龔理 汪毅 童斯浩 劉柳 牛伶 袁媛 鮑揚(yáng)漪

肺癌已成為我國(guó)發(fā)病率最高的惡性腫瘤，其中非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）約占80%-85%[1]，嚴(yán)重威脅著人們的生命健康。近年來(lái)針對(duì)NSCLC的治療，主要包括化療和靶向治療，雖明顯改善了進(jìn)展期患者的生存，使其中位無(wú)進(jìn)展生存期達(dá)8個(gè)月-12個(gè)月，但仍不能治愈疾病[2]。因此尋找新的藥物和治療手段非常必要。

硫利達(dá)嗪作為一種多巴胺受體阻斷劑，可靶向作用于大腦中的多巴胺受體，緩解精神障礙所致的緊張與焦慮，曾被廣泛應(yīng)用于精神分裂癥等精神疾病的治療。近期研究卻顯示硫利達(dá)嗪在體外可抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖，如宮頸癌、乳腺癌、胃癌及肝癌等[3-6]，提示其潛在的抗腫瘤作用，但對(duì)NSCLC的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。由于我國(guó)晚期肺腺癌患者中，表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）突變陽(yáng)性率高達(dá)50%左右[7]，臨床上針對(duì)這部分EGFR突變患者的靶向藥物治療如吉非替尼等也存在繼發(fā)耐藥的問(wèn)題[8]，因此本課題以EGFR突變型NSCLC PC9細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察硫利達(dá)嗪對(duì)其增殖、凋亡以及細(xì)胞周期分布的影響，在此基礎(chǔ)上研究其可能的作用機(jī)制，為治療EGFR突變型NSCLC的新藥研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株與實(shí)驗(yàn)藥物 PC9細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，硫利達(dá)嗪購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.1.2 主要試劑與儀器 高糖（4,500 mg/L葡萄糖）DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；胎牛血清、二甲基亞砜（DMSO）、EDTA-胰酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；MTT粉購(gòu)自Sigma公司；Annexin V-FICT/PI雙染凋亡檢測(cè)試劑盒以及細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒購(gòu)于貝博公司；小鼠抗人CyclinD1、Bcl-2、Bcl-xl、Bax單克隆抗體購(gòu)于Abcam公司；兔抗人Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9單克隆抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology公司；二抗購(gòu)于北京中杉金橋生物公司；8000DH型二氧化碳培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；680全自動(dòng)酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司；FACS Calibur流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與藥物配制 PC9細(xì)胞用含10%胎牛血清、1%雙抗（100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素）的高糖DMEM培養(yǎng)基置于37oC、5%CO2的飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。1 d-2 d換液，用0.25%的胰酶消化傳代，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。硫利達(dá)嗪原藥用生理鹽水、DMSO輔溶，配制成0.1 mol/L的儲(chǔ)存液于-80oC冰箱分裝保存。實(shí)驗(yàn)時(shí)稀釋成工作液，DMSO終濃度小于0.1%。

