盧朝婷 林巧 鞏發(fā)永 肖詩明

摘 要 由于黃曲霉毒素是一種毒性極強的劇毒物質(zhì)，因此人們對它的關(guān)注越來越廣，不斷對高效液相色譜法進行改進與提高，以求得最用快速、簡潔、節(jié)約的方法求得最精確的結(jié)果。基于此，利用高效液相法，通過使用不同的前處理、凈化、衍生、檢測等手段從不同角度對食品中的黃曲霉B1毒素進行檢測，發(fā)現(xiàn)以甲醇-水為提取液、用多功能凈化柱凈化，通過柱后衍生在發(fā)射波長為440 nm、激發(fā)波長為360 nm時對黃曲霉毒素B1的檢出限最大。

關(guān)鍵詞 高效液相色譜；黃曲霉毒素；檢測技術(shù)

中圖分類號：TS207.3；O657.72F592.7 文獻標(biāo)志碼：B 文章編號：1673-890X（2015）24--03

黃曲霉毒素（Aspergillus flavus toxin，AFT）是因為1960年火雞事件而被發(fā)現(xiàn)，黃曲霉毒素已經(jīng)被分離出的有20多種，，其除了包含黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2、等外，尚有多種黃曲霉毒素的代謝產(chǎn)物、異構(gòu)物和相似物等。其中，以黃曲霉毒素B1（AFB1）污染的食品人體的毒性作用是非常嚴(yán)重的。并且根據(jù)人們大量的實驗發(fā)現(xiàn)：黃曲霉毒素的毒性是氰化鉀毒藥的10倍之多，更是砒霜的68倍[1]，除了毒性，黃曲霉毒素的致癌性是二甲基硝胺的75倍，是奶油黃的900倍。黃曲霉毒素不僅會引發(fā)肝癌，也可能引發(fā)腫瘤和各種疾病，通過鏡檢觀察霉菌的菌絲和孢子的形態(tài)特征、孢子排列、以及菌落生長特征等一系列方式，是進行產(chǎn)毒黃曲霉毒素的主要檢測方法。鑒定出菌株的基礎(chǔ)上再進行毒素的檢測。如今人們經(jīng)常用來檢測的黃曲霉毒素的方法一般為以下幾種：薄層色譜法（TLC）；免疫學(xué)方法如：酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）、放射免疫法（RIA）、免疫層析法；高效液相色譜法（HPLC）；免疫學(xué)與儀器結(jié)合法如：免疫親和柱-熒光粉光光度法、免疫親和柱-HPLC；快速測定法如：金標(biāo)免疫層析法等[2]。本文主要介紹了高效液相色譜法檢測黃曲霉毒素B1的研究進展，以及通過使用不同的萃取、凈化、衍生或改變凈化衍生等試驗順序來探討HPLC法對試驗結(jié)果的影響。

1 樣品前處理方法

樣品預(yù)處理通常是將采集好的樣品的提取和純化。通過不同的凈化柱和衍生處理方法，得到的檢出限是不同的。常用的前處理的方法有：乙腈水溶液萃取、甲醇-水溶液萃取和二次萃取。

1.1 液液萃取法（LLE）

在傳統(tǒng)的液液萃取法中，因為毒素在兩種不相互溶解的溶劑中的溶解度不同，因此能將毒素從一種溶劑中轉(zhuǎn)移到另一種溶劑中，通過重復(fù)幾次萃取，將絕大多數(shù)的AFT提取出來。于是，一般通過使用甲醇-水、乙腈-水等有機溶劑提取[3]。吳國華等利用60%乙腈-水溶液萃取樣品中的黃曲霉B1毒素作為試驗前處理，搖床混合30min后，通過槽紋濾紙對濾液進行過濾，然后再濾液加入0.1%的吐溫/PBS稀釋后使用玻璃纖維濾紙對濾液進行過濾，直至濾液澄清為止。然后用免疫親和柱進行凈化，得到的結(jié)果是：在線性范圍內(nèi)，液相法的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R2=0.999 2，回收率為93.7%[4]。張繼斌、汪永曾等在前處理時利用甲醇+水（70+30，V/V）溶液萃取樣品中的黃曲霉B1毒素，并用高速均質(zhì)器均質(zhì)1～2 min，用中速定性濾紙過濾，收集濾液后用免疫親和柱凈化。使用這種前處理的方法得到的結(jié)果是：黃曲霉B1毒素的定量限為0.2 μg/kg[5]。對于脂肪含量較高的樣品可先加乙醚等溶劑。

