彭冰，胡正國(guó)，宋才淵，王剛（.浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，浙江杭州30053；.浙江中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院浙江杭州30053）

小鼠骨質(zhì)疏松合并骨性關(guān)節(jié)炎模型的建立及評(píng)價(jià)

彭冰1，胡正國(guó)2，宋才淵1，王剛1
（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，浙江杭州310053；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院浙江杭州310053）

摘要：［目的］探討骨質(zhì)疏松合并骨性關(guān)節(jié)炎的小鼠動(dòng)物模型的制備方法。［方法］ICR雌性小鼠20只，隨機(jī)分成對(duì)照組和模型組各10只。模型組采取切除雙側(cè)卵巢4周后膝關(guān)節(jié)注射碘乙酸制備模型，對(duì)照組不作任何處理。碘乙酸注射8周后對(duì)小鼠進(jìn)行X-ray活體成像觀察，并測(cè)定骨密度；取膝關(guān)節(jié)及腰椎做病理切片行HE染色觀察。［結(jié)果］模型組小鼠骨密度明顯下降，關(guān)節(jié)間隙變窄，骨贅形成，HE染色見關(guān)節(jié)面不平整，出現(xiàn)凹陷及軟骨缺損，腰椎骨小梁變少變細(xì)，結(jié)構(gòu)不完整。［結(jié)論］切除雙側(cè)卵巢及膝關(guān)節(jié)注射碘乙酸的方法能為研究骨質(zhì)疏松合并骨性關(guān)節(jié)炎提供較為理想的動(dòng)物模型。

關(guān)鍵詞：骨質(zhì)疏松；骨性關(guān)節(jié)炎；動(dòng)物模型；實(shí)驗(yàn)研究

骨質(zhì)疏松（osteoporosis，OP）和骨性關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）都是發(fā)病率較高的臨床常見骨科疾病。兩者雖然存在各自的不同病理變化，但在骨密度、骨微結(jié)構(gòu)、細(xì)胞因子以及遺傳等諸多方面都存在著密切聯(lián)系，常常一起發(fā)?。?］。目前越來(lái)越多的觀點(diǎn)認(rèn)為OP是導(dǎo)致OA的病因之一，由于骨質(zhì)疏松的發(fā)生導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨力學(xué)失衡，關(guān)節(jié)磨損加重，進(jìn)而發(fā)生退變?cè)錾?］。然而，目前的實(shí)驗(yàn)研究中尚缺乏良好的骨質(zhì)疏松合并骨性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型［3］。為了更好地研究OP與OA之間的關(guān)系，為臨床治療這兩種疾病提供更有力的依據(jù)，本實(shí)驗(yàn)初步探討通過(guò)摘除雙側(cè)卵巢、關(guān)節(jié)腔注射碘乙酸建立骨質(zhì)疏松合并骨性關(guān)節(jié)炎這一動(dòng)物模型的可行性，旨在為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究及臨床奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物與分組選取ICR健康雌性小鼠20只，平均體重為35 g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào): SCXK（滬）2008-0016。隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組2組，每組10只。每籠5只，飼養(yǎng)室室溫20℃、相對(duì)濕度30%～40%，予標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由飲食、飲水。

1.2主要藥品及儀器碘乙酸（sigma公司），10%水合氯醛（浙江省骨傷研究所配置），青霉素（華北制藥生產(chǎn)），微量注射器（江蘇凌基儀器公司），多光譜小動(dòng)物成像儀（美國(guó)Kodal公司）。

1.3模型制備［4-5］小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，無(wú)菌條件下，用10%水合氯醛溶液按0.3ml/100 g腹腔內(nèi)注射麻醉，將小鼠仰臥固定于手術(shù)板上，剃毛消毒，從腹部正中逐層切開皮膚肌肉，摘除雙側(cè)卵巢，生理鹽水沖洗后逐層縫合切口。保溫?zé)粝抡丈涮K醒。3 d內(nèi)每天每只按1萬(wàn)U/50 g臀肌注射青霉素預(yù)防感染。4周后無(wú)菌條件下，用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉（0.3 ml/100 g），右膝關(guān)節(jié)區(qū)剃毛、備皮、常規(guī)消毒。微曲膝關(guān)節(jié)，以微量注射器從髕骨內(nèi)側(cè)刺入關(guān)節(jié)腔，注射碘乙酸30 μl。注射后置于飼養(yǎng)籠中自由活動(dòng)，自由飲水飲食。對(duì)照組不做任何處理。