1.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制效應(yīng) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PC9細(xì)胞，通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞數(shù)為5×104個(gè)/mL，100 μL每孔接種于96孔板中，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均設(shè)5個(gè)復(fù)孔，邊緣孔以無(wú)菌PBS填充。37oC孵育24 h至細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)組加入10 μmol/L、20 μmol/L、30 μmol/L、40 μmol/L、50 μmol/L的硫利達(dá)嗪，對(duì)照組加入培養(yǎng)基，分別于培養(yǎng)12 h、24 h、48 h后，每孔加入10 μL MTT（5 g/L），繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去上清，每孔加入100 μL DMSO，室溫振蕩10 min，酶標(biāo)儀上檢測(cè)各孔在490 nm處吸光度值（optical density, OD值）。按公式計(jì)算細(xì)胞存活率=（實(shí)驗(yàn)組OD均值/對(duì)照組OD均值）×100%，并用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算硫利達(dá)嗪的半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentration, IC50）。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期變化 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PC9細(xì)胞以1×105個(gè)/孔接種于6孔板中，每孔2 mL體系，待細(xì)胞貼壁后換液。實(shí)驗(yàn)組分別加入濃度為15 μmol/L、20 μmol/L、25 μmol/L的硫利達(dá)嗪，對(duì)照組加培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)與對(duì)照組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，胰酶消化細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌兩遍，棄去上清，以預(yù)冷的70%乙醇4oC固定12 h。1,600 r/min離心5 min，棄去固定液乙醇，PBS洗滌2遍，300 μLPBS重懸細(xì)胞后加入RNA酶20 μL于37oC水浴30 min，離心棄上清，加入400 μL碘化丙啶（propidium iodide, PI）染液，4oC避光孵育40 min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PC9細(xì)胞以1×105個(gè)/孔接種于6孔板中，每孔2 mL體系，待細(xì)胞貼壁后換液。實(shí)驗(yàn)組分別加入濃度為20 μmol/L、30 μmol/L、40 μmol/L的硫利達(dá)嗪，對(duì)照組加培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)與對(duì)照組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，消化收集細(xì)胞（包括上清中的細(xì)胞），PBS洗滌2遍，棄去上清，加入10 μL Annexin V和5 μL PI做標(biāo)記，震蕩混勻后室溫避光孵育15 min，PBS洗2遍后加400 μL鞘液重懸，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.6 Western blot檢測(cè)周期及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以對(duì)照組、硫利達(dá)嗪20 μmol/L、25 μmol/L、30 μmol/L處理組分別收集細(xì)胞。以蛋白裂解液提取總蛋白，BCA法蛋白定量后，灌膠，蛋白樣品處理后上樣，經(jīng)12%SDS-PAGE凝膠電泳，電轉(zhuǎn)印至PVDF膜上（220 mA、120 min），于5%脫脂奶粉中室溫封閉1 h。加入一抗（1:1,000稀釋）孵育，4oC過(guò)夜，TBST沖洗3次，每次10 min，二抗（1:5,000稀釋）室溫孵育1 h，TBST室溫洗3次，每次10 min，ECL法發(fā)光、顯影、定影。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Mean±SD表示，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，兩組之間比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)，采用Probit分析計(jì)算藥物的IC50值。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 硫利達(dá)嗪對(duì)NSCLC PC9細(xì)胞增殖的影響 MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，硫利達(dá)嗪作用12 h、24 h、48 h后對(duì)PC9細(xì)胞的增殖均有抑制作用，其IC50分別為（45.851±2.59）μmol/L、（37.726±1.96）μmol/L和（32.594±1.73）μmol/L。各時(shí)間段內(nèi)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=362.7、439.6、911.1,P＜0.05）（圖1）。倒置光學(xué)顯微鏡（×200倍）下觀察細(xì)胞形態(tài)，可見(jiàn)隨著藥物濃度的增加，正常貼壁細(xì)胞逐漸減少、細(xì)胞輪廓不清、體積縮小、間隙增加，細(xì)胞變圓變亮，漂浮狀細(xì)胞增多（圖2）。

圖1 MTT法檢測(cè)硫利達(dá)嗪對(duì)PC9細(xì)胞的增殖抑制效應(yīng)。不同濃度硫利達(dá)嗪作用PC9細(xì)胞12 h、24 h、48 h后，分別用MTT法檢測(cè)其細(xì)胞存活率。單因素方差分析，不同濃度硫利達(dá)嗪作用12 h后與對(duì)照組比較，ΔΔP＜0.01；作用24 h后與對(duì)照組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；作用48 h后與對(duì)照組比較，**P＜0.01。Fig 1 Proliferation inhibitory effect of thioridazine on PC9 cells detected by MTT. The viability of PC9 cells treated with different concentrations of thioridazine for 12 h, 24 h and 48 h was detected by MTT assay. The statistical analysis was performed with one-way analysis of variance. ΔΔP＜0.01 compared with the control group after being treated with thioridazine for 12 h, ＃P＜0.05,＃＃P＜0.01 compared with the control group after being treated with thioridazine for 24 h, **P＜0.01 compared with the control group after being treated with thioridazine for 48 h.

