張 穎 張向陽(yáng) 陳玉嵐 歐陽(yáng)菊艷 王 瑜 王 玲 王 紅

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院干部病房，新疆 烏魯木齊 830011)

原發(fā)性高血壓是多因素多基因疾病，目前發(fā)病機(jī)制仍未闡明。其中血漿同型半胱氨酸(Hcy)增高已被普遍認(rèn)為是心血管疾病的危險(xiǎn)因素，并且可能參與了高血壓的病理生理過(guò)程〔1〕。胱硫醚β-合成酶(CBS)是Hcy代謝途徑中的關(guān)鍵酶之一，其基因突變可導(dǎo)致CBS活性明顯降低，從而引起高同型半胱氨酸血癥。CBS T833C是其較常見(jiàn)的多態(tài)性位點(diǎn)，但近年來(lái)關(guān)于該位點(diǎn)研究主要集中于腦血管疾病領(lǐng)域〔2〕，而與高血壓的關(guān)系研究較少，與新疆哈薩克族原發(fā)性高血壓關(guān)系的研究鮮有報(bào)道。本研究通過(guò)新疆哈薩克族原發(fā)性高血壓患者及同族血壓正常人群之間CBS T833C基因多態(tài)性分布的比較，探討CBST833C基因多態(tài)性與新疆哈薩克族原發(fā)性高血壓間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1臨床資料 見(jiàn)表1。采用隨機(jī)整群抽樣的方法抽取定居在新疆塔城、伊犁、阿勒泰地區(qū)的哈薩克族人群，共納入對(duì)象245例，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化問(wèn)卷調(diào)查，體格檢查。各組受試者均無(wú)血緣關(guān)系，實(shí)驗(yàn)符合國(guó)務(wù)院頒布的《醫(yī)療機(jī)構(gòu)管理?xiàng)l例》第33條規(guī)定，所有研究對(duì)象均了解實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛢?nèi)容，簽署知情同意書(shū)。其中高血壓組共145例，男109例，女36例。納入標(biāo)準(zhǔn):高血壓符合2010年中國(guó)高血壓防治指南制訂的高血壓診斷標(biāo)準(zhǔn)〔3〕，收縮壓(SBP)≥140 mmHg和(或)舒張壓(DBP)≥90 mmHg。排除標(biāo)準(zhǔn):排除繼發(fā)性高血壓，嚴(yán)重心律失常、冠心病，合并肝、腎功能不全，心力衰竭，腦血管意外者，腫瘤，急、慢性傳染病，孕婦及哺乳期婦女的患者。對(duì)照組100例，男77例，女23例。納入標(biāo)準(zhǔn):同一地區(qū)的血壓正常者，SBP＜140 mmHg和(或)DBP＜90 mmHg。排除標(biāo)準(zhǔn):目前正在服降壓藥物且血壓正常者;合并心腦肝腎疾病及急慢性疾病等其他疾病患者。高血壓組與對(duì)照組受試者的性別與年齡匹配。高血壓組的吸煙比例、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、SBP、DBP、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、空腹血糖(FBG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)及Hcy水平均明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)。而飲酒比例、血尿酸(UA)及高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平兩組之間未見(jiàn)明顯差異(P＞0.05)。

表1 高血壓組與對(duì)照組一般臨床資料比較(s)

表1 高血壓組與對(duì)照組一般臨床資料比較(s)

項(xiàng)目 高血壓組(n=145)對(duì)照組(n=100)t/χ2 值 P值109/36 77/23 0.11 0.74年齡(歲)49.23±7.56 49.90±10.01 0.56 0.57吸煙〔n(%)〕 104(71.7)85(85)5.92 0.02飲酒〔n(%)〕 112(77.2)66(66)3.76 0.05 BMI(kg/m2)27.31±3.94 24.98±3.28 4.84 0.00 SBP(mmHg)161.18±23.62 120.92±11.85 15.72 0.00 DBP(mmHg)96.46±10.99 76.91±7.94 15.25 0.00 FPG(mmol/L)5.56±1.67 5.83±1.17 2.06 0.04 UA(mmol/L)294.69±59.20 282.27±34.87 1.88 0.06 TC(mmol/L)4.48±0.98 3.72±1.25 5.35 0.00 TG(mmol/L)3.38±1.54 2.69±1.53 3.50 0.01 HDL-C(mmol/L)1.21±0.33 1.19±0.24 0.04 0.97 LDL-C(mmol/L)2.73±0.65 2.10±0.58 7.85 0.00 Hcy(μmol/L)男/女(n)17.19±6.11 13.77±5.66 4.24 0.00

