山豆根菌株之間對有效成分積累的影響不同，這是否與采集地的生態(tài)環(huán)境有關(guān)，尚待進一步研究。

參考文獻：

[1]全國中草藥匯編組.中草藥匯編[M]. 北京：人民衛(wèi)生出版社，1978：105.

[2]林啟壽. 中草藥成分化學(xué)[M]. 北京：科學(xué)出版社，1977：709.

[3]張鳴杰，黃 建. 苦參堿類抗腫瘤作用機制研究的新進展[J]. 中國中藥雜志，2004，29（2）：115-118.

[4]黃寶優(yōu)，農(nóng)東新，黃雪彥，等. 中藥材山豆根資源調(diào)查報告[J]. 中國現(xiàn)代中藥，2014，16（9）：740-744.

[5]覃文流，凌征柱，吳慶華，等. 山豆根野生變家種研究[J]. 時珍國醫(yī)國藥，2006，17（9）：1668-1669.

[6]Wei K H，Li L X，Huang Y C，et al. Tissue culture of Sophora tonkinensis Gagnep. and its quality evaluation[J]. Pharmacognosy Magazine，2013，9（36）：323-330.

[7]東秀珠，蔡妙英. 常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊[M]. 北京：科學(xué)出版社，2001：353.

[8]國家藥典委員會. 中國藥典：一部[M]. 北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：26.

[9]曹燕珍，胡正嘉，黃誠金，等. 快生型根瘤菌的研究——Ⅰ. 快生型大豆根瘤菌的分離及其生理生化形狀[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1986，5（2）：149-156.

[10]Broghton W J. Nitrogen fixation[M]. Oxford：Clarendon Press，1982：76.

[11]郭 玫，余曉暉，李 陽.中藥材質(zhì)量現(xiàn)狀及解決途徑[J]. 甘肅中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2003，20（2）：63，封三.

[12]劉廣南. 中藥的生產(chǎn)必須從源頭抓起[J]. 世界科學(xué)技術(shù)：中藥現(xiàn)代化，2001，3（4）：76-77.

[13]楊亞珍，韋革宏，萬曉紅，等. 西北地區(qū)甘草根瘤菌的表型多樣性研究[J]. 微生物學(xué)通報，2004，31（2）：20-25.

[14]黃榮韶，盛孝邦，玉永雄. 雞骨草根瘤菌的分離及其生物學(xué)特性研究[J]. 中國中藥雜志，2005，30（13）：971-977.黃文娟，韓 鈴，焦培培，等. 胡楊異形葉葉柄長度與葉片形態(tài)指標(biāo)的關(guān)系[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（1）：135-137.