王明 孫震宇 黃禮年

肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，其死亡率位于惡性腫瘤的首位。目前約僅有30%的患者獲得早期診斷，并獲得手術治療，對于失去手術機會的晚期患者5年生存率小于15%[1]。肺癌包括分為兩種類型：非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）和小細胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC），兩者各占比例分別約為87%和13%。目前含鉑雙藥化療方案仍是晚期NSCLC推薦的一線方案，但隨著對NSCLC發(fā)生、發(fā)展分子機制的了解，目前已有一些靶向藥物[如表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors, EGFR-TKIs）]應用于臨床，并獲得不錯的臨床收益。

EGFR是由N-端胞外的配體結合區(qū)域、疏水的跨膜區(qū)域、細胞內(nèi)的催化區(qū)域（含酪氨酸激酶活性）組成[2]。EGF結合EGFR形成異二聚體，激活并磷酸化胞內(nèi)酪氨酸激酶，繼而激活一系列下游信號通路，如JAK-STAT、Ras-Raf-MAPK、PI3K-Akt-mTOR，參與細胞增殖、分化的調(diào)節(jié)。而EGFR信號通路的異常調(diào)節(jié)可引起腫瘤的發(fā)生、增殖、侵襲和轉移，目前靶向該通路的有單克隆抗體（cetuximab、panitumumab）和激酶抑制劑（gefitinib、erlotinib、afatinib），這些藥物毒副反應較輕，明顯改善了NSCLC患者的生存質量和生存期。但NSCLC患者中只有部分伴有EGFR突變陽性的患者受益，且這些藥物最終還可產(chǎn)生繼發(fā)性耐藥，出現(xiàn)病情進展。目前，EGFR突變作為評估TKIs藥物有效性的生物學標志，但實際臨床樣本EGFR突變檢測存在一定的技術難題，PCR技術的檢測假陽性率較高，而作為金標準的EGFR測序陽性率較低。

目前研究發(fā)現(xiàn)的EGFR-TKIs繼發(fā)性耐藥機制有：①細胞內(nèi)EGFR基因受體結合區(qū)突變（T790M）：增強了催化區(qū)域與ATP的結合能力，抑制了其與TKIs的結合；②Met基因擴增：通過激活不依賴 EGFR的ERBB3的磷酸化作用以及下游區(qū)的PI3K-Akt-mTOR通路；③胰島素樣生長因子1受體（insulin-like growth factor 1 receptor, IGF-1R）的激活：通過激活PI3K/AKT信號通路引起TKIs的耐藥；④EGFR擴增7號染色體的缺失；⑤第10號染色體磷酸酶和張力蛋白同源缺失基因（PTEN）基因突變；⑥表型轉化：NSCLC轉化為SCLC、上皮間質轉化（epithelial-to-mesenchymal transition, EMT）等。針對耐藥問題，microRNAs（miRNAs）與EGFR信號通路相關性的研究已成為熱點之一。MiRNAs是一類由內(nèi)源基因編碼的長度約22個核苷酸的非編碼小分子RNA，參與轉錄后水平基因的表達調(diào)控。MiRNAs幾乎參與了所有細胞生物學行為的調(diào)控，并在肺癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[3]，可起到致癌基因或抑癌基因的作用。MiRNAs有望成為改善EFGR-TKIs耐藥的新靶點，為治療NSCLC開拓新的方向。

1 MiRNAs與EGFR信號通路之間的調(diào)節(jié)關系

越來越多的試驗證實miRNAs與EGFR的表達、EGFR突變狀態(tài)及信號通路的激活息息相關。Dacic等[4]報道m(xù)iR-155只在EGFR/KRAS陰性的肺腺癌中高表達，miR-25只在EGFR陽性的腺癌中高表達，miR-495只在KRAS陽性的腺癌中高表達，而let-7g在以上三種類型腺癌中均呈低表達，特別是EGFR/KRAS陰性。