1.2方法

1.2.1血漿Hcy測(cè)定 清晨空腹采集外周靜脈血3 ml，置EDTA-Na抗凝管，60 min內(nèi)3 000 r/min離心10 min，分離血漿－80℃保存?zhèn)錅y(cè)。采用酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法(ELISA)檢測(cè)，檢測(cè)儀為伯樂(lè)酶標(biāo)儀550型。

1.2.2其他生化指標(biāo)測(cè)定 采用全自動(dòng)生化分析儀酶法測(cè)定血漿FPG、血清TC、TG、LDL-C、HDL-C及 UA水平。

1.2.3DNA提取及PCR擴(kuò)增 采空腹血6 ml，EDTA抗凝。常規(guī)方法抽提基因組DNA，測(cè)定DNA含量和純度。CBS T833C基因引物由上海生物工程公司合成，引物序列參考相關(guān)文獻(xiàn)〔4〕。上游純合型(P1):5'GGAGAAGTGTCCTGGATGCA3'，下游野生型(P2):5'CCCTTCGGGATCCACCCCAA3'，突變型(P3):5'CCCTTCGGGATCCACCCCAG3'。

PCR反應(yīng)分兩管進(jìn)行，首先于第一管中加入P1和P2各0.5 μl;于第2管中加入P1和P3各0.5 μl，然后分別在2管中依次加入 2 × PCR Master 10 μl，DNA 模板 1 μl，ddH2O 8 μl，PCR反應(yīng)總體系為20 μl。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min，94℃變性60 s，60℃復(fù)性45 s，72℃延伸60 s，35 個(gè)循環(huán)后72℃延伸7 min，4℃終止反應(yīng)。特異性 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為867 bp，20 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢查酶切結(jié)果。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用 SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件行t檢驗(yàn)及χ2檢驗(yàn)，計(jì)算各組等位基因頻率，并按Hardy-Weinberg平衡法檢驗(yàn)樣本的群體代表性。Logistic多元回歸法分析基因多態(tài)性及其危險(xiǎn)因素對(duì)疾病表型的作用。

2結(jié)果

2.1新疆哈薩克族CBS T833C基因型鑒定 酶切后存在3種基因型，純合子TT顯示867 bp 1號(hào)一條帶而1'號(hào)沒(méi)有條帶，變異純合子CC基因型顯示867bp 2'號(hào)一條帶而2號(hào)沒(méi)有條帶，雜合子TC基因型顯示867 bp 3號(hào)及3'號(hào)兩條帶。見(jiàn)圖1。

圖1 CBS T833C基因多態(tài)性瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2新疆哈薩克族CBS T833C基因型及等位基因頻率進(jìn)行定律檢驗(yàn) CBS T833C基因型TT、TC、CC分布頻率觀察值分別為49.80%(122例)、38.37%(94例)、11.83%(29例)，T等位基因頻率為68.98%，C等位基因頻率為31.02%。經(jīng)Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)(χ2=2.62，P=0.11)，達(dá)到遺傳平衡，在遺傳學(xué)上具有群體代表性，可代表新疆哈薩克族人群。

2.3兩組CBS T833C基因型與等位基因頻率比較 兩組研究對(duì)象在三種基因型分布及等位基因頻率之間相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)表2。

表2 高血壓組與對(duì)照組CBS T833C多態(tài)性基因型及等位基因分布情況(n)

2.4哈薩克族CBS T833C不同基因型之間各臨床指標(biāo)比較CBS T833C各基因型之間在BMI及TG有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。其中CBS 833CC型在BMI指標(biāo)中高于其他兩型(P＜0.05)，CBS 833TC型在 TG指標(biāo)中低于他兩型(P＜0.05)。Hcy在CBS T833C不同基因型水平，經(jīng)方差分析后差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)表3。

表3 哈薩克族CBS T833C不同基因型各指標(biāo)的比較(s)

表3 哈薩克族CBS T833C不同基因型各指標(biāo)的比較(s)

25.58±3.39 26.73±4.12 28.19±4.07 6.85 0.00 SBP(mmHg)145.57±27.78144.62±28.60142.06±27.25 0.21 0.82 DBP(mmHg)88.43±13.35 89.14±14.40 86.88±13.83 0.33 0.72 FPG(mmol/L)5.65±0.88 5.80±1.21 5.79±0.76 0.66 0.51 UA(mmol/L)288.87±39.05295.29±67.09276.97±35.65 1.59 0.21 TC(mmol/L)4.02±1.20 4.32±1.16 4.29±0.95 1.97 0.14 TG(mmol/L)3.08±1.28 2.43±1.43 b 3.34±1.28 9.19 0.00 HDL-C(mmol/L)1.18±0.31 1.19±0.32 1.04±0.27 1.69 0.19 LDL-C(mmol/L)2.43±0.65 2.56±0.73 2.44±0.75 0.93 0.39 Hcy(μmol/L)BMI(kg/m2)16.31±6.70 15.36±5.73 15.82±6.32 0.32 0.72

