王傳家，關(guān)　魁，江樂文，趙明權(quán)，賀新強(qiáng)（深圳市第九人民醫(yī)院整形外科廣東深圳518116）

胰島素樣生長(zhǎng)因子-1對(duì)豬關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞糖胺多糖的作用

王傳家，關(guān)魁，江樂文，趙明權(quán)，賀新強(qiáng)
（深圳市第九人民醫(yī)院整形外科廣東深圳518116）

［提要］目的：探討胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（IGF-1）對(duì)軟骨細(xì)胞分泌糖胺多糖的作用。方法：通過Ⅱ型膠原酶消化法獲得高活性的軟骨細(xì)胞，定量接種5×106個(gè)細(xì)胞于培養(yǎng)皿，在傳代細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入100 μg/L的IGF-1，每周傳代1次，連續(xù)4周，留取培養(yǎng)液，用阿利新藍(lán)法（Alcian Blue）測(cè)定軟骨細(xì)胞糖胺多糖（GAG）的變化；利用光鏡觀察原代及傳代軟骨細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。結(jié)果：軟骨細(xì)胞從傳代后開始合成糖胺多糖，第二代傳代細(xì)胞分泌GAG的能力最強(qiáng)；濃度為100μg/ml的IGF-1能明顯促進(jìn)傳代軟骨細(xì)胞合成糖胺多糖。結(jié)論：IGF-1能明顯促進(jìn)體外培養(yǎng)的傳代軟骨細(xì)胞合成大量的糖胺多糖。

軟骨細(xì)胞；細(xì)胞培養(yǎng)；胰島素樣生長(zhǎng)因子；糖胺多糖

骨關(guān)節(jié)炎疾病和外傷可導(dǎo)致軟骨的缺損，軟骨細(xì)胞屬于增生能力很弱的終末細(xì)胞，自身修復(fù)能力很弱［1-2］。經(jīng)體外消化獲得的軟骨細(xì)胞能夠在合適的環(huán)境中生長(zhǎng)、繁殖，利用可降解的生物相容性支架為軟骨細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)交換空間，就可獲得足夠用于修復(fù)的具有三維特定形狀的組織工程化軟骨組織。軟骨組織工程的興起為軟骨缺損的修復(fù)提供了良好的應(yīng)用前景，體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞是研究生長(zhǎng)因子對(duì)軟骨細(xì)胞促進(jìn)或抑制作用的一種良好的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

近來許多新的實(shí)驗(yàn)證明，多種生長(zhǎng)因子在軟骨損傷后的修復(fù)中起著極為重要的作用，其中胰島素樣生長(zhǎng)因子1（insulin-like growth factor，IGF）在軟骨的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化、骨化過程中有重要的調(diào)節(jié)作用［3］。本研究對(duì)體外培養(yǎng)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞分泌的糖胺多糖進(jìn)行連續(xù)定量檢測(cè)，探討IGF-1促進(jìn)軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和增值的作用機(jī)制，為IGF-1在組織工程化軟骨修復(fù)軟骨缺損中的臨床應(yīng)用及骨關(guān)節(jié)炎的治療提供理論基礎(chǔ)。

1　材料和方法

1.1動(dòng)物與試劑

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:貴州香豬（購(gòu)自上海市第九人民醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室），體重4.5～5.5kg，雄性。

1.1.2試劑:10%胎牛血清，F(xiàn)12細(xì)胞培養(yǎng)基，0.15%的Ⅱ型膠原酶（美國(guó)Sigma公司），0.25%的胰蛋白酶和胰島素樣生長(zhǎng)因子1（美國(guó)Sigma公司）。

1.2生物支架和細(xì)胞培養(yǎng)液的制備

將PGA纖維制成大小約4mm×3mm厚圓柱形，加PLA濃液塑形，待自然干燥成型，形成支架，用硫酸鹽緩沖液沖洗3遍，紫外線消毒，備用。在DMEM加入青霉素100μ/ml、谷氨酰胺300mg、鏈霉素100μg/ml、VitC50mg，加入10%胎牛血清，調(diào)調(diào)pH值為7.0左右，過濾消毒，備用。