圖2 硫利達(dá)嗪作用后對(duì)PC9細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響（SP, ×200）。濃度為20 μmol/L、30 μmol/L、40 μmol/L的硫利達(dá)嗪作用于PC9細(xì)胞24 h后，觀察其細(xì)胞形態(tài)。Fig 2 Effect of cell morphology on PC9 cells by thioridazine (SP, ×200). The cell morphology was observed after being treated with different concentrations of thioridazine (20 μmol/L, 30 μmol/L, 40 μmol/L) for 24 h. T: Thioridazine/μM.

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)硫利達(dá)嗪對(duì)PC9細(xì)胞周期的影響 15 μmol/L、20 μmol/L、25 μmol/L的硫利達(dá)嗪作用于PC9細(xì)胞24 h后，G0/G1期細(xì)胞比例分別為（48.9±3.1）%、（59.7±2.8）%、（74.2±3.2）%，處于G0/G1期的細(xì)胞比例升高明顯，即硫利達(dá)嗪可誘導(dǎo)PC9細(xì)胞發(fā)生G0/G1期阻滯，與對(duì)照組（40.0±2.5）%相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=76.51,P＜0.05）（圖3）。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)硫利達(dá)嗪對(duì)PC9細(xì)胞凋亡的影響 20 μmol/L、30 μmol/L、40 μmol/L的硫利達(dá)嗪作用于PC9細(xì)胞24 h后，促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡，其凋亡率分別為（9.3±2.1）%，（28.7±4.7）%，（50.0±5.4）%，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=104.7,P＜0.05）（圖4）。

2.4 Western blot檢測(cè)周期及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá) Western blot結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，隨著硫利達(dá)嗪藥物濃度的增加，周期蛋白CyclinD1表達(dá)下調(diào)（F=23.58,P＜0.01)，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)下調(diào)（F=16.87,P＜0.01)，Bcl-xl表達(dá)下調(diào)（F=51.47,P＜0.01)，促凋亡蛋白Bax表達(dá)上調(diào)（F=26.44,P＜0.01)。實(shí)驗(yàn)組Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9活性較對(duì)照組增加（圖5）。

3 討論

EGFR突變是NSCLC中常見(jiàn)的基因突變類型，多項(xiàng)研究證實(shí)，EGFR基因突變與小分子酪氨酸激酶抑制劑（如吉非替尼、厄洛替尼等）的療效關(guān)系密切。Tokumo等[9]對(duì)21例NSCLC患者的研究顯示，發(fā)生EGFR突變的NSCLC患者對(duì)吉非替尼的治療應(yīng)答率顯著高于EGFR未突變組。但酪氨酸激酶抑制劑在治療過(guò)程中常易發(fā)生獲得性耐藥，發(fā)生耐藥的患者后續(xù)治療結(jié)果較差——故尋找新的藥物來(lái)治療EGFR突變型NSCLC十分必要。所以本實(shí)驗(yàn)選取EGFR突變型NSCLC細(xì)胞株P(guān)C9作為研究對(duì)象。

