鄭榮斌　余燕

[摘要] 目的 檢測血液制品及原料血漿中人細小病毒B19，分析污染狀況，以評估人細小病毒B19危險性。 方法 對單人原料血漿、混合原料血漿、4種類型的血液制品提取核酸后分別進行B19病毒核酸實時定量PCR檢測篩查，對篩查結(jié)果進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。 結(jié)果 實驗檢測到個人血漿陽性率為0.267%、混合血漿感染5.45%、靜注人免疫球蛋白感染0、人纖維蛋白原感染5.67%、人凝血因子Ⅷ和人凝血酶原復合物陽性率分別為7.41%和10.3%。 結(jié)論 盡管國內(nèi)在血液制品生產(chǎn)工藝中使用了滅活/去除B19病毒的方法，但在本研究中篩查的原料血漿及血液制品中仍檢測出了B19 DNA。

[關鍵詞] 血液制品；原料血漿；人細小病毒B19基因；熒光定量PCR

[中圖分類號] R927.2 [文獻標識碼] B [文章編號] 2095-0616（2015）13-151-03

[Abstract] Objective To test human bocavirus B19 in blood products and source plasma， and evaluate the danger of human bocavirus B19 by analyzing its contamination status. Methods Real-time quantitative PCR testing and screening of B19 nucleic acid was made after extracting nucleic acid from single source plasma， mixed source plasma and four types' blood products， and the screening results were statistically analyzed. Results The results were tested in laboratory including 0.267% positive rate of single plasma， 5.15% of contamination in mixed plasma， 0 of contamination in intravenous injection of human immunoglobulin， 5.67% of contamination in human fibrinogen， 7.41% positive rate of human coagulation factor Ⅷ and 10.3% positive rate of human prothrombin complex. Conclusion Although the methods to inactivate or eliminate B19 virus in production process of blood products， B19 DNA is still tested in the screening source plasma and blood products in this research.

[Key words] Blood products； Source plasma； Human bocavirus B19 gene； Fluorescence quantitative PCR

近年來，血液制品在某些特定疾病的治療起著不可替代的作用，伴隨著血液制品越來越受到廣大患者的需求的同時，一些具有潛在危害的病毒漸漸引起人們的關注，這其中人細小病毒對長期輸注血液制品的患者所引發(fā)的安全性危害問題更加受到國際社會的密切關注。人細小病毒B19（Human Parvovirus B19）是目前已知導致人類致病的細小病毒之一。臨床表現(xiàn)為傳染性紅斑、短暫的關節(jié)炎疼痛、因慢性骨髓障礙導致慢性貧血等多種疾病[1-3]。人細小病毒B19由于其病毒顆粒直徑僅20～25nm、無膜包被的生物學特性使其很難在病毒滅活工藝中除去，并且它能夠抵抗多種生產(chǎn)中使用的病毒滅活方法，包括S/D法[4]、高溫滅活法。目前已有資料證明B19可經(jīng)由S/D法和一定干熱滅活法處理的血液制品傳播[5-7]。因此，對血液制品的檢測、篩查及B19篩查方法的建立對保護患者

的健康至關重要。本次實驗擬采用B19核酸檢測試劑盒，對華南地區(qū)的原料血漿和血液制品隨機采樣進行了檢測和分析，為進一步了解華南地區(qū)的血液制品 B19病毒的感染和污染情況提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

選取2013年12月～2014年12月華南地區(qū)（以廣東省為主）的2家血液制品公司的血液制品（包含人凝血因子Ⅷ54批、人纖維蛋白原53批、人凝血酶原復合物58批、靜注人免疫球蛋白55批），在血液中心采取6000份個體血漿，在隨機抽取的2家血液制品公司生產(chǎn)用混合血漿65份[樣本的采集、運輸及保存均符合《中國藥典》三部（2010版）生產(chǎn)用人血漿規(guī)程要求]。

1.2 試劑與儀器

實驗采用試劑盒法對采取的樣品進行小病毒核酸的提取。

主要儀器：美國ABI公司的PCR儀；VeritiTM96 Well Thermal Cycler，熒光定量PCR擴增儀：7300 Real-Time PCR System，紫外-可見分光光度計（GE，GeneQuant1300），恒溫水浴箱、生物安全柜、高速離心機及高速冷凍離心機。

試劑盒：Nucleus Acid Isolation Kit（Spin Column Method）、人細小病毒B19病毒核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法），均購自上?？迫A生物工程股份有限公司。Premix Ex Taq TM（2x）購自TaKaRa公司。endprint