Liu等[5]研究發(fā)現(xiàn)miR-133b在NSCLC組織中低表達（P=0.002），miR-133b和EGFR mRNA的表達量呈負相關（r=-0.71,P＜0.001）；將miR-133b轉染入PC-9和A549細胞，發(fā)現(xiàn)miR-133b可抑制EGFR、AKT、ERK1/2的磷酸化，從而抑制EGFR信號通路，誘導細胞凋亡、抑制細胞侵襲，并增加對EGFR-TKIs的敏感性。Wang等[6]研究表明，miR133a在NSCLC組織及細胞中呈低表達，miR133a通過抑制胰島素樣生長因子受體（insulin-like growth factor receptor, IGF-R）、轉化生長因子β-R1（transforming growth factor-β receptor type-1, TGFβ-R1）和EGFR來調(diào)節(jié)AKT信號通路，最終抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲。MiR133a與總生存期有關，miR133a高表達是預后良好的指標。因此，miR133a不僅可作為判斷預后的指標，也是NSCLC未來潛在治療靶點。

Yoo等[7]研究多種肺癌細胞株（WI-38、A-13、A549、HCC-1588、NCI-H596）及15例肺癌組織，發(fā)現(xiàn)miR-9500呈低表達，miR-9500通過抑制AKT1（EGFR信號傳導過程中關鍵受體）來抑制腫瘤的增殖、侵襲和轉移。另外，同樣作用于AKT，起到抑癌作用的還有miR-153[8]，然而miR-200[9]起著致癌基因功能，AKT抑制劑可用于治療miR-200依賴性的肺癌患者。

以上試驗揭示了miRNAs對EGFR信號通路的調(diào)節(jié)作用，相反，EGFR異常表達或突變同樣可影響miRNAs的表達。MiRNAs和EGFR信號通路之間形成反饋調(diào)節(jié)，參與肺癌的發(fā)生、發(fā)展。Guo等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在EGFR突變型或野生型的肺癌細胞株（H1975、H1650、A549及H292）中miR-145表達下調(diào)，且miR-145和p-EGFR呈負相關關系（P＜0.05），EGFR信號通路的激活可引起miR-145的表達下調(diào)；應用EGFR抑制劑AG1478作用于H1975細胞（EGFR突變型）、A549細胞（EGFR野生型）、正常細胞株BEAS-2B，可逆轉EGFR信號通路對miR-145的負性調(diào)節(jié)。

2 MiRNAs與EGFR-TKIs繼發(fā)性耐藥的關系

對EGFR信號通路的深入研究促進了EGFR-TKIs的發(fā)展，目前應用于臨床的有gefitinib、erlotinib和afatinib。但因為繼發(fā)性耐藥，使EGFR-TKIs臨床受益受限，其中70%是由于EGFR基因二次突變（T790M、c-MET擴增）。