2.5多元Logistic回歸分析 以高血壓分類為因變量，選擇年齡、性別、高血壓家族史、吸煙史、飲酒史、BMI、FPG、TG、TC、LDL-C、Hcy、T833C多態(tài)位點(diǎn)的基因型為自變量進(jìn)行高血壓危險(xiǎn)因素回歸分析，BMI(OR=1.21，95%CI 1.11～1.33，P=0.00)，Hcy(OR=1.08，95%CI1.03～1.14，P=0.00)及高血壓家族史(OR=6.22，95%CI 3.31～11.68，P=0.00)是高血壓的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，CBS T833C多態(tài)位點(diǎn)基因型、年齡、吸煙史、飲酒史、FPG、TG、TC、LDL-C不是高血壓的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

3討論

全國(guó)高血壓抽樣調(diào)查顯示新疆哈薩克族人群中高血壓的患病率居全國(guó)前列〔5〕。近年來(lái)關(guān)于哈薩克族高血壓的流行病學(xué)及遺傳學(xué)研究日益增多。Hcy是心腦血管疾病發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素〔6〕，它可以造成血管內(nèi)皮損傷，血管平滑肌增生〔7，8〕。以往流行病學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)我國(guó)人群Hcy水平偏高，高血壓患者則進(jìn)一步升高〔9〕。本研究結(jié)果顯示新疆哈薩克族高血壓組患者的吸煙比例、BMI、SBP、DBP、TG、TC、FBG、LDL-C 及Hcy水平水平均明顯高于同族血壓正常對(duì)照組，說(shuō)明對(duì)于該族高血壓人群也應(yīng)重視心血管危險(xiǎn)因素的控制。

Hcy是甲硫氨酸代謝過(guò)程中的中間產(chǎn)物。在人體內(nèi)Hcy的轉(zhuǎn)歸其中一條途徑就是在CBS的催化下，Hcy轉(zhuǎn)化成胱硫醚，是Hcy代謝途徑的主要限速酶之一。CBS基因定位于21q22.3，目前發(fā)現(xiàn)CBS的突變位點(diǎn)多達(dá)132個(gè)，最常見(jiàn)位點(diǎn)為T833C。Kozich等〔10〕發(fā)現(xiàn)CBS基因外顯子8中存在T833C突變，使得編碼的蘇氨酸被異亮氨酸替代，致CBS活性降低，從而造成Hcy在血中蓄積。本研究檢測(cè)到新疆哈薩克族人群CBS T833C的三個(gè)基因型，但其等位基因的頻率低于我國(guó)其他少數(shù)民族〔11〕。同時(shí)本研究對(duì)新疆哈薩克族高血壓組及正常對(duì)照的CBS T833C基因型與等位基因頻率進(jìn)行比較，未發(fā)現(xiàn)兩組研究對(duì)象在三種基因型的分布頻率及等位基因頻率之間的差異。

目前CBS T833C位點(diǎn)突變主要集中于腦血管領(lǐng)域〔12，13〕。Ding等〔14〕一項(xiàng)關(guān)于CBS基因多態(tài)性與中國(guó)人缺血性腦卒中關(guān)系的Meta分析指出CBS T833C基因多態(tài)性與缺血性腦卒中發(fā)病相關(guān)，同時(shí)攜帶C基因型是缺血性腦卒中的重要危險(xiǎn)因素。而與高血壓關(guān)系的研究國(guó)內(nèi)尚無(wú)明確定論。呼日勒等〔15〕研究發(fā)現(xiàn)CBS基因T833C位點(diǎn)與蒙古族高血壓病和高血壓合并腦梗死無(wú)關(guān)。本研究結(jié)果提示Hcy的代謝除與CBS的代謝途徑有關(guān)外，可能與年齡、TG、LDL基線水平及吸煙的差別有關(guān)。另外國(guó)內(nèi)關(guān)于原發(fā)性高血壓及同型半胱氨酸代謝基因多態(tài)性研究多集中在MTHFR C677T基因多態(tài)性，并且宗永華等〔16〕研究發(fā)現(xiàn)高血壓人群中MTHFR基因 C677T純合突變可能是Hcy升高和H型高血壓的重要遺傳因素，而且存在性別差異。但既往有關(guān)新疆哈薩克族原發(fā)性高血壓與Hcy代謝基因多態(tài)性的研究中均未發(fā)現(xiàn)相關(guān)性〔17～19〕。本次研究也未發(fā)現(xiàn)CBS T833C位點(diǎn)突變與新疆哈薩克族原發(fā)性高血壓有關(guān)，進(jìn)一步說(shuō)明Hcy代謝途徑較為復(fù)雜，參與的主要代謝酶之間也可能存在某種聯(lián)系。因此有關(guān)CBS基因變異與高血壓的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

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