周心濤，趙黎丙，閔新文，陳 嬌，郎明健

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院，湖北十堰 442000)

來源于正常足月分娩胎盤的人胎盤間充質(zhì)干細胞(human placenta mesenchymal stem cells，PMSCs)具有來源廣、免疫原性低等優(yōu)點，還具有自我更新和無限增殖的能力，能向多譜系分化[1－2]。本實驗通過利用正常足月分娩的臍帶血清(umbilical cord blood serum，UCBS)分離、培養(yǎng)PMSCs，觀察細胞形態(tài)、數(shù)量、擴增所用時間、細胞周期及培養(yǎng)前后細胞的表型、分化能力的改變，探討UCBS分離、培養(yǎng)及擴增PMSCs的可能性。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

L-DMEM(Gibco)、胎牛血清(Gibco)，胰蛋白酶(北京天根生物技術(shù)有限公司)，L-谷氨酰胺、MTT kit(Promega)。間充質(zhì)干細胞成脂、成骨分化試劑盒(廣州賽業(yè)生物技術(shù)有限公司)。

1.2 UCBS 制備

無菌條件下取健康產(chǎn)婦足月臍血，4℃靜置4～16 h，20℃、1 500 g離心10 min收集上層血清，0.22 μm濾器過濾，56℃水浴 30 min滅活補體，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PMSCs分離、培養(yǎng)及擴增

經(jīng)孕婦本人及家屬知情同意、醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，無菌條件下取健康胎兒(血清學(xué)檢查HBV，HCV，HIV和梅毒均為陰性)小塊胎盤組織，PBS充分洗滌后剔取胎兒面脫膜并剪碎。0.1% Ⅳ型膠原酶消化15～30 min，100目篩網(wǎng)過濾，收集細胞接種于T75細胞培養(yǎng)瓶，分別以含10%UCBS(實驗組)和10%FBS(對照組)的α-MEM培養(yǎng)基于37℃，5%CO2的飽和濕度環(huán)境下進行培養(yǎng)。培養(yǎng)生長至80%融合后(1～2周)，用0.05%的胰酶消化傳代。

1.4 PMSCs相關(guān)鑒定

1.4.1 PMSCs體外誘導(dǎo)分化 將實驗組與對照組中生長至第3代的PMSCs，以低密度接種至6孔板，第2天將基礎(chǔ)培養(yǎng)液更換為誘導(dǎo)液。成骨誘導(dǎo)液為高糖 DMEM、10%UCBS、地塞米松(10～8 mol/L)、磷酸甘油(10 mmol/L)及抗壞血酸(50 g/mL)。成脂肪細胞誘導(dǎo)液為高糖DMEM、10%UCBS、地塞米松(1nmol/L)、0.5 μmol/L 3-isobutyl-1-methylxantine、5 mg/L胰島素及200 mg/L吲哚美辛。每2～3 d換液1次。誘導(dǎo)2～4周后，分別用茜素紅(成骨細胞)和油紅O(脂肪細胞)染色鑒定。

1.4.2 PMSCs表面標(biāo)志鑒定 將實驗組與對照組中生長至第5代的細胞，用0.05%胰蛋白酶消化后，調(diào)整細胞密度至1×106/mL，分為每管100 μL，分別加入鼠抗人 CD105(PE，Sigma)、CD34(PE，Sigma)、CD45(CY5，Sigma)、HLA-DR(FITC，Sigma)、CD44(FITC，Sigma)及 CD29(FITC，Sigma)單克隆抗體，避光4℃孵育30 min，4%多聚甲醛固定后流式細胞儀進行檢測。

1.5 不同血清對PMSCs增殖活性的影響

MTT法檢測不同血清對PMSCs增殖活性的影響，用0.05%胰蛋白酶分別將實驗組與對照組中生長至第4代的PMSCs消化成單細胞懸液，調(diào)整濃度為104個/mL，每孔100 μL接種于96孔板，每組細胞培養(yǎng)液根據(jù)不同的時間點，各設(shè)置5個平行孔和一個空白對照。按試劑盒操作指南分別于接種后的第1、3、5、7 天每孔 20 μL加入 MTT工作液。37℃、5%CO2孵育4 h后，用酶標(biāo)儀在490 nm處測定OD值。

2 結(jié)果

2.1 PMSCs的鑒定

2.1.1 PMSCs形態(tài) 實驗組 PMSCs在2～3 d時開始貼壁生長，貼壁細胞呈梭形，形態(tài)飽滿，以后細胞數(shù)逐漸增多形成漩渦狀集落，原代細胞培養(yǎng)1～2周達80%以上融合后可傳代。對照組PMSCs在3～4 d時開始貼壁生長，細胞形態(tài)與實驗組無明顯差異。兩組細胞傳代后生長速度均明顯加快，約4 d可傳代1次。傳代2～3次后細胞純度提高，形態(tài)較原代均一，呈平行排列或漩渦狀生長，見圖1。

