周心濤,趙黎丙,閔新文,陳 嬌,郎明健
(湖北醫(yī)藥學院附屬東風醫(yī)院,湖北十堰 442000)
來源于正常足月分娩胎盤的人胎盤間充質干細胞(human placenta mesenchymal stem cells,PMSCs)具有來源廣、免疫原性低等優(yōu)點,還具有自我更新和無限增殖的能力,能向多譜系分化[1-2]。本實驗通過利用正常足月分娩的臍帶血清(umbilical cord blood serum,UCBS)分離、培養(yǎng)PMSCs,觀察細胞形態(tài)、數(shù)量、擴增所用時間、細胞周期及培養(yǎng)前后細胞的表型、分化能力的改變,探討UCBS分離、培養(yǎng)及擴增PMSCs的可能性。
L-DMEM(Gibco)、胎牛血清(Gibco),胰蛋白酶(北京天根生物技術有限公司),L-谷氨酰胺、MTT kit(Promega)。間充質干細胞成脂、成骨分化試劑盒(廣州賽業(yè)生物技術有限公司)。
無菌條件下取健康產(chǎn)婦足月臍血,4℃靜置4~16 h,20℃、1 500 g離心10 min收集上層血清,0.22 μm濾器過濾,56℃水浴 30 min滅活補體,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>
經(jīng)孕婦本人及家屬知情同意、醫(yī)院倫理委員會批準,無菌條件下取健康胎兒(血清學檢查HBV,HCV,HIV和梅毒均為陰性)小塊胎盤組織,PBS充分洗滌后剔取胎兒面脫膜并剪碎。0.1% Ⅳ型膠原酶消化15~30 min,100目篩網(wǎng)過濾,收集細胞接種于T75細胞培養(yǎng)瓶,分別以含10%UCBS(實驗組)和10%FBS(對照組)的α-MEM培養(yǎng)基于37℃,5%CO2的飽和濕度環(huán)境下進行培養(yǎng)。培養(yǎng)生長至80%融合后(1~2周),用0.05%的胰酶消化傳代。
1.4.1 PMSCs體外誘導分化 將實驗組與對照組中生長至第3代的PMSCs,以低密度接種至6孔板,第2天將基礎培養(yǎng)液更換為誘導液。成骨誘導液為高糖 DMEM、10%UCBS、地塞米松(10~8 mol/L)、磷酸甘油(10 mmol/L)及抗壞血酸(50 g/mL)。成脂肪細胞誘導液為高糖DMEM、10%UCBS、地塞米松(1nmol/L)、0.5 μmol/L 3-isobutyl-1-methylxantine、5 mg/L胰島素及200 mg/L吲哚美辛。每2~3 d換液1次。誘導2~4周后,分別用茜素紅(成骨細胞)和油紅O(脂肪細胞)染色鑒定。
1.4.2 PMSCs表面標志鑒定 將實驗組與對照組中生長至第5代的細胞,用0.05%胰蛋白酶消化后,調(diào)整細胞密度至1×106/mL,分為每管100 μL,分別加入鼠抗人 CD105(PE,Sigma)、CD34(PE,Sigma)、CD45(CY5,Sigma)、HLA-DR(FITC,Sigma)、CD44(FITC,Sigma)及 CD29(FITC,Sigma)單克隆抗體,避光4℃孵育30 min,4%多聚甲醛固定后流式細胞儀進行檢測。
MTT法檢測不同血清對PMSCs增殖活性的影響,用0.05%胰蛋白酶分別將實驗組與對照組中生長至第4代的PMSCs消化成單細胞懸液,調(diào)整濃度為104個/mL,每孔100 μL接種于96孔板,每組細胞培養(yǎng)液根據(jù)不同的時間點,各設置5個平行孔和一個空白對照。按試劑盒操作指南分別于接種后的第1、3、5、7 天每孔 20 μL加入 MTT工作液。37℃、5%CO2孵育4 h后,用酶標儀在490 nm處測定OD值。
2.1.1 PMSCs形態(tài) 實驗組 PMSCs在2~3 d時開始貼壁生長,貼壁細胞呈梭形,形態(tài)飽滿,以后細胞數(shù)逐漸增多形成漩渦狀集落,原代細胞培養(yǎng)1~2周達80%以上融合后可傳代。對照組PMSCs在3~4 d時開始貼壁生長,細胞形態(tài)與實驗組無明顯差異。兩組細胞傳代后生長速度均明顯加快,約4 d可傳代1次。傳代2~3次后細胞純度提高,形態(tài)較原代均一,呈平行排列或漩渦狀生長,見圖1。
2.1.2 PMSCs體外誘導分化 實驗組細胞在進行成骨細胞誘導時,隨著誘導的進行,PMSCs由梭形逐漸變成方形,并開始出現(xiàn)聚集。誘導21 d后茜素紅染色可以將胞質被染成紅色,且實驗組茜素紅染色陽性細胞明顯多于對照組;成脂誘導后PMSCs逐漸開始出現(xiàn)油滴,誘導28 d后油紅O染色陽性,實驗組與對照組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖2。