1.3豬關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的提?。?-7］

1.3.1軟骨組織的取材：小豬靜脈麻醉后，在無菌操作下切取股骨遠(yuǎn)端、脛骨近端的軟骨，75%酒精浸泡30min后，將軟骨組織剪成1mm3左右的方塊，置于離心管中，用PBS液沖洗3次。

1.3.2消化：在盛有軟骨碎塊的離心管中加入2倍體積0.2%Ⅱ型膠原酶，放置37℃的恒溫振蕩床中振蕩、消化。

1.3.3收集細(xì)胞：3～4h后第一次收集軟骨細(xì)胞。將懸濁液過濾篩濾去軟骨組織，隔夜消化，第二天早上收集。過濾的液體離心，吸除消化液，加入PBS液，漂洗3次，加入細(xì)胞培養(yǎng)液6ml，振蕩混和制成細(xì)胞懸液。錐蟲藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)觀察軟骨細(xì)胞的活力。

1.4倒置顯微鏡下觀察軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)情況

將軟骨細(xì)胞懸液以5×106/ml密度定量接種于經(jīng)PLA包埋PGA支架上，形成軟骨細(xì)胞支架復(fù)合體，培養(yǎng)1周，掃描電鏡觀察軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)情況。

1.5掃描電鏡下觀察軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)情況

1.6軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)和傳代

將軟骨細(xì)胞懸液密度調(diào)整為5×106/ml，以1 ml分別接種于塑料培養(yǎng)皿，加入6ml培養(yǎng)液（F-12培養(yǎng)液加10%胎牛血清），置入37℃恒溫培養(yǎng)箱（5% CO2）培養(yǎng)。經(jīng)清洗、消化、過濾、離心收集，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，HamsF-12培養(yǎng)液稀釋為5×106/ml，以1ml分別接種到培養(yǎng)皿內(nèi)，加入6ml培養(yǎng)液，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱（5%CO2）內(nèi)培養(yǎng)，倒置顯微鏡鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及活力。細(xì)胞生長(zhǎng)增殖形成單層細(xì)胞后，鏡下觀察軟骨細(xì)胞70%～80%匯合，即進(jìn)行傳代。原代細(xì)胞經(jīng)過消化、過濾、收集，用血球記數(shù)板計(jì)數(shù)，F(xiàn)-12培養(yǎng)液稀釋為5×106/ml，以1ml分別接種到培養(yǎng)皿內(nèi)，加入6ml培養(yǎng)液，置入37℃恒溫培養(yǎng)箱（5%CO2）繼續(xù)培養(yǎng)。每周傳代1次，連續(xù)4周

1.7實(shí)驗(yàn)分組

將軟骨細(xì)胞懸液濃度為5×106/ml，以1ml分別接種到培養(yǎng)皿內(nèi)，對(duì)照組加入6ml培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組在對(duì)照組的基礎(chǔ)上細(xì)胞培養(yǎng)液中加入濃度為100 μg/L的IGF-1，軟骨細(xì)胞每周傳代一次，連續(xù)4周，收集各組每周培養(yǎng)液標(biāo)本，定量檢測(cè)GAG的含量。

1.8軟骨細(xì)胞糖胺多糖（GAG）的定量檢測(cè)

阿利新藍(lán)法測(cè)定軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液中GAG的含量。定量接種5×106個(gè)細(xì)胞放置培養(yǎng)皿中，每周傳代一次，留取所有培養(yǎng)液進(jìn)行檢測(cè)。吸1ml培養(yǎng)液，加入1.5%阿利新藍(lán)溶液1.5ml，常溫放置10min，480nm比色，4-硫酸軟骨素作為標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得樣本GAG含量。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用Microsoft Excel5.0統(tǒng)計(jì)軟件包檢驗(yàn)。計(jì)量資料用x±s表示。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組糖氨多糖含量的比較采用配對(duì)資料t檢驗(yàn)。