2　觀察項(xiàng)目及檢測(cè)方法

2.1小動(dòng)物成像及骨密度測(cè)定注射碘乙酸8周后，用10%水合氯醛溶液（0.3 ml/100 g）腹腔注射麻醉，待小鼠失去知覺(jué)后將其置于拍攝倉(cāng)內(nèi)，擺好體位，點(diǎn)擊拍攝按鈕，用多光譜小動(dòng)物成像儀攝取對(duì)照組和模型組的影像學(xué)資料（見圖1），曝光時(shí)間至少1 min。再用多光譜小動(dòng)物成像儀自帶的骨密度測(cè)定軟件劃定測(cè)區(qū)域、分別測(cè)定2組小鼠的股骨遠(yuǎn)端及腰椎的骨密度。

2.2組織病理學(xué)觀察注射碘乙酸8周后處死動(dòng)物，取腰椎及右側(cè)膝關(guān)節(jié)于中性甲醛中固定、經(jīng)脫鈣、脫水、透明等程序后，用石蠟包埋切片3 μm厚，HE染色觀察。

2.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)資料采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用±s表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3　結(jié)果

3.1兩組小動(dòng)物成像及骨密度測(cè)定結(jié)果影像學(xué)結(jié)果顯示模型組與對(duì)照組比較骨皮質(zhì)變薄，骨小梁變細(xì)減少。模型組右膝關(guān)節(jié)出現(xiàn)明顯骨贅、關(guān)節(jié)面不平整、關(guān)節(jié)間隙變窄等表現(xiàn)（見圖1-A）。對(duì)照組關(guān)節(jié)間隙正常，無(wú)明顯骨贅增生，無(wú)關(guān)節(jié)面缺損（見圖1-B）。骨密度測(cè)定結(jié)果，與對(duì)照組比較，模型組股骨遠(yuǎn)端以及腰椎的骨密度明顯下降，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果見表1。

表1　兩組小鼠股骨遠(yuǎn)端及腰椎骨密度測(cè)定值比較（g/cm2±s）

表1　兩組小鼠股骨遠(yuǎn)端及腰椎骨密度測(cè)定值比較（g/cm2±s）

組別　n股骨遠(yuǎn)端腰椎模型組　10　0.152±0.012　0.135±0.023對(duì)照組　10　0.343±0.034　0.337±0.015 t 16.76　23.2　7 P ＜0.05＜0.05

3.2組織病理觀察模型組膝關(guān)節(jié)HE染色光鏡下可見關(guān)節(jié)面凹凸不平，股骨遠(yuǎn)端及脛骨平臺(tái)有明顯的軟骨缺損，軟骨細(xì)胞排列混亂無(wú)序，并趨于肥大性末端分化（見圖2-A）；對(duì)照組膝關(guān)節(jié)HE染色可見關(guān)節(jié)面光滑完整，軟骨細(xì)胞排列有序，軟骨下骨及骨小梁無(wú)異常，骨髓腔內(nèi)骨髓細(xì)胞正常（見圖2-B）。模型組腰椎HE染色可見骨小梁明顯變細(xì)變薄，排列混亂不規(guī)則，數(shù)量明顯減少，孔隙變寬變大，部分地方出現(xiàn)斷裂，甚至消失，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)破壞缺損區(qū)域較大（見圖3-A）；對(duì)照組腰椎HE染色可見骨小梁結(jié)構(gòu)致密有規(guī)則，成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，無(wú)明顯缺損及破壞（見圖3-B）。