2.1 MiRNAs與EMT EMT發(fā)生過程中，上皮特異性標志物（E-鈣粘蛋白等）表達下調(diào)，間質特異性標志物（波形蛋白等）表達上升，使上皮細胞失去細胞極性及與基膜連接的功能，獲得細胞運動性、細胞遷移和侵襲等相關的間質功能，使上皮細胞來源的惡性腫瘤細胞獲得遷移和侵襲能力，甚至參與EGFR-TKIs耐藥等重要生物學過程。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs在EMT過程中充當關鍵調(diào)節(jié)者，且不同的miRNAs通過不同的靶點調(diào)控EMT的發(fā)生。Xia等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在NSCLC組織中，miR-638表達明顯下調(diào)，miR-638的表達下調(diào)可致E-鈣粘蛋白的減少，纖粘蛋白、波形蛋白和Snail的上升，而將攜帶有miR-638的質粒轉入NSCLC細胞系，發(fā)現(xiàn)E-鈣粘蛋白上升，纖粘蛋白、波形蛋白、Snail降低。因此，miR-638的表達下調(diào)可通過誘導EMT參與NSCLC的增殖和侵襲。Seol等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在NSCLC組織及細胞中，miR-373表達下調(diào)，將攜帶有pre-miR-373的質粒轉染入A549和Calu-6細胞，波形蛋白、N-鈣粘蛋白、纖粘蛋白表達下調(diào)，IRAK2和LAMP1表達下調(diào)；將靶向IRAK2和LAMP1的siRNAs轉染入上述兩種細胞，間質標志物同樣出現(xiàn)表達下調(diào)，兩種細胞的侵襲、轉移明顯受到抑制。因此，miR-373可通過靶向IRAK2和LAMP1抑制EMT，miR-373/IRAK2/LAMP1軸可成為NSCLC新的治療靶點。Suh等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在NSCLC中，miR-30c表達下調(diào)，波形蛋白、纖粘蛋白水平升高和E-鈣粘蛋白水平下調(diào)，miR-30c可以通過靶向波形蛋白、纖粘蛋白調(diào)控TGF-β誘導的EMT，此外，還可通過靶向MTDH和HMGA2抑制NSCLC的轉移。因此，miR-30c的表達水平可能作為NSCLC轉移的標志物，增加miR-30c的表達可能有助于延緩病情進展、抑制腫瘤轉移。miR-30c與EMT的發(fā)生關系同樣也得到其他學者的證實[14]。Li等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在NSCLC中mi-R-148a呈低表達，ROCK1呈高表達；將攜帶有miR-148a的質粒轉染入H1299細胞，發(fā)現(xiàn)ROCK1表達下調(diào)，E-鈣粘蛋白水平升高，波形蛋白水平下降，細胞的侵襲性減弱；而si-ROCK1的使用同樣會引起上述上皮、間質標志物的改變，即提示了miR-148a可通過調(diào)節(jié)ROCK1的表達抑制EMT的發(fā)生，抑制NSCLC的侵襲、轉移。同樣，在NSCLC中低表達，表現(xiàn)為抑癌基因功能，抑制腫瘤增殖、侵襲、轉移的還有miR-145、miR-135a、miR-132、miR-33a、miR-125b、miR-146a。miR-145通過靶向Oct4參與調(diào)節(jié)EMT的發(fā)生[16]；miR-135a通過靶向KLF8調(diào)節(jié)EMT[17]；miR-132通過靶向ZEB2抑制EMT的發(fā)生[18]；miR-33a通過靶向Twist1調(diào)節(jié)EMT的發(fā)生[19]；miR-125b在紫杉醇耐藥的NSCLC細胞株A549、H460中呈低表達，可通過靶向Sema4C調(diào)節(jié)EMT的發(fā)生[20]；miR-146a不僅可以通過靶向胰島素受體底物-2（insulin receptor substrate 2, IRS-2）抑制EMT的發(fā)生，還能使EGFR-TKIs耐藥的NSCLC患者恢復對gefitinib的敏感性[21]。

而某些miRNAs在NSCLC中表現(xiàn)為致癌基因，能誘導EMT的發(fā)生，促進腫瘤的轉移和侵襲，導致其對EGFR-TKIs的耐藥。Cao等[22]研究發(fā)現(xiàn)，在NSCLC細胞株（A549、LC-2/ad、ABC1、PC1、SQ5）中，miR-23a和Smad2/3表達上調(diào)。將TGF-β1刺激A549細胞，導致miR-23a表達明顯升高，E-鈣粘蛋白表達下調(diào)，N-鈣粘蛋白表達上調(diào)。將siRNAs干擾Smad2/3的表達，可引起miR-23a表達下調(diào)，TGF-β1/Smad信號通路可調(diào)節(jié)miR-23a的表達。將miR-23a抑制劑轉染入A549細胞中，隨后再用TGF-β1刺激該細胞，發(fā)現(xiàn)E-鈣粘蛋白仍可表達，而N-鈣粘蛋白表達微弱，miR-23a抑制劑可部分抑制TGF-β誘導的EMT。將Pre-miR-23a轉染入A549細胞中，引起E-鈣粘蛋白的下調(diào)、波形蛋白的上調(diào)。因此，miR-23a可通過靶向E-鈣黏蛋白（cadherin）基因（CDH1基因）調(diào)節(jié)TGF-β1誘導的EMT，導致對gefitinib的耐藥。Xu等[23]研究發(fā)現(xiàn)，在過表達 hsamiR-191的人氣道上皮細胞中，E-鈣粘蛋白表達下調(diào)，N-鈣粘蛋白、波形蛋白表達上調(diào)。將miR-191抑制劑轉染入人氣道上皮細胞中，發(fā)現(xiàn)N-鈣粘蛋白、波形蛋白的表達下調(diào)，E-鈣粘蛋白的表達上調(diào)，抑制EMT的發(fā)生。

