郭紅艷 孫曉杰 李淑艷 劉秀財(cái) 劉 波 王宏蘭 蔣瑞雪

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

蛋白激酶(SGK)可能作為多種細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和細(xì)胞磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)的一個(gè)功能性交匯點(diǎn)，通過作用于下游底物參與信號(hào)通路和細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)的調(diào)節(jié)，并且在腫瘤的形成、腫瘤細(xì)胞浸潤或遷移及惡性轉(zhuǎn)化過程中起到重要的作用〔1，2〕。N-端增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(pEGFP-N1)具有復(fù)制能力強(qiáng)、檢出率高、無細(xì)胞毒性、易于構(gòu)建融合蛋白等特點(diǎn)，是常用的表達(dá)載體。本實(shí)驗(yàn)利用DNA重組技術(shù)方法構(gòu)建pEGFP-N1-SGK3重組質(zhì)粒，為SGK3與腫瘤發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞和質(zhì)粒 乳腺癌細(xì)胞株MCF-7由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所提供，細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。本研究所用pAcG-4T3-SKG3質(zhì)粒由美國霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院夏獻(xiàn)民博士惠贈(zèng)，pAcG-4T3-SKG3質(zhì)粒含有人SGK3 cDNA基因，全長為1.3 kb，含BamH I和Xho I酶切位點(diǎn)。

1.1.2 主要試劑和抗體 RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基(Gibco)、新生牛血清(PAA)、胰酶(DIFCO)購買于Invitrogen(USA)公司;細(xì)胞培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板購自英國Nunc公司;BamH I和Xho I購自寶生物工程有限公司;anti-甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、anti-SGK3、購自美國CST公司，二抗購自美國SANTA CRUZ公司，本研究所用引物由上海生工合成。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR獲取目的基因 提取pAcG-4T3-SKG3質(zhì)粒，根據(jù)SGK3和pEGFP-N1載體的序列，選擇XhoⅠ和BamH I酶切位點(diǎn)，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法從pAcG-4T3-SKG3質(zhì)粒中擴(kuò)增目的基因，SGK3正義序列:5'CCGCTCGAGACCATGGCCCTGAAGATTC3'，反義序列:5'CGCGGATCCAAAAATAAGTCTTCTG 3'。PCR反應(yīng)條件:95℃ 預(yù)變性10 min，95℃變性 45 s，50℃ 退火 45 s，72℃ 延伸80 s，循環(huán)30 次，72℃，10 min，4℃ 保存。PCR 產(chǎn)物進(jìn)行 1.0%瓊脂糖凝膠電泳，回收SGK3基因片段。

1.2.2 pEGFP-N1-SGK3重組質(zhì)粒的構(gòu)建 純化后的PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和BamH I雙酶切后與同樣酶切的載體pEGFP-N1進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌(DH5α)感受態(tài)菌中，繼而將其轉(zhuǎn)移到含Kanamycin的LB瓊脂培養(yǎng)基上，觀察菌落生長情況;挑菌進(jìn)行菌落PCR，提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切鑒定，陽性菌株送至上海invitrogen公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果與Genbank源基因用軟件網(wǎng)絡(luò)ClustalW進(jìn)行基因比對，將鑒定后的重組質(zhì)粒命名為pEGFP-N1-SGK3。

1.2.3 基因轉(zhuǎn)染 采用GenEscortTMⅠ 進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，生長良好的MCF-7細(xì)胞于轉(zhuǎn)染前24 h接種到6孔板中，待細(xì)胞總面積達(dá)到60% ～80%，取3 μg pEGFP-N1-SGK3質(zhì)粒進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染，同時(shí)轉(zhuǎn)染pEGFP-N1空載體作為對照(具體操作按說明書進(jìn)行)。在轉(zhuǎn)染后48 h，在熒光顯微鏡下觀察pEGFP-N1表達(dá)情況，確定轉(zhuǎn)染效率。

1.2.4 Western印跡檢測融合蛋白表達(dá) 收集各組細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白并測定細(xì)胞總蛋白濃度。取50 μg蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，轉(zhuǎn)膜，將硝酸纖維素(NC)膜用5%的脫脂奶粉室溫封閉2 h，按1∶1000稀釋一抗，4℃孵育過夜，洗膜后，加入1∶5000的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h，用Tris鹽酸緩沖液(TBST)室溫漂洗后顯影，采用化學(xué)發(fā)光法(ECL)曝光膠片，沖洗顯色檢測相應(yīng)的蛋白條帶，GPS8000型凝膠成像分析系統(tǒng)掃描分析蛋白條帶。

2 結(jié)果

2.1 重組表達(dá)載體菌落PCR 平板菌落密集，圓形，稍凸起，大小中等，分布均勻，邊緣整齊，表面有光澤、濕潤、光滑，呈乳白色。為初步確定重組質(zhì)粒構(gòu)建結(jié)果，挑4～6個(gè)單菌落進(jìn)行PCR，產(chǎn)物序列大小與目標(biāo)條帶一致。見圖1。