2.1.3 PMSCs表面標志 經(jīng)流式細胞術檢測,無論是實驗組還是對照組中,PMSCs都高表達CD29、CD44及CD105,不表達或低表達 CD34、CD45及HLA-DR,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖3。
PMSCs在實驗組與對照組中培養(yǎng)時均表現(xiàn)為第2~5天成對數(shù)生長,第6~7天后進入平臺期,生長變緩,而且實驗組的增長率明顯高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),圖4。
PMSCs是從人胎盤組織中分離的一類具有自我更新和多向分化潛能的細胞,除了能分化為脂肪、軟骨、成骨細胞等本胚層細胞外,在適當?shù)臈l件性還能轉分化為骨骼肌細胞、心肌細胞、肝細胞及神經(jīng)細胞等胚層的細胞。PMSCs在缺血性卒中、帕金森氏癥及脊髓損傷等各種神經(jīng)功能障礙疾病模型中的治療效果已經(jīng)得到了證實[3],但常規(guī)用于PMSCs體外培養(yǎng)的FBS中含有異源性蛋白及未知的細胞因子,這些蛋白和細胞因子可能會對人體有害,因而影響MSC的臨床應用[4]。
圖1 實驗組和對照組培養(yǎng)PMSCs原代細胞生長形態(tài)(40×)Fig.1 The morphology of PMSCs in experimental and control groups
圖2 PMSCs體外成骨和成脂誘導分化(200×)Fig.2 Osteogenesis and adipogenesis differentiation of PMSCs in vitro
圖3 PMSCs的免疫表型鑒定Fig.3 The immunophenotype identification of PMSCs
圖4 PMSCs在兩種培養(yǎng)液中的生長曲線Fig.4 The growth curves of PMSCs in the two groups
近年,很多人源性的替代品已經(jīng)被用來代替動物血清進行干細胞培養(yǎng),并取得了理想的效果[5]。UCBS比FBS含有更高濃度的細胞因子和生長因子,有利于干細胞擴增,細胞形態(tài)更好、免疫原性更低[6-8]。利用UCBS代替FBS培養(yǎng)人骨髓來源的MSC(human bone marrow-derived MSC,BM-MSC),在連續(xù)傳代的過程中一直保持MSC的形態(tài)和高的增殖活性[9-11]。有學者利用處理過的臍帶血漿分離的帶間充質干細胞(human umbilical cord-derived MSC,hUC-MSCs)能保持較高的增殖活性和分化潛能[12],CBS培養(yǎng)的MSC即使在高代數(shù)時仍具有較高的克隆形成潛能和MSC相關特性[13]。UCBS培養(yǎng)各種MSC的報道較多,但用于分離PMSCs的報道并不多見。UCBS、PMSCs及 hUC-MSCs同為胎兒附屬物,理論上UCBS中所含細胞因子的濃度、比例等應該更適合PMSCs及hUC-MSCs的生長。本研究利用UCBS進行PMSCs的分離培養(yǎng),并對培養(yǎng)的結PMSCs進行鑒定。結果顯示PMSCs在含UCBS的培養(yǎng)液中可穩(wěn)定生長,顯微鏡下其形態(tài)呈梭形,達到一定的密度后呈漩渦狀生長,復蘇及傳代貼壁率、貼壁時間都正常,在成骨誘導培養(yǎng)液中培養(yǎng)21 d后茜素紅染色成棕紅色,成脂誘導28 d后油紅O染色陽性;流式細胞分析檢測其高表達 CD29、CD44 及 CD105,低表達 CD34、CD45 及HLA-DR。PMSCs在含UCBS的培養(yǎng)液中能長期穩(wěn)定生長,并保持其活力和間充質干細胞特性。而且PMSCs在UCBS培養(yǎng)液中的增殖率明顯高于含F(xiàn)BS的培養(yǎng)液。表明UCBS可以替代FBS用于分離、純化、培養(yǎng)、擴增PMSCs,因人臍帶血血漿完全是人源性的,可符合臨床對PMSCs的培養(yǎng)要求。
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