增加抑癌基因型miRNAs和減少致癌基因型miRNAs的表達或許可成為NSCLC治療的新靶點，起到抑制腫瘤侵襲和轉移、增加對EGFR-TKIs敏感性的作用。

2.2 MiRNAs與PTEN基因缺失 研究發(fā)現(xiàn)，PTEN基因缺失可導致EGFR-TKIs繼發(fā)性耐藥的產(chǎn)生。Shen等[24]發(fā)現(xiàn)，NSCLC組織中miR-21呈高表達（78.7%, 37/47），PTEN蛋白呈低表達（72.3%, 34/47），miR-21的表達與PTEN呈負相關；46例NSCLC患者在用TKI（gefitinib或erlotinib）治療后，相對疾病穩(wěn)定（stable disease, SD）組和部分緩解（partial response, PR）組，疾病進展（progressive disease, PD）組miR-21升高，PTEN降低；相對PC9細胞（gefitinib敏感），PC9/GR細胞（gefitinib耐藥）的miR-21表達約為3.70倍，PTEN基因缺失，AKT和ERK均呈激活狀態(tài)；先將miR-21轉染入PC9細胞，發(fā)現(xiàn)其對gefitinib的敏感性降低，再將PTEN轉染入PC9細胞，發(fā)現(xiàn)PTEN可恢復細胞對gefitinib的敏感性；將miR-21抑制劑轉染入PC9/GR細胞，發(fā)現(xiàn)可恢復細胞對gefitinib的敏感性。因此，抑制miR-21的表達可能會逆轉EGFR-TKIs耐藥。關于miR-21與PTEN之間的調(diào)控關系分別在肺鱗癌、腺癌中也得到證實[25,26]。Wang等[27]研究發(fā)現(xiàn)，miR-29b在NSCLC組織中表達下調(diào)，將攜帶有miR-29b慢病毒轉染入A549細胞中，MMP2、PTEN mRNA表達下調(diào)，細胞的增殖、侵襲、轉移能力減弱。攜帶有miR-29b抑制劑的慢病毒轉染入H460細胞，MMP2、PTEN mRNA表達上調(diào)，細胞的增殖、侵襲、轉移能力增強。因此，miR-29b通過直接靶向MMP2和PTEN抑制NSCLC的侵襲和轉移，miR-29b可作為延緩NSCLC轉移、改善EGFR-TKIs耐藥的治療靶點。MiRNA-10a在NSCLC組織中明顯高表達，在高轉移及低轉移特性的NSCLC細胞（H1299、SPC-A-1sci、SPC-A-1、H358）中，miRNA-10a與PTEN的表達呈反比關系，miR-10a通過PTEN/AKT/ERK信號通路促進腫瘤的侵襲[28]。

2.3 MiRNAs與c-Met基因擴增 在NSCLC治療過程中，miRNAs可通過調(diào)節(jié)c-Met基因，參與EGFR-TKIs繼發(fā)性耐藥。Zhou等[29]研究發(fā)現(xiàn)，miR-34a可能通過調(diào)控Met基因，克服EGFR-TKIs耐藥。在HCC827、PC-9細胞（EGFR基因19號外顯子缺少）中miR-34a高表達，Met低表達；用HGF誘導產(chǎn)生gefitinib耐藥細胞株（HCC827/GR、PC-9/GR），發(fā)現(xiàn)其中miR-34a低表達，Met高表達；將miR-34a轉染入HCC827/GR、PC-9/GR細胞，發(fā)現(xiàn)Met mRNA和蛋白水平下調(diào)；miR-34a單一治療能減少Met的表達，但不能抑制EGFR的磷酸化及下游信號通路（PI3K/Akt信號通路）的激活，因而誘導HCC827/GR、PC-9/GR細胞凋亡的效果不佳；而miR-34a聯(lián)合gefitinib治療可抑制90%以上的Met磷酸化，導致下游的Akt和ERK1/2磷酸化受到影響，可誘導HCC827/GR細胞的大量凋亡。Zhou等[30]發(fā)現(xiàn)miR-130a在Pc9細胞（gefitinib敏感）中高表達，而Met低表達；將miR-130a轉染入Pc9 GR細胞（gefitinib耐藥），發(fā)現(xiàn)Met蛋白表達下調(diào)；miR-130a可通過靶向Met逆轉gefitinib耐藥，增強gefitinib誘導的腫瘤細胞凋亡。