1.2 固相萃?。⊿PE）

固相萃取使近幾年由以前的萃取技術(shù)相結(jié)合發(fā)展起來的。它的優(yōu)點是較LIE法來說提高了AFT的回收率，能更有效的將AFT與干擾組分分離，而且操作簡單，是目前使用最廣泛的萃取方法之一[6]。Quinto等將小麥粉中的AFT經(jīng)過使用甲醇-磷酸緩沖溶液提取出來，然后用柱后光化學(xué)衍生熒光進行檢測，然后凈化、濃縮。通過采用這種方法發(fā)現(xiàn)FAB1的定量限為0.1～0.63 μg/kg，且在這個范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系[7]。

1.3 超臨界流體萃?。⊿FE）

CO2是超臨界流體萃取最常用的提取劑，但由于這種單組分液體中的溶解度和選擇性有很大的局限性，因此，為了提高提取效率，通常要加入適當(dāng)?shù)母牧紕?，來增強AFT在流體中的溶解度和選擇性。由liau的試驗可以看出，雖然此方法的最低檢測限較好，但是比起其它方法來說，PFE的成本高，需要專門的設(shè)備等一系列原因，因此不適合作為提取AFT的常規(guī)方法[8-9]。

1.4 二次提取

二次提取也可以提高復(fù)雜機制的檢測效率。例如，Vega分析了花生醬中黃曲霉毒素的含量。具體的操作方法：待測物先用15%氯化鈉的甲醇溶液提取，然后再用甲醇進行二次提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)B1的回收率是95.2%[10]。

2 衍生方法

當(dāng)分析物不能及時直接檢測到的，通常需要將待測物質(zhì)與衍生劑發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生一些如熒光特性可檢測的物質(zhì)。當(dāng)檢測出帶熒光的物質(zhì)后，經(jīng)過檢測衍生產(chǎn)物最后來確定待測物質(zhì)。常用的衍生方法有：柱后衍生法、柱前衍生方法等。

2.1 柱后衍生法

柱后衍生方法主要包括柱后溴衍生和柱后碘衍生兩種方法。龍凌云、劉勝利等在檢測黃曲霉毒素的實驗中通過利用ECOSIL HPLC COLUMN（250 mm×4.6 mm，5μm）的色譜柱，將流動相定為：乙腈-甲醇-水（30∶60∶10）混合溶液，控制進樣量和流速分別為：10 μL和1.0 mL/min。方法采用柱后衍生檢測樣品溶液，在0.05%碘溶液濃度的作為衍生物溶液，將衍生泵流量0.3 mL/min，和激發(fā)波長熒光檢測器設(shè)置在360 nm，發(fā)射波長設(shè)定為450 nm。得到的結(jié)果檢出限和定量限分別是AFB1 0.12 μg/kg和0.40 μg/kg[11]。劉柱、陳萬琴等人，利用乙腈-水（體積比86∶14）為提取液，將樣品經(jīng)提取后，經(jīng)多功能凈化柱凈化。以甲醇、乙腈和水溶液作為流動相對樣品進行梯度洗脫，而后在選用C18柱分離，用C18柱分離樣品溶液后，經(jīng)過在線光化學(xué)衍生，并且需要將熒光和二極管陣列測器同時進行測定。在這種操作情況下，發(fā)現(xiàn)黃曲霉B1毒素的檢出限為0.02 μg/kg[12]。

2.2 柱前衍生法

付成平等人發(fā)現(xiàn)在使用三氟乙酸的方法對中草藥提取物的黃曲霉毒素B1進行柱前衍生化實驗的測定，采用柱前三氟乙酸衍生的檢出限為0.1 μg/kg，回收率為80% ～110%[13]。雖然柱前衍生法的靈敏度高，但是由于這種方法的操作繁瑣且穩(wěn)定性不高，因此現(xiàn)在使用這種方法的人越來越少了。

3 檢測方法

高效液相色譜法檢測黃曲霉毒素B1的方法往往有：柱后碘衍生-高效液相色譜法、柱后溴衍生-高效液相色譜法、柱后光化學(xué)衍生化熒光反應(yīng)以及柱前三氟乙酸衍生-高效液相色譜法等幾種不同的方法。因為不同的樣品使用不同的檢測方法得到的結(jié)果可能會不太一樣，所以要盡可能的避免影響試驗結(jié)果的因素。盡管按照各種不同的試驗發(fā)現(xiàn)黃曲霉B1毒素的熒光強度較弱，可是由于熒光檢測器具備高靈敏度、高選擇性及干擾峰少等長處。因此，熒光檢測器的反向HPLC法亦在大量的研究當(dāng)中，成為近代檢測黃曲霉毒素的主要方法。但由于黃曲霉B1毒素的熒光度較弱，若直接測定熒光度會影響實驗的靈敏度和準(zhǔn)確度，但是衍生可增強黃曲霉B1毒素的熒光強度。