圖1　原代軟骨細(xì)胞（100×）

圖2　掃描電鏡下軟骨細(xì)胞100μm

2　結(jié)果

2.1顯微鏡觀察關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的生長(zhǎng)情況

剛分離出的軟骨細(xì)胞呈圓形，有較強(qiáng)折光性。貼壁時(shí)間平均為10h，延伸時(shí)間約24h，7d左右形成單層細(xì)胞，細(xì)胞排列緊密，呈多角形（圖1）。傳代后，軟骨細(xì)胞貼壁時(shí)間平均為3h，延伸時(shí)間約7h。連續(xù)培養(yǎng)至第6周，見細(xì)胞形態(tài)向成纖維細(xì)胞型轉(zhuǎn)化，呈梭形，細(xì)胞間隙變大，輪廓增強(qiáng)，胞漿內(nèi)可見空泡、脂滴，增殖速度減慢。

表1　IGF-1對(duì)豬關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞合成GAG含量的影響（±s，μg）

表1　IGF-1對(duì)豬關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞合成GAG含量的影響（±s，μg）

注：與對(duì)照組相比**表示P＜0.01

組別1周2周3周4周對(duì)照組760±30990±44780±33590±24 IGF-1作用組9101±33**1220±45**850±48**650±25**

2.2掃描電鏡觀察軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)情況

軟骨細(xì)胞接種于PLA包埋PGA的支架上，培養(yǎng)7d，掃描電鏡觀察，細(xì)胞聚集呈膜片狀，軟骨細(xì)胞分泌基質(zhì)旺盛，軟骨細(xì)胞與支架粘附良好，中央不透明為大量細(xì)胞層疊，與支架粘附生長(zhǎng)（圖2）。

2.3軟骨細(xì)胞GAG含量測(cè)定

每組樣本各10例，測(cè)其不同時(shí)段軟骨細(xì)胞GAG的含量，見表1。

3　討論

胰島素樣生長(zhǎng)因子1是一類多功能的細(xì)胞因子，可調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)和糖原的合成與分解，參與細(xì)胞的增殖、分化及凋亡過程［8］。有研究發(fā)現(xiàn)胰島素樣生長(zhǎng)因子1可通過MAPK/ERK信號(hào)通路促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖［9］，在軟骨的修復(fù)重建過程中發(fā)揮重要作用。魏立等［10］的實(shí)驗(yàn)表明濃度為100μg/L的胰島素樣生長(zhǎng)因子1能促進(jìn)大鼠細(xì)胞增殖，抑制其凋亡。肖飛等［11］的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)胰島素樣生長(zhǎng)因子1對(duì)創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎模型兔軟骨細(xì)胞形態(tài)的影響。

本實(shí)驗(yàn)研究表明：軟骨細(xì)胞從傳代第一周開始合成大量的糖胺多糖，第二代傳代細(xì)胞分泌糖胺多糖的能力最強(qiáng)，傳代第三周后，糖胺多糖含量降低，軟骨細(xì)胞增殖能力減退。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了濃度為100μg/L的IGF-1能明顯促進(jìn)傳代軟骨細(xì)胞合成大量的糖胺多糖，表明胰島素樣生長(zhǎng)因子1對(duì)軟骨細(xì)胞的增殖有明顯的促進(jìn)作用。

體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞增殖能力低下限制了組織工程化軟骨的研究。作為一種種子細(xì)胞，體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞增值必須達(dá)到足夠的數(shù)量才有可能生成軟骨［12-13］。本實(shí)驗(yàn)為IGF-1在組織工程化軟骨修復(fù)軟骨缺損中的臨床應(yīng)用及骨關(guān)節(jié)炎的治療提供理論基礎(chǔ)。

［1］朱寶玉，王萬春，唐新橋.創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制研究進(jìn)展［J］.國(guó)際骨科學(xué)雜志，2007，4（28）:245-247.

［2］陳飛飛，田清業(yè)，張祚勇，等.關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)骨與關(guān)節(jié)雜志，2012，1（6）:509-512.