靶向MET、起抑癌基因功能的還有miR-409-3p、miR-206、miR-200a。MiR-409-3p[31]在肺腺癌組織中低表達，可通過靶向Met抑制Akt信號通路，從而抑制腫瘤的增殖、侵襲。MiR-409-3p與pTNM分期、淋巴結轉移有關，是判斷預后的獨立的指標。在NSCLC組織中，MiR-206[32]低表達，MET的3?UTR的484-508、796-823以及BCL2的 3?UTR的24034-4057是miR-206的直接靶點，從而誘導腫瘤細胞的凋亡。MiR-200a[33]在NSCLC中低表達，可通過靶向EGFR和c-Met抑制腫瘤的侵襲和轉移，提高耐藥細胞株對gefitinib的敏感性。這意味著，miR-200a作為治療靶點，可適用于EGFR-TKIs耐藥的NSCLC患者。

3 MiRNAs評估EGFR-TKIs的有效性

越來越多的研究發(fā)現(xiàn)miRNAs可作為評估EGFR-TKIs有效性的標志物。Li等[34]研究發(fā)現(xiàn)在原發(fā)性TKIs耐藥的NSCLC細胞株（A549、H1299、H23、H460、H1975）中，miR-200c呈低表達，150例NSCLC患者（73例EGFR突變型、66例EGFR野生型、11例未知）接受gefitinib治療，客觀緩解率（objective response rate, ORR）為34.7%，疾病控制率（disease control rate, DCR）為64.7%；其中伴有miR-200c高表達的EGFR野生型患者的臨床受益明顯優(yōu)于低表達者，DCR（57.7%vs27.5%,P=0.014），無疾病進展生存期（progression-free survival, PFS）（5.0個月vs1.2 個月，P=0.001），總生存期（overall survival, OS）（9.6個月vs5.0個月，P=0.037），但在EGFR突變型患者miR-200c的表達對患者的PFS、OS、ORR無明顯影響。因此，miR-200c可能用于判斷EGFR野生型的NSCLC患者對EGFR-TKIs敏感性的指標。Shen等[35]研究了201例伴有EGFR突變型的NSCLC患者服用gefitinib的情況，發(fā)現(xiàn)其中miR-21低表達的患者OS明顯改善（28.3個月vs24.4個月，P=0.004,5），但miR-21高表達的患者表現(xiàn)出對gefitinib更好的反應率（73.7%vs30.7%,P＜0.001），miR-21可作為評估gefitinib敏感性的獨立標志物。EGFR負性調(diào)節(jié)因子Mig6是miR-200的靶點，體內(nèi)試驗證實該Mig6/miR200的比值與erlotinib敏感性成反比關系。因此，Mig6/miR200可作為評估EGFR-TKIs敏感性的可信賴指標[36]。

4 討論與展望

與傳統(tǒng)的化療相比，肺癌的靶向藥物治療具有方便、毒副作用輕的優(yōu)點，但后期會出現(xiàn)耐藥問題。MiRNAs是基因表達的調(diào)控者，通過精密、復雜的信號傳導網(wǎng)絡調(diào)控人類的生命活動。因此miRNAs異?？梢鹉[瘤耐藥相關通路中基因表達水平的改變，從而導致耐藥。目前針對miRNAs與EGFR信號通路之間調(diào)控關系的研究已取得部分成果，促進了miRNAs在肺癌的治療進展，如let-7和miR-34聯(lián)合治療可協(xié)同增加NSCLC對erlotinib的敏感性[37]。相信隨著miRNAs與肺癌耐藥機制研究的進一步加深，miRNAs必然能為肺癌的診斷及治療帶來更為光明的前景!