仇汝龍++范志宇++王芳++胡波++宋艷華++魏后軍++劉星++徐為中+薛家賓

摘要：兔出血癥病毒（RHDV）感染成年兔可以誘導(dǎo)兔體內(nèi)產(chǎn)生強(qiáng)烈的炎性反應(yīng)，是病毒感染后急性死亡的重要原因之一。為揭示病毒感染機(jī)體后體內(nèi)重要炎性因子的表達(dá)情況，采用熒光定量PCR方法檢測(cè)RHDV感染后6、12、24、30、36 h兔外周血、肝臟和脾臟內(nèi)病毒增殖情況以及IL-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ炎性因子的表達(dá)情況。結(jié)果表明，兔出血癥病毒拷貝數(shù)在外周血、肝臟和脾臟內(nèi)隨著感染時(shí)間的變化呈快速上升的趨勢(shì)。外周血、肝臟和脾臟在病毒感染中，促炎性因子IL-6和TNF-α表達(dá)水平都明顯上調(diào)。肝臟促炎性因子IL-6在30 h左右達(dá)到最大值，而在外周血和脾臟中則持續(xù)上調(diào)。抑炎因子IL-10隨著炎性因子的上調(diào)也隨之上升，但其表達(dá)水平只有較低程度的上調(diào)。IFN-γ相對(duì)表達(dá)水平在肝臟和脾臟有短暫的上調(diào)，在外周血中則持續(xù)下調(diào)。

關(guān)鍵詞：兔出血癥病毒；炎性因子；熒光定量PCR；外周血；脾臟；肝臟

中圖分類號(hào)： S852.65；S858.291文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2016）02-0238-03

收稿日期：2016-01-20

基金項(xiàng)目：現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)兔體系病毒病預(yù)防與控制崗位專項(xiàng)（編號(hào)：CARS-44-C-1）；公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（編號(hào)：201303046）；江蘇省自然科學(xué)基金（編號(hào)：BK20140740）。

作者簡(jiǎn)介：仇汝龍（1988—），男，山東濟(jì)寧人，碩士研究生，助理研究員，主要從事家兔疾病防治與獸醫(yī)生物技術(shù)研究。E-mail：qrl8891@163.com。

通信作者：王芳，博士，研究員，主要從事家兔重要疫病致病機(jī)制及防控技術(shù)的研究。E-mail：rwangfang@126.com。

兔出血癥（RHD）是對(duì)野兔和家兔具有高度傳染性的疾病，其病原是兔出血癥病毒（RHDV），屬于杯狀病毒家族的兔病毒屬[1]。感染兔出血癥病毒的成年兔在48～72 h內(nèi)死亡[2]，死亡原因主要為肝臟快速衰竭并伴隨強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)。在免疫反應(yīng)中，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的正是信號(hào)通路及細(xì)胞因子。

細(xì)胞因子是調(diào)節(jié)性蛋白，在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)中的細(xì)胞反應(yīng)階段有著重要的作用，包括淋巴細(xì)胞的激活、增殖、分化、存活和凋亡[3]。它們是低分子量蛋白，主要是由淋巴細(xì)胞、抗原呈遞細(xì)胞、單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和纖維細(xì)胞等分泌。細(xì)胞因子可分為不同的類別，比如白介素、干擾素、腫瘤壞死因子和趨化因子等。細(xì)胞因子相互作用，施展極化效應(yīng)于T細(xì)胞并且調(diào)整免疫反應(yīng)[4]。CD4+亞群（Th細(xì)胞）根據(jù)自身所分泌的細(xì)胞因子，分為Th1和Th2亞群。Th1細(xì)胞分泌IFN-γ、淋巴毒素和IL-2，可以刺激炎癥反應(yīng)，比如遲發(fā)型超敏反應(yīng)，促進(jìn)補(bǔ)體的產(chǎn)生和細(xì)胞毒性T細(xì)胞分化。Th2細(xì)胞分泌IL-4、IL-5和IL-10等，調(diào)節(jié)體液免疫反應(yīng)[5-6]。多數(shù)研究證明宿主感染的程度以Th1和Th2細(xì)胞為基礎(chǔ)[7]。IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IFN-γ和TNF-α等[8-11]兔細(xì)胞因子序列的發(fā)表，促使檢測(cè)兔細(xì)胞因子的分子生物學(xué)試驗(yàn)的產(chǎn)生。熒光定量PCR具有敏感性和結(jié)果快速性，可以作為檢測(cè)細(xì)胞因子的方法。本研究通過(guò)熒光定量的方法，檢測(cè)感染RHDV兔體內(nèi)病毒拷貝數(shù)和炎性因子的變化，為研究兔出血癥病毒的感染及致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1病毒和試驗(yàn)兔