硫利達(dá)嗪作為一種吩噻嗪類抗精神疾病藥物，主要用于精神分裂癥、躁狂癥等精神類疾病的治療。隨著研究的深入，多項(xiàng)研究表明硫利達(dá)嗪在體外有著顯著的抗腫瘤作用。Mao等[3]發(fā)現(xiàn)硫利達(dá)嗪可通過(guò)阻斷多巴胺受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而顯著誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞SiHa發(fā)生凋亡，提示硫利達(dá)嗪可能作為一種新的抗腫瘤藥物。Lu等[6]以肝癌細(xì)胞SNU449、LM3和Huh7為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)硫利達(dá)嗪對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的抑制作用呈劑量依賴性，可能與硫利達(dá)嗪誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生G0/G1期阻滯以及抑制其干性基因CD133、OCT4和EpCam的表達(dá)有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，硫利達(dá)嗪可顯著抑制PC9細(xì)胞增殖，其抑制作用呈時(shí)間和濃度依賴性——隨著藥物的干預(yù)，PC9細(xì)胞皺縮變圓，活細(xì)胞數(shù)量顯著降低。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，25 μmol/L的硫利達(dá)嗪作用PC9細(xì)胞后，處于G0/G1期細(xì)胞比例最高，可達(dá)74.2%，較對(duì)照組40.0%明顯增高，顯示硫利達(dá)嗪可誘導(dǎo)PC9細(xì)胞發(fā)生G0/G1期阻滯。研究顯示CyclinD1是調(diào)控細(xì)胞G1期的關(guān)鍵蛋白，它可以促進(jìn)細(xì)胞周期由G1期進(jìn)入S期，對(duì)細(xì)胞周期調(diào)控至關(guān)重要[10]。本實(shí)驗(yàn)Western blot顯示硫利達(dá)嗪可使CyclinD1表達(dá)下調(diào)，從而抑制細(xì)胞進(jìn)入S期的進(jìn)程，導(dǎo)致大量細(xì)胞阻滯在G0/G1期。同時(shí)流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，20 μmol/L的硫利達(dá)嗪可誘導(dǎo)PC9細(xì)胞發(fā)生凋亡，凋亡率為9.33%，且隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞凋亡率也明顯上升，證實(shí)了硫利達(dá)嗪體外具有抗腫瘤作用。

凋亡是細(xì)胞內(nèi)的程序性死亡，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，Bcl-2家族蛋白與Caspase家族蛋白在細(xì)胞凋亡發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[11,12]。Bcl-2家族蛋白主要作用于細(xì)胞線粒體膜上，通過(guò)抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白發(fā)揮著凋亡調(diào)控作用[13]。Bcl-2和Bcl-xl作為重要的抗凋亡因子，可通過(guò)BH3結(jié)構(gòu)域與促凋亡蛋白形成異源二聚體，從而使其失活，保護(hù)細(xì)胞不進(jìn)入凋亡程序；同時(shí)Bcl-2和Bcl-xl也能通過(guò)抑制細(xì)胞色素C（Cytochrome C, Cyt C）的釋放發(fā)揮抗凋亡作用[14]。促凋亡蛋白Bax則通過(guò)破壞線粒體膜的穩(wěn)定性，促進(jìn)線粒體釋放Cyt C，從而誘發(fā)細(xì)胞凋亡[15]。Caspase家族在介導(dǎo)線粒體凋亡過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，其中Caspase-8、Caspase-9是凋亡啟動(dòng)因子，Caspase-3是凋亡執(zhí)行因子。線粒體釋放到胞漿的Cyt C可通過(guò)與Apaf-1因子聚合從而激活Caspase-9內(nèi)源性凋亡途徑，繼而激活下游的Caspase-3，導(dǎo)致Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)誘發(fā)凋亡[16]。外源性凋亡途徑中Caspase-8活化后幾乎能激活所有級(jí)聯(lián)反應(yīng)下游的Caspase導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[17]。

Mu等[5]證實(shí)硫利達(dá)嗪可通過(guò)激活Caspase途徑誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡發(fā)生；雍敏等[18]研究發(fā)現(xiàn)硫利達(dá)嗪誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞SKOV3、A2780凋亡，可能與其上調(diào)P53、Bax、胞質(zhì)Cyt C、active Caspase-3表達(dá)，下調(diào)Bcl-2、線粒體Cyt C表達(dá)有關(guān)。這兩項(xiàng)研究表明硫利達(dá)嗪誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與Bcl-2家族蛋白、Caspase家族蛋白有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)Western blot結(jié)果提示，隨著藥物濃度的增加，PC9胞內(nèi)促凋亡蛋白Bax表達(dá)上調(diào)，同時(shí)抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl表達(dá)下調(diào)。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組胞內(nèi)Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9活性均明顯增加。以上結(jié)果與Mu、雍敏等研究結(jié)果相似，表明硫利達(dá)嗪誘導(dǎo)PC9細(xì)胞凋亡，可能是通過(guò)激活Caspase內(nèi)外源性凋亡途徑，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl，上調(diào)Bax來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