2.1.2 PMSCs體外誘導(dǎo)分化 實驗組細胞在進行成骨細胞誘導(dǎo)時，隨著誘導(dǎo)的進行，PMSCs由梭形逐漸變成方形，并開始出現(xiàn)聚集。誘導(dǎo)21 d后茜素紅染色可以將胞質(zhì)被染成紅色，且實驗組茜素紅染色陽性細胞明顯多于對照組;成脂誘導(dǎo)后PMSCs逐漸開始出現(xiàn)油滴，誘導(dǎo)28 d后油紅O染色陽性，實驗組與對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見圖2。

2.1.3 PMSCs表面標(biāo)志 經(jīng)流式細胞術(shù)檢測，無論是實驗組還是對照組中，PMSCs都高表達CD29、CD44及CD105，不表達或低表達 CD34、CD45及HLA-DR，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見圖3。

2.2 MSCs在含UCBS培養(yǎng)液中的生長曲線

PMSCs在實驗組與對照組中培養(yǎng)時均表現(xiàn)為第2～5天成對數(shù)生長，第6～7天后進入平臺期，生長變緩，而且實驗組的增長率明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，圖4。

3 討論

PMSCs是從人胎盤組織中分離的一類具有自我更新和多向分化潛能的細胞，除了能分化為脂肪、軟骨、成骨細胞等本胚層細胞外，在適當(dāng)?shù)臈l件性還能轉(zhuǎn)分化為骨骼肌細胞、心肌細胞、肝細胞及神經(jīng)細胞等胚層的細胞。PMSCs在缺血性卒中、帕金森氏癥及脊髓損傷等各種神經(jīng)功能障礙疾病模型中的治療效果已經(jīng)得到了證實[3]，但常規(guī)用于PMSCs體外培養(yǎng)的FBS中含有異源性蛋白及未知的細胞因子，這些蛋白和細胞因子可能會對人體有害，因而影響MSC的臨床應(yīng)用[4]。

圖1 實驗組和對照組培養(yǎng)PMSCs原代細胞生長形態(tài)(40×)Fig.1 The morphology of PMSCs in experimental and control groups

圖2 PMSCs體外成骨和成脂誘導(dǎo)分化(200×)Fig.2 Osteogenesis and adipogenesis differentiation of PMSCs in vitro

圖3 PMSCs的免疫表型鑒定Fig.3 The immunophenotype identification of PMSCs

圖4 PMSCs在兩種培養(yǎng)液中的生長曲線Fig.4 The growth curves of PMSCs in the two groups

近年，很多人源性的替代品已經(jīng)被用來代替動物血清進行干細胞培養(yǎng)，并取得了理想的效果[5]。UCBS比FBS含有更高濃度的細胞因子和生長因子，有利于干細胞擴增，細胞形態(tài)更好、免疫原性更低[6－8]。利用UCBS代替FBS培養(yǎng)人骨髓來源的MSC(human bone marrow-derived MSC，BM-MSC)，在連續(xù)傳代的過程中一直保持MSC的形態(tài)和高的增殖活性[9－11]。有學(xué)者利用處理過的臍帶血漿分離的帶間充質(zhì)干細胞(human umbilical cord-derived MSC，hUC-MSCs)能保持較高的增殖活性和分化潛能[12]，CBS培養(yǎng)的MSC即使在高代數(shù)時仍具有較高的克隆形成潛能和MSC相關(guān)特性[13]。UCBS培養(yǎng)各種MSC的報道較多，但用于分離PMSCs的報道并不多見。UCBS、PMSCs及 hUC-MSCs同為胎兒附屬物，理論上UCBS中所含細胞因子的濃度、比例等應(yīng)該更適合PMSCs及hUC-MSCs的生長。本研究利用UCBS進行PMSCs的分離培養(yǎng)，并對培養(yǎng)的結(jié)PMSCs進行鑒定。結(jié)果顯示PMSCs在含UCBS的培養(yǎng)液中可穩(wěn)定生長，顯微鏡下其形態(tài)呈梭形，達到一定的密度后呈漩渦狀生長，復(fù)蘇及傳代貼壁率、貼壁時間都正常，在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液中培養(yǎng)21 d后茜素紅染色成棕紅色，成脂誘導(dǎo)28 d后油紅O染色陽性;流式細胞分析檢測其高表達 CD29、CD44 及 CD105，低表達 CD34、CD45 及HLA-DR。PMSCs在含UCBS的培養(yǎng)液中能長期穩(wěn)定生長，并保持其活力和間充質(zhì)干細胞特性。而且PMSCs在UCBS培養(yǎng)液中的增殖率明顯高于含F(xiàn)BS的培養(yǎng)液。表明UCBS可以替代FBS用于分離、純化、培養(yǎng)、擴增PMSCs，因人臍帶血血漿完全是人源性的，可符合臨床對PMSCs的培養(yǎng)要求。

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