兔出血癥病毒（由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所保存）；新西蘭成年白兔40只，購(gòu)自南京金陵種兔場(chǎng)。

1.2主要試劑和儀器

Trizol RNAiso plus，反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）和熒光定量試劑SYBR Premix EX Taq，均購(gòu)自Takara公司。pMD18-T Vector和大腸桿菌DH5α均購(gòu)自南京基天生物公司，熒光定量機(jī)器Stepone 7300，人外周血淋巴細(xì)胞分離液，購(gòu)自天津市灝洋生物制品有限責(zé)任公司。

1.3引物

炎性因子IL-6、IL-10、IFN-γ和TNF-α的檢測(cè)引物[12]見(jiàn)表1，VP60模板引物及VP60檢測(cè)引物建立標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測(cè)樣品[13]。引物由Invitrogen公司合成。

1.4試驗(yàn)動(dòng)物分組和取樣

將40只新西蘭兔分為5組，每組5只攻毒兔和3只對(duì)照兔，兔攻毒采用頸部皮下注射0.5 mL HA為28 RHDV的肝懸液。5組兔分別在攻毒后6、12、24、30、36 h取樣后殺死。血液通過(guò)心臟采血，采集后立即分離淋巴細(xì)胞和血清，肝臟和脾臟則保存于-70 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

1.5.1炎性因子RNA提取外周血淋巴細(xì)胞、肝臟和脾臟的RNA提取采用Trizol法。按照6、12、24、30、36 h取樣，取外周血3 mL采用淋巴細(xì)胞分離液分離淋巴細(xì)胞后提取RNA。肝臟和脾臟則稱取0.5g勻漿提取RNA。提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

1.5.2病毒RNA提取病毒拷貝數(shù)的定量，采用外周血血清提取RNA，組織則采用0.5 g肝臟和脾臟的勻漿上清液來(lái)提取RNA[14]。提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

1.6熒光定量PCR檢測(cè)和計(jì)算

1.6.1炎性因子的檢測(cè)炎性因子檢測(cè)的熒光定量體系：SYBR Mix 10 μL，PCR上下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL，ROX 0.4 μL，DNA 模板2 μL，ddH2O 6.8 μL。程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，循環(huán)40次；熔解曲線默認(rèn)設(shè)置。分析數(shù)據(jù)：細(xì)胞因子數(shù)據(jù)分析采用2-ΔΔCT方法，計(jì)算相對(duì)表達(dá)水平。

1.6.2病毒拷貝數(shù)的檢測(cè)病毒拷貝數(shù)的檢測(cè)需要進(jìn)行絕對(duì)定量，定量體系和程序見(jiàn)“1.6.1”節(jié)。結(jié)果根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算。

2結(jié)果與分析

2.1外周血淋巴細(xì)胞的炎性因子和外周血病毒拷貝數(shù)

感染RHDV的兔外周血中的病毒拷貝數(shù)迅速上升，導(dǎo)致病毒隨血液在兔體內(nèi)傳播（圖1-A）。炎性因子IL-6和TNF-α表達(dá)水平則持續(xù)上升直到36 h（圖1-B和圖1-C），說(shuō)明炎癥反應(yīng)加劇，而抗炎因子IL-10作為最重要的保護(hù)性因子，在外周血淋巴細(xì)胞中并沒(méi)有檢測(cè)出其mRNA的表達(dá)。IFN-γ在感染病毒的外周血中持續(xù)下調(diào)（圖1-D）。