圖1 重組表達(dá)載體菌落PCR

2.2 重組質(zhì)粒pEGFP-N1-SGK3的酶切鑒定 重組質(zhì)粒pEGFP-N1-SGK3經(jīng)XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切后，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果可見約1.3 kb的DNA帶，表明所獲SGK3酶切片段的大小與預(yù)期相符。見圖2。

2.3 測序鑒定轉(zhuǎn)化菌 對轉(zhuǎn)化菌的質(zhì)粒進(jìn)行DNA測序，測序結(jié)果表明，所選送測序的重組表達(dá)載體堿基序列完全正確，見圖3。

圖2 重組質(zhì)料pEGFP-N1-SGK3的酶切鑒定

圖3 測序結(jié)果

2.4 轉(zhuǎn)染效果評價(jià) 轉(zhuǎn)染后48 h后倒置熒光顯微鏡觀察，視野內(nèi)有較強(qiáng)的綠色熒光，即證明有綠色熒光蛋白GFP的表達(dá)。說明各表達(dá)載體成功轉(zhuǎn)染入乳腺癌mCF-7細(xì)胞中。見圖4。

圖4 轉(zhuǎn)染效果評價(jià)

2.5 轉(zhuǎn)染細(xì)胞中SGK3蛋白表達(dá)的鑒定 重組質(zhì)粒pEGFPN1-SGK3和空載體質(zhì)粒pEGFP-N1分別轉(zhuǎn)染MCF7后，通過Western印跡方法用抗GFP的抗體對轉(zhuǎn)染細(xì)胞中融合蛋白SGK3-GFP的表達(dá)進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SGK3在MCF-7細(xì)胞中能夠表達(dá)，且融合蛋白SGK3-GFP的表達(dá)量(0.7081±0.0595)略高于空載體中GFP的表達(dá)量(0.5847±0.0251)。見圖5。

圖5 Westem印跡法檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞中融合蛋白SGK3-GFP的表達(dá)

3 討論

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤，目前該病被認(rèn)為是影響女性身心健康乃至危及生命的殺手之一〔3〕，現(xiàn)代免疫學(xué)、分子生物學(xué)技術(shù)得以迅速發(fā)展，人類對乳腺癌發(fā)病機(jī)制研究不斷深入，多種乳腺癌相關(guān)基因被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)并進(jìn)行廣泛研究，基因靶向治療逐漸成為乳腺癌生物學(xué)治療中的重要部分〔4〕。

通過磷酸蛋白組學(xué)篩選和功能基因組研究發(fā)現(xiàn)，許多腫瘤細(xì)胞系表現(xiàn)出SGK3的依賴性〔1〕。在前列腺癌、卵巢癌和肝癌中等多種腫瘤中都發(fā)現(xiàn)了SGK3的表達(dá)與正常組織有較大差異。已有證據(jù)提示SGK3可作為某些腫瘤的預(yù)后標(biāo)志物和用于治療腫瘤的新目標(biāo)〔5〕。對該基因與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性研究國內(nèi)外至今鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)測序結(jié)果表明，成功構(gòu)建真核表達(dá)載體pEGFP-N1-SGK3，經(jīng)多次轉(zhuǎn)染條件的摸索，利用高效GenEscortTMI基因轉(zhuǎn)染試劑將SGK3轉(zhuǎn)染MCF-7人乳腺癌細(xì)胞，使之轉(zhuǎn)染MCF7細(xì)胞后48 h轉(zhuǎn)染效率達(dá)70%以上，Western印跡方法檢測證實(shí)，目的基因在乳腺癌細(xì)胞中能夠有效地表達(dá)。上述研究為進(jìn)一步研究SGK3與乳腺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系及其對乳腺癌的惡性行為的影響極其機(jī)制研究等后續(xù)工作打下了基礎(chǔ)。

1 Wang Y，Zhou D，Phung S，et al.SGK3 is an estrogen-inducible kinase promoting estrogen-mediated survival of breast cancer cells〔J〕.Mol Endocrinol，2011;25(1):72-82.

2 Liu M，Chen L，Chan TH.Serum and glucocorticoid kinase 3 at 8q13.1 promotes cell proliferation and survival in hepatocellular carcinoma〔J〕.Hepatology，2012;55(6):1754-65.

3 潘 峰，潘躍銀.乳腺癌分子靶向治療的新進(jìn)展〔J〕.中華疾病控制雜志，2010;14(6):566-9.

4 張柏林，宋豐舉.乳腺癌基因組學(xué)研究進(jìn)展〔J〕.中國腫瘤臨床，2014;41(3):207-10.

5 Liu HK，Wang Q，Li Y，et al.Inhibitory effects of γ-tocotrienol on invasion and metastasis of human gastric adenocarcinoma SGC-7901 cells〔J〕.J Nutr Biochem，2010;21(2):206-13.