覃裕旺，王慶高，朱智德，盧健棋，王振常，凌蕓（.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 500；.廣西中醫(yī)藥大學(xué)制藥廠，廣西 南寧 500；.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬護(hù)理學(xué)院，廣西 南寧 500）

化痰活血益心方對(duì)壓力負(fù)荷性心肌肥厚大鼠AngⅡ，Trx的影響

覃裕旺1，王慶高1，朱智德2，盧健棋1，王振常1，凌蕓3
（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)制藥廠，廣西 南寧 530023；3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬護(hù)理學(xué)院，廣西 南寧 530023）

摘要：［目的］研究血管緊張素Ⅱ（AngⅡ），硫氧還蛋白（Trx）在大鼠壓力負(fù)荷性心肌肥厚中的表達(dá)及化痰活血益心方的干預(yù)作用。［方法］采用部分縮窄腹主動(dòng)脈方法制作大鼠壓力負(fù)荷性心肌肥厚模型，模型對(duì)照組造模不給藥，中藥組（大、中及常規(guī)劑量組）造模2周后給予化痰活血益心方（10倍常規(guī)劑量、5倍常規(guī)劑量及常規(guī)劑量，常規(guī)劑量為0.12 g/kg），卡托普利組造模2周后給予卡托普利6.75 mg/kg，每日灌胃1次，共4周。觀察各組大鼠心肌AngⅡ，Trx的含量。［結(jié)果］與模型對(duì)照組比較，中藥大、中、常規(guī)劑量組及卡托普利組均能顯著降低壓力負(fù)荷性大鼠心肌AngⅡ含量（P＜0.01），中藥大劑量組、卡托普利組降低AngⅡ與中藥常規(guī)劑量、中劑量組比較，差異有顯著性意義（P＜0.01或P＜0.05）。各組心肌Trx蛋白表達(dá)比較，與模型對(duì)照組比較，中藥大、中、常規(guī)劑量組及卡托普利組Trx蛋白明顯增加（P＜0.01），中藥大劑量組Trx蛋白表達(dá)與中藥中、常規(guī)劑量組比較，差異有顯著性意義（P＜0.01）。［結(jié)論］化痰活血益心方能通過(guò)升高Trx及降低AngⅡ發(fā)揮抗氧化應(yīng)激損傷作用，且化痰活血益心方大劑量升高Trx及降低AngⅡ作用更顯著。

關(guān)鍵詞：化痰活血益心方；心肌肥厚；AngⅡ；Trx；實(shí)驗(yàn)研究

心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展過(guò)程與氧化應(yīng)激有著密切的聯(lián)系。血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）是調(diào)控心血管系統(tǒng)穩(wěn)定性的重要神經(jīng)體液因子，可作為一種內(nèi)在的氧化劑促使氧化應(yīng)激的發(fā)生，在高血壓、糖尿病等疾病的心臟損害中發(fā)揮重要作用［1］。硫氧還蛋白（Trx）是機(jī)體重要的小分子蛋白質(zhì)，與體內(nèi)細(xì)胞氧化還原反應(yīng)、核酸代謝、細(xì)胞生長(zhǎng)及腫瘤發(fā)生有關(guān)，在組織的抗氧化負(fù)荷反應(yīng)中起重要的作用［2］。筆者采用部分縮窄腹主動(dòng)脈方法制作大鼠心肌肥厚模型，觀察AngⅡ，Trx在大鼠心肌肥厚模型中的表達(dá)及化痰活血益心方的干預(yù)作用，以進(jìn)一步闡明氧化應(yīng)激在心肌肥厚中的作用機(jī)制及化痰活血益心方的作用機(jī)理。

1　實(shí)驗(yàn)材料

1.1動(dòng)物選用清潔級(jí)Wistar大鼠，雌雄各半，體重220～250g，由廣西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào): SCXK桂2003-0003。

1.2藥物化痰活血益心方（組方:陳皮15g，法半夏10g，茯苓15g，黨參30g，生姜6g，丹參10g，川芎10g，桂枝10g，砂仁6g，炙甘草10g等），由廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥房提供，經(jīng)干燥、稱重、浸泡、煎煮3次，濃縮留存。

1.3試劑AngⅡ測(cè)試盒購(gòu)自上海拜力生物科技有限公司；Trx一抗（CST）；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（武漢博士德生物技術(shù)有限公司）；RIPA裂解液（武漢博士德生物技術(shù)有限公司）。