2.2肝臟炎性因子和病毒拷貝數(shù)

肝臟作為RHDV感染中急性衰竭的部位，病毒拷貝數(shù)快速上升直到36 h（圖2-A），炎性因子IL-6和TNF-α也快速上升，表明炎癥反應(yīng)加劇，IL-6相對(duì)表達(dá)水平在30 h達(dá)到最大值，之后則相對(duì)表達(dá)水平大大降低（圖2-B和圖2-C）。不同于外周血，抗炎因子IL-10在肝臟中相對(duì)表達(dá)水平持續(xù)處于上調(diào)的趨勢(shì)（圖2-D）。IFN-γ在肝臟30 h則有短暫的上調(diào)（圖2-E）。

2.3脾臟細(xì)胞因子和病毒拷貝數(shù)

兔體感染RHDV后，脾臟內(nèi)病毒的拷貝數(shù)也持續(xù)上升并在30 h達(dá)到較高水平（圖3-A）。炎性因子IL-6和TNF-α同肝臟一樣，處于較高水平的表達(dá)（圖3-B和圖3-C），不同的是脾臟IL-6持續(xù)升高直到36 h?？寡滓蜃覫L-10表達(dá)水平也有上調(diào)，在30 h達(dá)到最大值（圖3-D）。脾臟的IFN-γ相對(duì)表達(dá)水平與肝臟相似在30 h都有短暫的上調(diào)，然后迅速下調(diào)（圖3-E）。

3討論

近年來(lái)的研究表明，炎性因子（IL-1β、IL-6、TNF-α等）的急性升高在“暴發(fā)性肝臟衰竭” 中有著重要作用，是RHDV感染引起重癥炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵因素。對(duì)炎性因子的研究，可以闡述細(xì)胞免疫在RHDV感染病毒清除和肝損傷中的作用，深化免疫損傷理論認(rèn)識(shí)，為發(fā)展特異性免疫治療手段提供了科學(xué)依據(jù)。炎性因子作為調(diào)節(jié)性因子存在于整個(gè)免疫反應(yīng)階段，通過(guò)熒光定量PCR對(duì)炎性因子的跟蹤檢測(cè)可以對(duì)RHDV感染引發(fā)的炎癥反應(yīng)進(jìn)行深入的研究和了解。

本研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法，對(duì)感染RHDV的兔體內(nèi)病毒拷貝數(shù)和炎性因子進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)合感染后不同時(shí)間點(diǎn)的相關(guān)結(jié)果分析，可以對(duì)RHDV感染兔體后的體內(nèi)傳播和引發(fā)的炎癥反應(yīng)有較為深刻的了解。

兔出血癥病毒在感染成年兔后，體內(nèi)病毒隨血液到達(dá)全身，并且快速增殖直到36 h，作為靶器官的肝臟和脾臟內(nèi)病毒積累量快速上升。病毒量在靶器官增多的同時(shí)，炎性因子IL-6和TNF-α的相對(duì)表達(dá)水平在外周血、肝臟和脾臟中都大幅度上調(diào)，暗示炎癥反應(yīng)的加劇。隨著炎癥反應(yīng)的加劇，保護(hù)性抗炎因子IL-10相對(duì)表達(dá)水平也有一定程度的上調(diào)，以調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。但是炎癥反應(yīng)一直處于加劇的趨勢(shì)，說(shuō)明炎癥反應(yīng)沒(méi)有得到有效的控制。肝臟和脾臟中具有抗病毒能力的IFN-γ雖然有一定程度的上調(diào)，并不能阻止病毒在兩者中的增殖。感染兔出血癥病毒的兔體內(nèi)暴發(fā)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致免疫反應(yīng)的失衡，抗炎因子無(wú)法起到保護(hù)作用，從而導(dǎo)致肝臟等組織器官衰竭和死亡[15]。總之，感染RHDV的兔體內(nèi)炎癥反應(yīng)的不斷加劇，病毒的快速增殖和在靶器官的不斷積累可能最終是導(dǎo)致兔快速死亡的重要原因。本研究為兔出血癥病毒感染和致病機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)。

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