圖2　模型組與對(duì)照組右膝關(guān)節(jié)組織病理HE染色

圖3　模型組與對(duì)照組腰椎組織病理HE染色

4　討論

本研究是通過(guò)雙側(cè)卵巢摘除和碘乙酸注射來(lái)建立骨質(zhì)疏松合并骨性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型，并通過(guò)多光譜小動(dòng)物成像系統(tǒng)和病理組織觀察來(lái)評(píng)價(jià)確認(rèn)。小動(dòng)物成像系統(tǒng)具有影像學(xué)和骨密度測(cè)定的雙重功能，具有無(wú)創(chuàng)、分辨率高的特點(diǎn)，能為模型制備成敗的判定提供重要的證據(jù)［5-6］。動(dòng)物處死后組織病理學(xué)的觀察更是最有力的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。目前骨質(zhì)疏松和骨性關(guān)節(jié)炎的動(dòng)物模型造模方法有很多種，但在同一動(dòng)物身上制備兩種疾病模型卻不多見。卵巢摘除是制備骨質(zhì)疏松模型的經(jīng)典方法，而碘乙酸注射膝關(guān)節(jié)造模具有時(shí)間短、損傷小、效果明顯等優(yōu)點(diǎn)［7］。鑒于骨質(zhì)疏松與骨性關(guān)節(jié)炎的關(guān)聯(lián)性，將二者集中于一個(gè)模型上研究是十分必要的。

本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M小鼠切除雙側(cè)卵巢4周后予關(guān)節(jié)注射碘乙酸，8周后發(fā)現(xiàn)去卵巢小鼠股骨遠(yuǎn)端及腰椎的骨密度測(cè)量值顯著下降。腰椎光鏡下觀察見骨小梁稀疏變細(xì)。另外膝關(guān)節(jié)X線顯示出明顯的骨贅、關(guān)節(jié)面不平整、關(guān)節(jié)間隙變窄等表現(xiàn)，病理切片光鏡觀察見軟骨細(xì)胞排列混亂無(wú)序，并趨于肥大性末端分化，軟骨面出現(xiàn)缺損。由此證實(shí)了本實(shí)驗(yàn)骨質(zhì)疏松癥合并骨性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型的制備是成功的。小鼠摘除卵巢后雌激素分泌減少，造成骨代謝失衡［8］，從而導(dǎo)致骨量減少，軟骨膠原和蛋白多糖的過(guò)度分解、生長(zhǎng)因子合成降低［9］。碘乙酸注射后導(dǎo)致關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨基質(zhì)缺損，軟骨變薄、破壞糜爛等表現(xiàn)。而骨質(zhì)疏松的發(fā)生導(dǎo)致軟骨受力不均，進(jìn)一步的加重了關(guān)節(jié)磨損、軟骨破壞，使得膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎性更加嚴(yán)重［10］。同時(shí)，骨性關(guān)節(jié)炎的加重使得小鼠活動(dòng)減少，應(yīng)力刺激降低，又進(jìn)一步加重了骨質(zhì)疏松［11］。由此可以推測(cè)骨質(zhì)疏松合并骨性關(guān)節(jié)炎模型使得二者具有相互的疊加作用。

綜上所述，通過(guò)摘除小鼠雙側(cè)卵巢、關(guān)節(jié)注射碘乙酸制備骨質(zhì)疏松合并骨性關(guān)節(jié)炎的模型是可行的，通過(guò)小動(dòng)物成像系統(tǒng)及病理組織切片觀察進(jìn)行評(píng)價(jià)是可靠的。這一模型或許為人類研究骨質(zhì)疏松和骨性關(guān)節(jié)炎的病理聯(lián)系提供了新的選擇，同時(shí)也為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究提供一種思路。

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（編輯劉強(qiáng)）

中圖分類號(hào)：R681；R684.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：2095-4441（2015）02-0008-03

收稿日期:2015-01-19

作者簡(jiǎn)介:彭冰（1990-），男，湖南湘潭人，醫(yī)學(xué)碩士，主要從事骨性關(guān)節(jié)炎及代謝性骨骼疾病研究