王曉明 盧秀波 呂金鋒

1)河南省焦作市焦作煤業(yè)(集團(tuán))有限責(zé)任公司中央醫(yī)院普外科 焦作 454000 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 鄭州 450052

Dong JT［1］于1995年首先報(bào)道了位于人染色體11P11.2位點(diǎn)的基因，認(rèn)為它對(duì)前列腺癌轉(zhuǎn)移的抑制具有特異性，而對(duì)腫瘤原發(fā)病灶的生長(zhǎng)沒(méi)有影響，并命名為KAI1。目前研究發(fā)現(xiàn)，KAI1 蛋白表達(dá)的下調(diào)或缺失與多種人體腫瘤的病程進(jìn)展密切相關(guān):腫瘤病程越晚，其表達(dá)就越低［2］。近年來(lái)，甲狀腺癌發(fā)病率有上升趨勢(shì)，其中甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid cancer，PTC)占絕大多數(shù)，而針對(duì)KAI1 在甲狀腺癌中的研究資料甚少。本研究通過(guò)檢測(cè)PTC、甲狀腺腺瘤和正常甲狀腺組織中KAI1 的表達(dá)，探討KAI1 與甲狀腺乳頭狀癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 收集2006 -01—2008 -12 間我院手術(shù)切除的PTC58例、甲狀腺腺瘤30例和瘤旁正常甲狀腺組20例作為實(shí)驗(yàn)標(biāo)本，并把PTC 分為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組22例和無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組36例。伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTC 病例中:男10例，女12例;年齡23～92 歲，平均48.1 歲。無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTC 病例中:男19例，女17例;年齡21～78 歲，平均46.9 歲。每例病例均經(jīng)病理復(fù)查證實(shí)，所有病例術(shù)前均未曾給予放療和(或)化療。

1.2 試劑 試驗(yàn)所用試劑均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，包括兔抗人KAI1 多克隆抗體、SABC 免疫組化試劑盒和DAB顯色試劑盒。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法及步驟 對(duì)所有實(shí)驗(yàn)石蠟包埋標(biāo)本均進(jìn)行連續(xù)4 μm厚切片，每例至少4 張。

1.3.1 對(duì)試驗(yàn)切片進(jìn)行常規(guī)HE 染色。

1.3.2 KAI1 免疫組化染色(SABC 法) 采用前列腺組織為陽(yáng)性對(duì)照，而以PBS 代替一抗作為陰性對(duì)照。試驗(yàn)切片經(jīng)常規(guī)脫蠟至水，并進(jìn)行微波抗原修復(fù)，具體操作步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，之后經(jīng)DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，脫水及透明，最后中性樹(shù)膠封片。

1.4 結(jié)果判斷 判定標(biāo)準(zhǔn):KAI1 蛋白陽(yáng)性染色呈棕褐色細(xì)小顆粒狀著色，定位于細(xì)胞胞漿和細(xì)胞膜。染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):無(wú)著色記為0 分，淡黃色記為1 分，棕黃色記為2 分，棕褐色記為3分。陽(yáng)性細(xì)胞比例評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):＜5%記為0 分，5%～25%記為1分，26%～50%記為2 分，51%～75%記為3 分，＞75%記為4分。根據(jù)染色強(qiáng)度評(píng)分與陽(yáng)性細(xì)胞比例評(píng)分之和所得分?jǐn)?shù)進(jìn)行染色陽(yáng)性分級(jí):≥3 分為陽(yáng)性，≤2 分為陰性。定量標(biāo)準(zhǔn)均以高倍鏡下針對(duì)每張切片隨即選取5個(gè)不同視野(×200)，同時(shí)應(yīng)用CCD 成像并結(jié)合圖像分析系統(tǒng)對(duì)kai1 蛋白的表達(dá)進(jìn)行平均灰度值測(cè)定，平均灰度值越小(說(shuō)明染色強(qiáng)度越強(qiáng)及透光度越弱)，蛋白表達(dá)量越高，反之則說(shuō)明其表達(dá)量越低。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均錄入SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件包，計(jì)量資料以±s 表示，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行方差分析和t 檢驗(yàn)，以P ＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

KAI1 蛋白陽(yáng)性表現(xiàn)為位于細(xì)胞漿和細(xì)胞膜的棕黃色顆粒。KAI1 在PTC 中的表達(dá)呈陽(yáng)性或強(qiáng)陽(yáng)性(如圖1)，在甲狀腺腺瘤中呈陽(yáng)性或弱陽(yáng)性，在正常甲狀腺組織中呈弱陽(yáng)性或陰性(如圖2)。KAI1 蛋白在PTC 中的表達(dá)顯著高于甲狀腺腺瘤和正常甲狀腺組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)。而KAI1 蛋白在甲狀腺腺瘤中的表達(dá)雖然高于正常甲狀腺組織，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)，見(jiàn)表1。另外，KAI1 蛋白的表達(dá)在伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTC 中顯著低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTC，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)，見(jiàn)表2。

表1 KAI1 在各組中的表達(dá)(±s)