［3］付勤，肖逸鵬，王志為，等.生長(zhǎng)因子促成年兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖的研究［J］.中國(guó)修復(fù)重建外科雜志，2002，16（4）:219-222.

［4］王傳家，李宇，許宏權(quán)，等.豬軟骨細(xì)胞外分泌基質(zhì)功能檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)研究［J］.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2000，13（2）：22-23.

［5］王傳家，李宇，許宏權(quán)，等.一氧化氮對(duì)兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡的影響［J］.實(shí)用美容整形外科雜志，2002，13（6）:324-326.

［6］王傳家，王海魚，許紅權(quán)，等.bFGF對(duì)豬關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞合成氨基葡聚糖的作用［J］.中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2006，15（7）:782-783.

［7］王傳家，王海魚，許紅權(quán)，等.改良豬耳廓軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2007，16（5）:607-608.

［8］Higgins TF，Johnson BD.Effect of exogenous IGF-1 onchondrocyteapoptosisinarabbitintraarticular osteotomymodel［J］.J Orthop Res，2010，28（1）:125-130.

［9］Zhang M，Zhou Q，Liang QQ，et al.IGF-1 regulation of type II collagen and MMP-13 expression in rat endplate chondrocytesviadistinctsignalingpathways［J］. Osteoarthritis Cartilage，2009；17（1）:100-106.

［10］魏立，江莉婷，周琦，等.大鼠髁突軟骨細(xì)胞凋亡與胰島素樣生長(zhǎng)因子1的影響［J］.中國(guó)組織工程研究，2013，17（33）: 5901-5908.

［11］肖飛，陳聚伍，王福建，等.胰島素樣生長(zhǎng)因子-1在家兔骨折愈合過程中的作用［J］.中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2013，30（9）: 1936-1938.

［12］Barbero A，Grogan S，Schfer D，et al.Age related changes in human articular chondrocyte yield，proliferation and postexpansionchondrogeniccapacity［J］.Osteoarthritis Cartilage，2004，12（6）:476-484.

［13］趙廣，荊吉峰，張治宇，等.胰島素樣生長(zhǎng)因子1促進(jìn)創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的體外增殖［J］.中國(guó)組織工程研究，2014，18（2）：183-186.

編輯/張惠娟

Effects of insulin-like growth factor 1 on glycosaminoglycan in pig articular chondrocytes

WANG Chuan-jia，GUAN Kui，JIANG Le-wen，ZHAO Ming-quan，HE Xin-qiang
（Department of Plastic Surgery，The Ninth People′s Hospital of Shenzhen，Shenzhen 518116，Guangdong，China）

Objective To explore the effect of Insulin-like growth factor 1（IGF-1）on the synthesis of glycosaminoglycan（GAG）in pig articular chondrocytes.Methods The articular cartilage of pig were digested by collagenase II and the chondrocytes were collected，5×106/ml/ml cells were planted in culture dish.The cells were cultured with the medium including100μg/L Insulin-like growth factor 1（IGF-1）for up to 4 weeks and the medium were collected per week，none IGF-1 as control.Alcian blue chromatomery was used to detect the change of glycosaminoglycan（GAG）in the medium.The articular chondrocytes were observed under light microscope.5×106/ml chondrocytes were seeded onto the cell-scaffold complex which was formed by PGA high molecular polymer scaffold coated with polylactic acid（PLA），and we observed the complex by scanning electron microscope（SEM）. Results The primary and secondary chondrocytes grew well.The chondrocyes treated by IGF-1 synthesized more GAG compared to the control from 1st to 4th weeks after being subcultured.And the secondary chondrocytes synthesized most GAG.Conclusion Insulin-like growth factor 1 could increase the synthesis of the GAG of chondrocytes.

chondrocyte；cell culture；insulin-like growth factor 1（IGF-1）；glycosaminoglycan

Q813.1

A

1008-6455（2015）09-0034-03

深圳市龍崗區(qū)科技局項(xiàng)目基金資助（項(xiàng)目編號(hào)：ys2012165）

2015-03-05

2015-05-13