3.1 柱后衍生熒光化熒光檢測

彭志兵等人對樣品經(jīng)過液液萃取精華的前處理方式將黃曲霉毒分離后，采用柱后碘衍生的處理方法，并使用高效液相色譜熒光檢測器測定糧食中的黃曲霉毒素。結(jié)果發(fā)現(xiàn)利用該方法不僅檢測時間短，僅在24 min內(nèi)完成測試，而且黃曲霉毒素線性關(guān)系的r值均高于0.999 5，回收率為80.3% ～97.0%，檢出限小于0.40 μg/kg[14]。這種方法不僅線性關(guān)系好，而且回收率較高，速度較快，更能滿足于人們對黃曲霉毒素的檢測所追求的快速和精準(zhǔn)。

3.2 柱后光化學(xué)衍生化熒光檢測

邱文倩、傅武勝等利用柱后光化學(xué)衍生，將樣品經(jīng)提取、免疫親和柱凈化后，以甲醇-水為流動相，經(jīng)柱后光化學(xué)衍生并通過熒光檢測器定量，結(jié)果得出：通過采用柱后衍生的方法得到的黃曲霉毒素的回收率為94.2%～97.5%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.6%～5.8%[15]。我們能夠看出利用這種方法的重復(fù)性好，并且有靈敏度高，能滿足食品中黃曲霉毒素基本的定性定量的檢測要求。

3.3 柱前三氟乙酸衍生化熒光檢測

在柱前三氟乙酸衍生熒光檢測是國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5009.23-2006 中的第三法。這種方法的原理是使用乙腈-水溶液將試樣中的黃曲霉毒素進行提取，然后將提取液過濾后，經(jīng)過裝有反相離子交換吸附劑的多功能凈化柱，目的是為了去除脂肪、蛋白質(zhì)等干擾物質(zhì)。通過使用三氟乙酸溶液對凈化液中的黃曲霉毒素進行衍生，并且通過附有熒光檢測器的液相色譜系統(tǒng)對此反應(yīng)進行分析，然后用外標(biāo)法進行定量[16]。但由于其操作繁瑣，穩(wěn)定性弱，樣品吹干易造成損失。因此，人們漸漸開始使用檢測黃曲霉毒素的柱后衍生化方法。

試驗發(fā)現(xiàn)采用柱后衍生法的優(yōu)點是準(zhǔn)確、靈敏度高、簡便能夠滿足食品中黃曲霉毒素定性定量檢測要求

4 方法學(xué)分析

瑞豐等利用三氟乙酸在40 ℃條件下衍生15 min后定容，在熒光檢測器下檢測，發(fā)現(xiàn)樣品的回收率在72%～82.3%，檢出限為0.002 μg/kg[17]。畢瑞峰等人通過用串聯(lián)質(zhì)譜的檢測方法發(fā)現(xiàn)，樣品經(jīng)處理后用電噴霧離子化三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜測定，發(fā)現(xiàn)在各自的線性范圍內(nèi)，峰面積與其濃度的線性關(guān)系良好，其檢出限、定量限和平均回收率分別為0.009～0.04 μg/kg、0.03～ 0.12 μg/kg、63.0%～78.5%[18-19]。王新麗等人在試驗中通過利用高效液相色譜柱對樣液進行分離后，將樣品經(jīng)過柱后衍生裝置并且與碘溶液發(fā)生反應(yīng)，最后進入熒光檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用該方法對黃曲霉毒素B1的檢出限為0.03 μg/kg，定量限為0.1 ng/ mL，低、高濃度的回收率分別為：82.3%，85.7%[20]。由前人們的大量試驗及結(jié)果分析，我們可以看出，通過采用柱后衍生的方法在發(fā)射波長、激發(fā)波長分為440、360nm時對黃曲霉毒素B1的檢出限最大。

5 結(jié)語

因為黃曲霉毒素對人體的危害巨大，受到全世界的廣泛關(guān)注且人們對食品質(zhì)量安全意識的逐步增加，全國政府對食品中的黃曲霉毒素特別是AFB1的含量要求越來越嚴(yán)格。不斷的推動了AFB1的檢測方法的研究進展。黃曲霉毒素的檢測方法層出不窮，其中以高效液相色譜法使用最為廣泛，受人們研究最多，產(chǎn)生了許多種不同的方法對樣品進行取樣、凈化、衍生等，對不同類型的食品使用不同的處理方法，以求使結(jié)果最為準(zhǔn)確，過程最為簡潔，效率最高。

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（責(zé)任編輯：劉昀）