表1 KAI1 在各組中的表達(dá)(±s)

注:* P ＜0.01 VS PTC 組，■P ＜0.01 VS PTC 組，▼P ＞0.05 VS 甲狀腺腺瘤組

分組例數(shù) KAI1 表達(dá)(灰度值)PTC 58 63.31 ±6.52甲狀腺腺瘤 30 117.53 ±7.67*正常甲狀腺 20 123.71 ±8.49■▼

表2 KAI1 在不同PTC 中的表達(dá)(±s)

表2 KAI1 在不同PTC 中的表達(dá)(±s)

注:▲P ＜0.01 VS 無(wú)轉(zhuǎn)移的PTC 組

分組例數(shù) KAI1 表達(dá)(灰度值)無(wú)轉(zhuǎn)移的PTC 22 47.68 ±7.49轉(zhuǎn)移的PTC 36 83.23 ±8.27▲

圖1 KAI1 在甲狀腺乳頭狀癌陽(yáng)性表達(dá)

圖2 KAI1 在正常甲狀腺組織陰性表達(dá)

3 討論

近年來(lái)，我國(guó)甲狀腺癌的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)，而其中80%為PTC［3］。作為最常見(jiàn)的內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤之一的PTC，不但起病隱匿，而且臨床表現(xiàn)及其生物學(xué)特征復(fù)雜多變，同時(shí)存在較高的隱性頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率［4］。目前有關(guān)其發(fā)病及轉(zhuǎn)移機(jī)制尚未清楚。隨著分子生物克隆技術(shù)的逐漸發(fā)展，腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因。它對(duì)腫瘤浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移起負(fù)向調(diào)控的作用越來(lái)越受到人們的重視。研究表明［5］，腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因在非轉(zhuǎn)移腫瘤組織中表達(dá)較高，而在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤組織中表達(dá)較低，由此，認(rèn)為它與抑制腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移密切關(guān)。

KAI1 是1995年首先由Dong 等［1］從人前列腺癌雜交細(xì)胞AT6.1 中所克隆出的轉(zhuǎn)移抑制基因，是穿膜四超家族(transmembrane 4 super-family，TM4SF)成員之一，其生物學(xué)結(jié)構(gòu)為細(xì)胞膜糖蛋白，主要影響細(xì)胞間及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間的信號(hào)傳導(dǎo)，同時(shí)參與細(xì)胞增生的調(diào)節(jié)。早期的研究認(rèn)為KAI1 基因只是前列腺癌的特異性的轉(zhuǎn)移抑制基因，在目前已知的與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因中，KAI1 基因是較為明確的抑癌基因。在人類(lèi)其他腫瘤中如肺癌［6］、乳腺癌［7］、胃癌［8］、肝癌［9］、胰腺癌［10］、卵巢癌［11］、子宮內(nèi)膜癌［12］等多種惡性腫瘤的體內(nèi)或體外實(shí)驗(yàn)大都表明，其表達(dá)缺失或下降與分化程度、臨床進(jìn)程以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。腫瘤分化程度越低，臨床進(jìn)程越晚，KAI1 蛋白的表達(dá)就越少。本研究顯示，KAI1 蛋白在PTC 中的表達(dá)，顯著高于甲狀腺腺瘤及正常甲狀腺組織(P 均＜0.01)，這也可能與甲狀腺乳頭狀癌具有惡性程度較低和預(yù)后較好的生物學(xué)行為有關(guān)。

PTC 中頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移較常見(jiàn)，本研究結(jié)果表明，KAI1 蛋白在無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTC 組織中陽(yáng)性或弱陽(yáng)性表達(dá)，而在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTC 組織中呈弱陽(yáng)性或陰性表達(dá)。KAI1 蛋白的表達(dá)在伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTC 中顯著低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTC(P ＜0.01)，這也更加明確了KAI1 是一個(gè)腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，它與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有一定關(guān)系。既往已有的證據(jù)也表明，KAI1 基因表達(dá)降低在腫瘤進(jìn)展轉(zhuǎn)移過(guò)程中起著重要作用，它可通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、增殖、分化和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等發(fā)揮作用，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力［13-16］。因此，KAI1 促進(jìn)PTC 轉(zhuǎn)移的機(jī)制可能是KAI1 的低表達(dá)使腫瘤組織細(xì)胞功能進(jìn)一步減弱或喪失，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞間黏附力減弱、而移動(dòng)性增強(qiáng)、同時(shí)細(xì)胞分化降低，進(jìn)而增強(qiáng)其侵襲性，最終發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。PTC 在頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過(guò)程中KAI1 低表達(dá)所起的作用及作用的大小，以及發(fā)生這種淋巴結(jié)規(guī)律性轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制目前仍不明確，需進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示KAI1 的表達(dá)異?？赡芘cPTC 的發(fā)生、發(fā)展以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，臨床上通過(guò)檢測(cè)PTC 中KAI1 的表達(dá)，對(duì)判斷腫瘤的惡性程度、轉(zhuǎn)移潛能以及預(yù)后均具有重要的指導(dǎo)意義。

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