2　方法

2.1大鼠心肌肥厚造模方法采用部分縮窄腹主動(dòng)脈方法造模［3］1698。以30 mg/kg的戊巴比妥鈉腹腔內(nèi)注射麻醉，將大鼠仰臥位固定于鼠板，剪去術(shù)野皮毛，皮膚消毒后行腹正中切口，切開(kāi)皮膚及肌層，暴露內(nèi)臟，將大鼠胃及其腸系膜等推向右側(cè)，暴露腎臟及脊柱前的腹主動(dòng)脈，在腎動(dòng)脈分支上方分離腹主動(dòng)脈約1 cm長(zhǎng)，用7號(hào)注射器針頭緊貼腹主動(dòng)脈，平行放置，并將兩者一起結(jié)扎，然后抽出注射器針頭，即可部分縮窄腹主動(dòng)脈。術(shù)后每天用青霉素（5萬(wàn)單位/只）腹腔注射，連續(xù)7天。3～4天大鼠心肌即開(kāi)始肥厚，2～3周達(dá)穩(wěn)定高峰。

2.2分組及給藥取Wistar大鼠50只進(jìn)行造模，另取10只大鼠為空白組。造模大鼠隨機(jī)分為模型對(duì)照組，中藥大、中、常規(guī)劑量組，卡托普利組，每組10只?？瞻捉M:正常飼養(yǎng)。模型對(duì)照組:造模2周后灌胃等量生理鹽水，每日灌胃1次，共4周。中藥常規(guī)劑量組:造模2周后給予化痰活血益心方，灌胃量按《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》［3］864進(jìn)行換算，每100 g大鼠每日給藥量為12 mg。每日灌胃1次，共4周。中藥中劑量組:造模2周后給予化痰活血益心方，給予5倍常規(guī)劑量。每日灌胃1次，共4周。中藥大劑量組:造模2周后給予化痰活血益心方，給予10倍常規(guī)劑量。每日灌胃1次，共4周?？ㄍ衅绽M:造模2周后給予卡托普利，每100 g大鼠每日給藥量為0.675 mg，每日灌胃1次，共4周。

2.3AngⅡ含量檢測(cè)（ELISA法）按照試劑盒內(nèi)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，迅速?gòu)拇笫笮呐K將左心室分離出，置于在-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩z測(cè)時(shí)將心肌組織勻漿，3000 g離心10 min，取上清液測(cè)定心肌組織AngⅡ的含量。

2.4Trx及內(nèi)參β-actin蛋白檢測(cè)（Western blot法）取大鼠左心室組織，置于預(yù)先加有蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液中，剪碎，勻漿，提取總蛋白，用BCA法測(cè)總蛋白濃度。每個(gè)標(biāo)本取含有30μg蛋白的樣本進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗過(guò)夜，洗膜，二抗孵育，然后對(duì)膜進(jìn)行化學(xué)發(fā)光，X光片顯影，采用Image J1.48v圖像分析軟件對(duì)X光片中的目的蛋白及β-actin的條帶進(jìn)行灰度分析，用目的蛋白和β-actin的灰度值的比值代表目的蛋白的相對(duì)表達(dá)含量。

3　結(jié)果

3.1各組心肌AngⅡ含量比較與模型對(duì)照組比較，中藥大、中、常規(guī)劑量組及卡托普利組均能顯著降低壓力負(fù)荷性大鼠心肌AngⅡ含量（P＜0.01），中藥大劑量組、卡托普利組降低AngⅡ與中藥常規(guī)劑量、中劑量組比較，差異有顯著性意義（P＜0.01或P＜0.05）。中藥大劑量組與卡托普利組在降低AngⅡ含量差異無(wú)顯著性意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1　各組心肌AngⅡ含量比較（ng/L±s）

表1　各組心肌AngⅡ含量比較（ng/L±s）

注:與模型對(duì)照組比較，①P＜0.01；與空白組比較，②P＜0.05，③P＜0.01；與卡托普利組比較，④P＜0.05，⑤P＞0.05；與中藥常規(guī)劑量組比較，⑥P＞0.05，⑦P＜0.01；與中藥中劑量組比較，⑧P＜0.01

組別　n　AngⅡ空白組　10　37.68±10.04①模型對(duì)照組　10　124.38±23.09卡托普利組　10　61.24±17.61①②中藥常規(guī)劑量組　10　84.55±20.32①③④中藥中劑量組　10　79.28±13.64①③④⑥中藥大劑量組　10　54.79±18.03①②⑤⑦⑧

3.2各組心肌Trx蛋白表達(dá)比較與模型對(duì)照組比較，中藥大、中、常規(guī)劑量組及卡托普利組Trx蛋白明顯增加（P＜0.01），中藥大劑量組Trx蛋白表達(dá)與中、常規(guī)劑量組比較，差異有顯著性意義（P＜0.01）。見(jiàn)圖1。