1.3 實驗方法

1.3.1 PCR引物探針 根據(jù)相關文獻報道的關于人細小病毒B19 DNA 的TaqMan探針及對應的引物 [8]。用Primer Premie 5.0軟件對此探針和引物序列進行評價。見表1。

1.3.2 細小病毒DNA的提取 血漿樣品用1.5mlEP管標記后每份提取200μL，加入200μL緩沖液（現(xiàn)配）使用上?？迫A生物工程股份有限公司核酸提取試劑盒，在經(jīng)過78℃恒溫處理及分別經(jīng)過8000、12000rpm/min離心處理后，最終獲得每份DNA為50μL，樣品在-30℃保存?zhèn)溆?。血液制品各類樣品進行濃縮后，同血漿樣品提取方法最終獲得50μL/份，-30℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 實時定量PCR反應體系和反應條件 經(jīng)多次實驗及參考廠家人細小病毒B19病毒核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）說明書，最終確定反應體系為PCR擴增體系50μL：Premix Ex Taq TM（2x）25μL，引物各1μL（10mmol/L），探針1μL（10mmol/L）DNA模板2μL。反應條件為：95℃預變性10min；95℃變性30s，53℃退火30s，68℃延伸30s，共45個循環(huán)；68℃延伸10min。

1.3.4 細小病毒DNA的檢測 在經(jīng)過對每份血漿及其制品的DNA提取之后，每份核酸樣品使用實時定量PCR擴增檢測，每個樣品設三個復孔檢測，陽性對照為上?？迫A生物工程股份有限公司人細小病毒B19病毒核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）中自帶陽性對照，同時設無模板陰性對照（NTC）。

1.4 判定標準

陰性結(jié)果判定：熒光信號無增長，沒有典型S型擴增曲線；陽性結(jié)果判定：熒光信號增長明顯，典型的S型擴增曲線。

2 結(jié)果

2.1 單人份血漿檢測結(jié)果

在血液中心隨機抽取的6000份個體血漿樣中，用熒光PCR技術檢測B19 DNA，檢出陽性16份。

2.2 混合血漿檢測結(jié)果

在2家血液制品公司中隨機抽取的165份生產(chǎn)用混合血漿中，共檢出陽性9份。

2.3 血液制品檢測結(jié)果

隨機抽取的55批靜注人免疫球蛋白樣品，B19病毒DNA 檢測結(jié)果均為陰性；在抽取的53批的人纖維蛋白原樣品中，有3批為陽性；在54批次的人凝血因子Ⅷ樣品中，結(jié)果4批檢測為陽性；抽取58批次的人凝血酶原復合物樣品中，檢測出6次為陽性。見表2。

3 討論

目前，我國也無對血液制品人細小病毒的強制檢測規(guī)定。目前在國外已有B19 DNA污染血液制品的報道，然而B19 DNA在中國血液制品中的污染情況尚沒有展幵廣泛調(diào)查。本次實驗通過對華南地區(qū)血液制品的檢測篩查，統(tǒng)計數(shù)據(jù)，使得人們更加直觀的了解到目前國內(nèi)血液制品所存在的安全性問題。

血液制品在當今臨床醫(yī)療急救中起到了不可替代的作用。然而，隨著血液制品的推廣使用，至今也時有血液病傳染的發(fā)生[9-11]。雖然現(xiàn)階段的采集血樣均經(jīng)過篩查、工藝消毒及逐步檢查管理，已經(jīng)大幅度的降低了病毒的感染，保證血液制品使用的安全性[12]。傳統(tǒng)的去除/滅活病毒工藝對包膜病毒（如HIV、HBV和HCV）是十分有效的，但不能去除/滅活非包膜病毒（如B19），因此B19污染血液制品的潛在風險仍然存在。原因有以下幾點：（1）原料血衆(zhòng)均為超過5000份/批次的混裝，存在很大的B19污染風險，更嚴重的是，在病毒血癥期，B19在感染者體內(nèi)濃度可達1010copies/mL以上。（2）B19病毒由于其耐熱性以及病毒顆粒微小的特性極易逃脫傳統(tǒng)病毒的去除/滅活（如熱處理法和過濾法）處[13-16]。（3）B19此類微小病毒具有耐熱性強、穿透性強的特點，在已知的過濾法及熱處理法中都不能有效去除該類病毒，為血液制品的使用安全流下隱患。

本研究采用實時熒光定量PCR法對采集的樣品進行了針對B19病毒DNA的篩查，實驗方法未能檢出靜注人免疫球蛋白樣品陽性，個人血漿感染率為0.267%，而混合血漿及血液制品的陽性污染達到了很高的概率。查閱國內(nèi)外文獻報道記載的混合血漿感染率略高于本次調(diào)查，這可能與地域有關。查閱美國文獻[17]報道原料血漿在經(jīng)過熒光定量PCR檢測的血液制品中人細小病毒B19的感染率從原來的56%～100%降至13%～27%，說明光定量PCR檢測方式可以起到一定的效果。

目前，國內(nèi)尚無明確檢查B19病毒核酸的方法，國內(nèi)在B19病毒方面的分布狀況研究尚不系統(tǒng)。因此針對國內(nèi)數(shù)據(jù)缺乏足夠的基礎理論。通過對華南地區(qū)血液制品進行B19病毒核酸的檢測與分析，不僅可以分析目前國內(nèi)血液制品細小病毒的安全問題，也可為今后的制定B19病毒核酸的篩查方式提供理論基礎。

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（收稿日期：2015-03-19）endprint