圖3 硫利達(dá)嗪作用24 h后對(duì)PC9細(xì)胞周期分布的影響。A：濃度為15 μmol/L、20 μmol/L、25 μmol/L的硫利達(dá)嗪作用于PC9細(xì)胞24 h后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其細(xì)胞周期分布情況；B：各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。*P＜0.05，**P＜0.01。Fig 3 Effect of thioridazine on the cell cycle distribution of PC9 cells for 24 h. A: Flow cytometry was used to measure the cell cycle distribution after treating with different concentrations of thioridazine for 24 h. B: The differences were statistically significant by compared with the control group.*P＜0.05,**P＜0.01. T: Thioridazine/μM.

圖4 硫利達(dá)嗪作用24 h后對(duì)PC9細(xì)胞凋亡的影響。A：濃度為 20 μmol/L、30 μmol/L、40 μmol/L的硫利達(dá)嗪作用24 h后，流式細(xì)胞術(shù)用Annexin V-FITC和PI雙標(biāo)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；B：與對(duì)照組相比，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率明顯上升。*P＜0.05，**P＜0.01。Fig 4 Effect of thioridazine on the induction of apoptosis in PC9 cells for 24 h. A: After being incubated with different concentrations of thioridazine for 24 h, the apoptosis rate was analyzed using Annexin V-FITC and PI. B: Compared with the control group, each experiment group induced an increase in cell apoptosis rate. *P＜0.05, **P＜0.01. T: Thioridazine/μM.

圖5 Western blot檢測(cè)周期及凋亡相關(guān)蛋白水平的改變。A：20 μmol/L、25 μmol/L、30 μmol/L的硫利達(dá)嗪作用24 h后，Western blot檢測(cè)周期相關(guān)蛋白CyclinD1的表達(dá)水平；B：與對(duì)照組相比，CyclinD1表達(dá)下調(diào)。**P＜0.01；C：20 μmol/L、25 μmol/L、30 μmol/L的硫利達(dá)嗪作用24 h后，Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Bcl-xl、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的表達(dá)水平；D：與對(duì)照組相比，抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl表達(dá)下調(diào)，促凋亡蛋白Bax表達(dá)上調(diào)。**P＜0.01。 Fig 5 Expressions of cycle- and apoptosis-related proteins detected by Western blot. A: The expression of cell cycle-related protein CyclinD1 was detected by western blot after incubation with different concentrations of thioridazine for 24 h； B: Compared with the control group, thioridazine down-regulated the expression of CyclinD1. **P＜0.01； C: The expressions of apoptosis-related proteins Bcl-2, Bax, Bcl-xl, Caspase-3, Caspase-8 and Caspase-9 were detected by western blot after incubation with different concentrations of thioridazine for 24 h； D: Compared with the control group, thioridazine down-regulated the expressions of Bcl-2 , Bcl-xl and up-regulated the expression of Bax . **P＜0.01. T: Thioridazine/μM.

綜上所述，硫利達(dá)嗪可顯著誘導(dǎo)EGFR突變型NSCLC細(xì)胞株P(guān)C9發(fā)生細(xì)胞周期阻滯和凋亡，其抗腫瘤生物學(xué)活性提示其潛在的臨床價(jià)值和應(yīng)用前景。但目前硫利達(dá)嗪抗腫瘤細(xì)胞的機(jī)制仍未完全明確，其抑瘤效應(yīng)是否與多巴胺受體表達(dá)有關(guān)，以及其聯(lián)合放化療或靶向藥物治療是否具有協(xié)同作用仍需進(jìn)一步深入研究。