圖1　各組心肌Trx蛋白表達(dá)

4　討論

AngⅡ一方面能通過(guò)氧化應(yīng)激途徑引起心肌肥大，另一方面AngⅡ又可促進(jìn)ROS生成，進(jìn)而活化相應(yīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，調(diào)控心肌細(xì)胞肥大及凋亡［4-5］。Nakagam等［6］用AngⅡ誘導(dǎo)新生鼠心肌細(xì)胞肥大，研究發(fā)現(xiàn)肥厚反應(yīng)由O2ˉ·介導(dǎo)，抗氧化劑能減輕氧化應(yīng)激，所有反應(yīng)可被血管緊張素Ⅱ1型受體（AT1R）阻斷劑所阻斷。提示AngⅡ與AT1R結(jié)合后，可激活NADPH氧化酶產(chǎn)生O2ˉ·。

Trx蛋白是機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)的主要部分，是維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)的第一線還原系統(tǒng)。其抗氧化作用表現(xiàn)在兩個(gè)方面［7］:①直接或作為某些過(guò)氧化物酶的電子供體清除氧自由基；②作為細(xì)胞內(nèi)硫基還原酶，還原多種蛋白質(zhì)的二硫鍵，使其恢復(fù)生理功能。Trx蛋白對(duì)細(xì)胞功能具有廣泛的調(diào)節(jié)作用，其中之一便是抑制心肌肥大，因此被認(rèn)為是治療心肌肥大的理想靶點(diǎn)。Yanfei Yang等［8］實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AngⅡ可上調(diào)Trx1，Trx1的高表達(dá)又上調(diào)了miR-98的轉(zhuǎn)錄，而miR-98能顯著抑制心肌肥大，說(shuō)明Trx蛋白能夠逆轉(zhuǎn)AngⅡ誘導(dǎo)的心肌肥大。在原發(fā)性高血壓患者中，GSH（谷胱甘肽過(guò)氧化物酶）系統(tǒng)無(wú)論在血漿還是單核細(xì)胞中均降低；相反Trx呈增高趨勢(shì)。Trx過(guò)度表達(dá)可削弱AngⅡ誘導(dǎo)超氧陰離子和H2O2產(chǎn)生，顯著減少Nox2（NADPH氧化酶胞膜相關(guān)亞單位）、p47 phox（Nox胞漿亞單位）和Rac（三磷酸鳥(niǎo)嘌呤核苷結(jié)合蛋白）的表達(dá)［9］。

本課題組前期研究結(jié)果表明，化痰活血益心方具有顯著降低壓力負(fù)荷性大鼠全心重量指數(shù)、左心室重量指數(shù)，說(shuō)明化痰活血益心方具有抗心肌肥厚的作用［10］。本次研究結(jié)果顯示，與模型對(duì)照組比較，中藥大、中、常規(guī)劑量組及卡托普利組均能顯著降低壓力負(fù)荷性大鼠心肌AngⅡ含量（P＜0.01），中藥大劑量組、卡托普利組降低AngⅡ的含量與中藥常規(guī)劑量、中劑量組比較，差異有顯著性意義（P＜0.01或P＜0.05）。中藥大劑量組與卡托普利組在降低AngⅡ含量方面差異無(wú)顯著性意義（P＞0.05）。說(shuō)明化痰活血益心方具有抗AngⅡ的作用，且與劑量有一定關(guān)系。模型對(duì)照組Trx蛋白表達(dá)低，中藥大、中、常規(guī)劑量組及卡托普利組Trx蛋白明顯增加（P＜0.01），大劑量組Trx蛋白表達(dá)高于中、常規(guī)劑量組（P＜0.01）。說(shuō)明化痰活血益心方能通過(guò)升高Trx及降低AngⅡ發(fā)揮抗氧化應(yīng)激損傷作用，從而抑制氧化應(yīng)激途徑引起的心肌肥大。化痰活血益心方抗氧化應(yīng)激損傷作用與劑量有一定關(guān)系，其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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（編輯陳明偉）

中圖分類(lèi)號(hào)：R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：2095-4441（2015）02-0006-03

收稿日期:2015-04-25

基金項(xiàng)目:廣西自然科學(xué)基金（編號(hào):2010GXNSFA013212）

作者簡(jiǎn)介:覃裕旺（1969-），副主任醫(yī)師，研究方向:中西醫(yī)結(jié)合防治心血管疾病的基礎(chǔ)與臨床研究

通信作者:朱智德